Microdisección en capas de valvas de válvula tricúspide para caracterización mecánica biaxial y cuantificación microestructural
Summary
Este protocolo describe la caracterización mecánica biaxial, la cuantificación del colágeno basada en imágenes de dominio de frecuencia espacial polarizada y la microdisección de las valvas de la válvula tricúspide. El método proporcionado aclara cómo las capas de folletos contribuyen a los comportamientos holísticos de los folletos.
Abstract
La válvula tricúspide (TV) regula el flujo unidireccional de sangre no oxigenada desde la aurícula derecha hasta el ventrículo derecho. El televisor consta de tres folletos, cada uno con comportamientos mecánicos únicos. Estas variaciones entre los tres folletos de TV se pueden entender mejor examinando sus cuatro capas anatómicas, que son la atrialis (A), la espongiosa (S), la fibrosa (F) y la ventricularis (V). Si bien estas capas están presentes en los tres folletos de TV, existen diferencias en sus espesores y constituyentes microestructurales que influyen aún más en sus respectivos comportamientos mecánicos.
Este protocolo incluye cuatro pasos para dilucidar las diferencias específicas de la capa: (i) caracterizar los comportamientos arquitectónicos mecánicos y de fibra de colágeno del folleto de TV intacto, (ii) separar las capas compuestas (A / S y F / V) del folleto de TV, (iii) llevar a cabo las mismas caracterizaciones para las capas compuestas, y (iv) realizar post-hoc evaluación histología. Este marco experimental permite de forma única la comparación directa del tejido tvnte intacto con cada una de sus capas compuestas. Como resultado, se puede recopilar información detallada sobre la microestructura y la función biomecánica de los folletos de TV con este protocolo. Dicha información se puede utilizar potencialmente para desarrollar modelos computacionales de TV que buscan proporcionar orientación para el tratamiento clínico de la enfermedad de TV.
Introduction
El televisor se encuentra entre la aurícula derecha y el ventrículo derecho del corazón. A lo largo del ciclo cardíaco, el televisor regula el flujo sanguíneo unidireccional a través de la apertura y el cierre cíclicos de la valva anterior de TV (TVAL), la valva posterior de TV (TVPL) y la valva septal de TV (TVSL). Estas valvas son complejas y tienen cuatro capas anatómicas distintas: la atrialis (A), la espongiosa (S), la fibrosa (F) y la ventricularis (V), con constituyentes microestructurales únicos. Las fibras de elastina en el atrialis y el ventricularis ayudan a restaurar el tejido a su geometría no deformada después de la carga mecánica1. Por el contrario, la fibrosa contiene una densa red de fibras de colágeno onduladas que contribuyen a la capacidad de carga de las valvas2. Compuesta principalmente de glicosaminoglicanos, la espongiosa ha sido hipotetizada para permitir el cizallamiento entre las capas de la valva durante la función de la válvula cardíaca3. Si bien los tres tipos de folíolos tienen las mismas capas anatómicas, hay variaciones en los espesores de las capas y las proporciones constituyentes que tienen implicaciones para los comportamientos mecánicos específicos de los folletos.
Los investigadores han explorado las propiedades de los folletos de TV utilizando caracterizaciones mecánicas planas, evaluaciones histomorfológicas y caracterizaciones ópticas de la arquitectura de la fibra de colágeno. Por ejemplo, las caracterizaciones mecánicas biaxiales planas buscan emular la carga fisiológica aplicando desplazamientos perpendiculares al tejido y registrando las fuerzas asociadas. Las observaciones resultantes de desplazamiento de fuerza (o estiramiento por estrés) han revelado que los tres folletos de TV exhiben comportamientos mecánicos no lineales, específicos de la dirección, con respuestas más aparentes específicas de la valva en la dirección del tejido radial 4,5,6. Se cree que estos comportamientos específicos de la valva se derivan de las diferencias en las propiedades microestructurales observadas utilizando técnicas histológicas estándar 6,7. Además, las imágenes de segunda generación armónica6, la dispersiónde luz de ángulo pequeño 8 y la imagen de dominio de frecuencia espacial polarizada7 (pSFDI) tienen como objetivo comprender estas propiedades microestructurales y han mostrado diferencias específicas en la orientación de la fibra de colágeno y el engarce de fibra que tienen implicaciones para los comportamientos mecánicos observados a nivel de tejido. Estos estudios han avanzado significativamente nuestra comprensión de la microestructura tisular y su papel en los comportamientos a nivel tisular. Sin embargo, queda mucho por abordar en la conexión experimental de la mecánica de tejidos y la microestructura subyacente.
Recientemente, este laboratorio realizó caracterizaciones mecánicas de las capas de folletos de TV separadas en dos capas compuestas (A/S y F/V) utilizando una técnica de microdisección9. Ese trabajo anterior destacó las diferencias en las propiedades mecánicas de las capas y ayudó a proporcionar información sobre cómo la microestructura en capas contribuye a los comportamientos mecánicos de los tejidos. Aunque esta investigación mejoró nuestra comprensión de la microestructura del folleto de TV, la técnica tenía varias limitaciones. En primer lugar, las propiedades de las capas compuestas no se compararon directamente con el tejido intacto, lo que llevó a una falta de comprensión completa de la relación mecánica-microestructura. En segundo lugar, no se examinó la arquitectura de la fibra de colágeno de las capas compuestas. En tercer lugar, solo se investigaron las capas del TVAL debido a las dificultades para recolectar las capas compuestas de los otros dos folletos de TV. El método descrito en este documento proporciona un marco de caracterización holística que supera estas limitaciones y proporciona caracterizaciones completas de los folletos de TV y sus capas compuestas.
Este artículo describe la técnica de microdisección que separa los tres folletos de TV en sus capas compuestas (A/S y F/V) para caracterizaciones mecánicas y microestructurales biaxiales 10,11,12. Este protocolo iterativo incluye (i) pruebas mecánicas biaxiales y caracterización pSFDI del folíolo intacto, (ii) una técnica de microdisección novedosa y reproducible para obtener de manera confiable las capas de TV compuestas, y (iii) pruebas mecánicas biaxiales y caracterización pSFDI de las capas de TV compuestas. El tejido fue expuesto a carga de tracción biaxial con varias relaciones de fuerza para pruebas mecánicas. Luego, se utilizó pSFDI para determinar la orientación y alineación de la fibra de colágeno en varias configuraciones cargadas. pSFDI conserva la arquitectura nativa de la fibra de colágeno, permite el análisis dependiente de la carga y evita la necesidad típica de fijar o limpiar el tejido para el análisis de la arquitectura de la fibra de colágeno, como en las imágenes de segunda generación armónica o la dispersión de luz de ángulo pequeño. Finalmente, los tejidos se prepararon utilizando técnicas histológicas estándar para visualizar la microestructura tisular. Este marco iterativo y holístico permite la comparación directa de las propiedades mecánicas y microestructurales del folleto de TV con sus capas compuestas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos para el protocolo incluyen: (i) la microdisección de la capa, (ii) el montaje del tejido, (iii) la colocación del marcador fiduciario y (iv) la configuración de pSFDI. La microdisección de capas apropiada es el aspecto más importante y difícil del método descrito en este documento. Antes de iniciar una investigación que utilice esta técnica, el disector (s) debe tener práctica a largo plazo con la técnica de microdisección y los tres folletos de televisión. El disector debe asegurarse de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG27760143) y la Presbyterian Health Foundation. KMC fue apoyado en parte por el Programa de Oportunidades de Investigación de Pregrado de la Universidad de Oklahoma (OU) y el Programa de Aprendizaje de Investigación de Honores. DWL fue apoyado en parte por la Beca de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias (GRF 2019254233) y la Beca Predoctoral de la Asociación Americana del Corazón / Fundación del Corazón de los Niños (Premio # 821298). Todo este apoyo es agradecido.
Materials
| 10% Formalin Solution, Neutral Buffered | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| Alconox Detergent | Alconox | cleaning compound | |
| BioTester – Biaxial Tester | CellScale Biomaterials Testing | 1.5 N Load Cell Capacity | |
| Cutting Mat | Dahle | B0027RS8DU | |
| Deionized Water | N/A | ||
| Fine-Tipped Tool | HTI INSTRUMENTS | NSPLS-12 | |
| Forceps – Curved | Scientific Labwares | 16122 | |
| Forceps – Thick | Scientific Labwares | 161001078 | |
| Forceps – Thin | Scientific Labwares | 16127 | |
| LabJoy | CellScale Biomaterials Testing | Version 10.66 | |
| Laser Displacement Sensor | Keyence | IL-030 | |
| Liquid Cyanoacrylate Glue | Loctite | 2436365 | |
| MATLAB | MathWorks | Version 2020a | |
| Micro Scissors | HTI Instruments | CAS55C | |
| Pipette | Belmaks | 360758081051Y4 | |
| Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device | N/A | Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details. |
|
| Scalpel | THINKPRICE | TP-SCALPEL-3010 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) | VWR International | H3515541105024 | |
| Surgical Pen | LabAider | LAB-Skin-6 | |
| T-Pins | Business Source | BSN32351 | |
| Wax Board | N/A | Made in-house using modeling wax and baking tray | |
| Weigh Boat | Pure Ponta | mdo-azoc-1030 |
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