이축 기계적 특성화 및 미세 구조 정량화를 위한 Tricuspid 밸브 전단지의 층 미세 해부
Summary
이 프로토콜은 이축 기계적 특성화, 편광 공간 주파수 영역 이미징 기반 콜라겐 정량화 및 트리쿠스피드 밸브 전단지의 미세 해부를 설명합니다. 제공된 방법은 전단지 레이어가 전체 론적 전단지 동작에 어떻게 기여하는지 설명합니다.
Abstract
트리쿠스피드 밸브 (TV)는 우심방에서 우심실로 산소가 공급되지 않은 혈액의 단방향 흐름을 조절합니다. TV는 세 개의 전단지로 구성되어 있으며 각 전단지는 독특한 기계적 동작을 가지고 있습니다. 세 개의 TV 전단지 사이의 이러한 변형은 심방 (A), 해면첩 (S), 섬유사 (F) 및 심실 (V) 인 네 개의 해부학 적 층을 조사함으로써 더 잘 이해할 수 있습니다. 이 층들은 세 개의 TV 전단지에 모두 존재하지만, 각각의 기계적 거동에 더 많은 영향을 미치는 두께와 미세 구조 구성 요소에는 차이가 있습니다.
이 프로토콜에는 층별 차이점을 설명하는 네 가지 단계가 포함되어 있습니다 : (i) 손상되지 않은 TV 전단지의 기계적 및 콜라겐 섬유 건축 거동을 특성화하고, (ii) TV 전단지의 복합 층 (A / S 및 F / V)을 분리하고, (iii) 복합 레이어에 대해 동일한 특성화를 수행하고, (iv) 사후 촬영을 수행합니다. 조직학 평가. 이 실험 프레임 워크는 고유하게 손상되지 않은 TV 조직을 각각의 복합 층과 직접 비교할 수있게합니다. 결과적으로, TV 전단지의 미세 구조 및 생체 역학 기능에 관한 자세한 정보는이 프로토콜을 통해 수집 될 수 있습니다. 이러한 정보는 잠재적으로 TV 질환의 임상 치료를 위한 지침을 제공하고자 하는 TV 계산 모델을 개발하는 데 사용될 수 있다.
Introduction
TV는 심장의 우심방과 우심실 사이에 있습니다. 심장 주기 전반에 걸쳐 TV는 TV 전단지 (TVAL), TV 후부 전단지 (TVPL) 및 TV 중격 전단지 (TVSL)의 순환 개폐를 통해 단방향 혈류를 조절합니다. 이 전단지는 복잡하며 심방 (A), 해면질 (S), 섬유사 (F) 및 심실 (V)의 네 가지 해부학 적 층을 가지고 있으며 독특한 미세 구조 구성 요소가 있습니다. 심방과 심실의 엘라스틴 섬유는 기계적 하중 후 변형되지 않은 기하학으로 조직을 복원하는 데 도움이됩니다1. 대조적으로, 섬유사는 전단지2의 하중 지지 능력에 기여하는 물결 모양의 콜라겐 섬유의 조밀 한 네트워크를 함유한다. 주로 글리코사미노글리칸으로 구성된 스폰지오사는 심장 판막 기능3 동안 전단지층 사이의 전단을 가능하게 하는 가설을 세웠다. 세 가지 전단지 유형 모두 해부학 적 층이 동일하지만 층의 두께와 구성 비율에 차이가 있으며 전단지 별 기계적 행동에 영향을 미칩니다.
연구자들은 평면 기계적 특성화, 조직 형태 학적 평가 및 콜라겐 섬유 아키텍처의 광학 특성화를 사용하여 TV 전단지의 특성을 탐구했습니다. 예를 들어, 평면 이축 기계적 특성화는 조직에 수직 변위를 적용하고 관련 힘을 기록함으로써 생리적 하중을 에뮬레이트하는 것을 추구한다. 그 결과 힘-변위(또는 응력-스트레치) 관찰에 따르면 세 개의 TV 전단지 모두 방사형 조직 방향 4,5,6에서 보다 명백한 전단지 특이적 반응과 함께 비선형, 방향별 기계적 거동을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 이러한 전단지-특이적 거동은 표준 조직학적 기술6,7을 사용하여 관찰된 미세구조적 특성의 차이로부터 기인하는 것으로 여겨진다. 또한, 초고조파 생성 이미징6, 소각 광 산란8, 및 편광 공간 주파수 영역 이미징7 (pSFDI)은 이러한 미세 구조적 특성을 이해하는 것을 목표로하며 관찰 된 조직 수준의 기계적 거동에 영향을 미치는 콜라겐 섬유 배향 및 섬유 크림프의 전단지 특이적 차이를 보여주었습니다. 이 연구는 조직 미세 구조에 대한 우리의 이해와 조직 수준의 행동에서의 역할을 상당히 향상 시켰습니다. 그러나 조직 역학과 기본 미세 구조를 실험적으로 연결하는 데있어 해결해야 할 사항이 많이 남아 있습니다.
최근에이 실험실은 미세 해부 기술9를 사용하여 두 개의 복합 층 (A / S 및 F / V)으로 분리 된 TV 전단지 층의 기계적 특성화를 수행했습니다. 그 이전의 연구는 층의 기계적 특성의 차이를 강조하고 층상 미세 구조가 조직 기계적 거동에 어떻게 기여하는지에 대한 통찰력을 제공하는 데 도움이되었습니다. 이 조사는 TV 전단지 미세 구조에 대한 우리의 이해를 향상 시켰지만이 기술에는 몇 가지 한계가있었습니다. 첫째, 복합 층의 특성은 손상되지 않은 조직과 직접 비교되지 않았으며, 이는 역학 – 미세 구조 관계에 대한 완전한 이해의 부족으로 이어졌다. 둘째, 복합층의 콜라겐 섬유 구조는 조사되지 않았다. 셋째, 다른 두 TV 전단지에서 복합 층을 수집하는 데 어려움이 있기 때문에 TVAL의 층 만 조사되었습니다. 본원에 기술된 방법은 이러한 한계를 극복하고 TV 전단지 및 이들의 복합 층의 완전한 특성화를 제공하는 전체론적 특성화 프레임워크를 제공한다.
이 백서에서는 이축 기계 및 미세 구조 특성10,11,12를 위해 세 개의 TV 전단지를 복합 층 (A / S 및 F / V)으로 분리하는 미세 해부 기술을 설명합니다. 이러한 반복적 프로토콜은 (i) 무손상 전단지의 이축 기계적 테스트 및 pSFDI 특성화, (ii) 복합 TV 층을 신뢰성 있게 획득하기 위한 신규하고 재현 가능한 미세 해부 기술, 및 (iii) 복합 TV 층의 이축 기계적 테스트 및 pSFDI 특성화를 포함한다. 조직을 기계적 시험을 위해 다양한 힘 비율로 이축 인장 하중에 노출시켰다. 이어서, pSFDI를 사용하여 다양한 로딩된 구성에서 콜라겐 섬유 배향 및 정렬을 결정하였다. pSFDI는 천연 콜라겐 섬유 아키텍처를 보존하고, 부하 의존적 분석을 허용하며, 초고조파 생성 이미징 또는 소각 광산란과 같은 콜라겐 섬유 아키텍처 분석을 위해 조직을 고정하거나 맑게 해야 하는 일반적인 필요성을 회피합니다. 마지막으로, 조직은 조직 미세조직을 시각화하기 위해 표준 조직학 기술을 사용하여 준비되었다. 이 반복적이고 전체적인 프레임 워크는 TV 전단지의 기계적 및 미세 구조적 특성을 복합 층과 직접 비교할 수있게합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜에 대한 중요한 단계는 (i) 층 미세 해부, (ii) 조직 장착, (iii) 신탁 마커 배치, 및 (iv) pSFDI 셋업을 포함한다. 적절한 층 미세해부는 본원에 기재된 방법의 가장 중요하고 어려운 측면이다. 이 기술을 활용한 조사를 시작하기 전에, 해체(들)는 미세 해부 기술과 세 개의 TV 전단지를 모두 사용하여 장기적인 연습을 해야 한다. 디스섹터는 복합 층 시편이 충분히 크고 (>3.3mm) 균일 한 두께를 갖도…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 미국 심장 협회 과학자 개발 보조금 (16SDG27760143)과 장로교 건강 재단의 지원을 받았다. KMC는 오클라호마 대학 (OU) 학부 연구 기회 프로그램 및 명예 연구 견습 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었습니다. DWL은 National Science Foundation Graduate Research Fellowship (GRF 2019254233)과 American Heart Association/Children’s Heart Foundation Predoctoral Fellowship (Award #821298)의 지원을 받았습니다. 이 모든 지원은 감사하게 인정됩니다.
Materials
| 10% Formalin Solution, Neutral Buffered | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| Alconox Detergent | Alconox | cleaning compound | |
| BioTester – Biaxial Tester | CellScale Biomaterials Testing | 1.5 N Load Cell Capacity | |
| Cutting Mat | Dahle | B0027RS8DU | |
| Deionized Water | N/A | ||
| Fine-Tipped Tool | HTI INSTRUMENTS | NSPLS-12 | |
| Forceps – Curved | Scientific Labwares | 16122 | |
| Forceps – Thick | Scientific Labwares | 161001078 | |
| Forceps – Thin | Scientific Labwares | 16127 | |
| LabJoy | CellScale Biomaterials Testing | Version 10.66 | |
| Laser Displacement Sensor | Keyence | IL-030 | |
| Liquid Cyanoacrylate Glue | Loctite | 2436365 | |
| MATLAB | MathWorks | Version 2020a | |
| Micro Scissors | HTI Instruments | CAS55C | |
| Pipette | Belmaks | 360758081051Y4 | |
| Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device | N/A | Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details. |
|
| Scalpel | THINKPRICE | TP-SCALPEL-3010 | |
| Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) | VWR International | H3515541105024 | |
| Surgical Pen | LabAider | LAB-Skin-6 | |
| T-Pins | Business Source | BSN32351 | |
| Wax Board | N/A | Made in-house using modeling wax and baking tray | |
| Weigh Boat | Pure Ponta | mdo-azoc-1030 |
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