Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Lagmikrodissektion af tricuspidventilblade til biaksial mekanisk karakterisering og mikrostrukturel kvantificering

Published: February 10, 2022 doi: 10.3791/63522
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Biomechanics and Biomaterials Design Laboratory (BBDL), School of Aerospace and Mechanical Engineering, The University of Oklahoma, 2Institute for Biomedical Engineering, Science and Technology (IBEST), The University of Oklahoma

Summary

Denne protokol beskriver den biaksiale mekaniske karakterisering, polariseret rumlig frekvensdomæne billeddannelsesbaseret kollagenkvantificering og mikrodissektion af tricuspidventilblade. Den medfølgende metode belyser, hvordan folderlagene bidrager til den holistiske folderadfærd.

Abstract

Tricuspidventilen (TV) regulerer den ensrettede strøm af uoxygeneret blod fra højre atrium til højre ventrikel. Tv'et består af tre foldere, hver med unik mekanisk adfærd. Disse variationer blandt de tre tv-foldere kan forstås yderligere ved at undersøge deres fire anatomiske lag, som er atrialis (A), spongiosa (S), fibrosa (F) og ventricularis (V). Mens disse lag er til stede i alle tre tv-foldere, er der forskelle i deres tykkelser og mikrostrukturelle bestanddele, der yderligere påvirker deres respektive mekaniske adfærd.

Denne protokol indeholder fire trin til at belyse de lagspecifikke forskelle: (i) karakterisere den intakte tv-folderes mekaniske og kollagenfiberarkitektoniske adfærd, (ii) adskille de sammensatte lag (A / S og F / V) i tv-brochuren, (iii) udføre de samme karakteriseringer for de sammensatte lag og (iv) udføre post-hoc histologisk vurdering. Denne eksperimentelle ramme muliggør unikt direkte sammenligning af det intakte tv-væv med hvert af dets sammensatte lag. Som følge heraf kan detaljerede oplysninger om tv-brochurernes mikrostruktur og biomekaniske funktion indsamles med denne protokol. Sådanne oplysninger kan potentielt bruges til at udvikle tv-beregningsmodeller, der søger at give vejledning til den kliniske behandling af tv-sygdom.

Introduction

Tv'et er placeret mellem højre atrium og højre hjertekammer. Gennem hele hjertecyklussen regulerer tv'et den ensrettede blodgennemstrømning via cyklisk åbning og lukning af tv'ets forreste folder (TVAL), tv'ets bageste folder (TVPL) og tv-septalfolderen (TVSL). Disse foldere er komplekse og har fire forskellige anatomiske lag - atrialis (A), spongiosa (S), fibrosa (F) og ventricularis (V) - med unikke mikrostrukturelle bestanddele. Elastinfibrene i atrialis og ventricularis hjælper med at genoprette vævet til dets uformede geometri efter mekanisk belastning1. I modsætning hertil indeholder fibrosa et tæt netværk af bølgede kollagenfibre, der bidrager til brochurernes bæreevne2. Hovedsageligt bestående af glycosaminoglycaner er spongiosa blevet antaget for at muliggøre klipning mellem folderlag under hjerteventilfunktion3. Mens alle tre brochuretyper har de samme anatomiske lag, er der variationer i lagenes tykkelser og bestanddele, der har konsekvenser for folderspecifik mekanisk adfærd.

Forskere har undersøgt egenskaberne af tv-folderne ved hjælp af plane mekaniske karakteriseringer, histomorfologiske vurderinger og optiske karakteriseringer af kollagenfiberarkitekturen. For eksempel søger plane biaksiale mekaniske karakteriseringer at efterligne fysiologisk belastning ved at anvende vinkelrette forskydninger på vævet og registrere de tilknyttede kræfter. De resulterende kraftforskydningsobservationer (eller spændingsstrækninger) har afsløret, at alle tre tv-foldere udviser ikke-lineær, retningsspecifik mekanisk adfærd med mere tydelige folderspecifikke reaktioner i radial vævsretning 4,5,6. Disse folderspecifikke adfærd menes at stamme fra forskelle i de mikrostrukturelle egenskaber observeret ved hjælp af standard histologiske teknikker 6,7. Endvidere sigter anden harmonisk generations billeddannelse6, lillevinkellysspredning8 og polariseret rumlig frekvensdomænebilleddannelse7 (pSFDI) mod at forstå disse mikrostrukturelle egenskaber og har vist brochurespecifikke forskelle i kollagenfiberorientering og fiberkrympning, der har konsekvenser for den observerede mekaniske adfærd på vævsniveau. Disse undersøgelser har signifikant avanceret vores forståelse af vævsmikrostrukturen og dens rolle i vævsniveauadfærd. Der er dog stadig meget, der skal løses ved eksperimentelt at forbinde vævsmekanikken og den underliggende mikrostruktur.

For nylig udførte dette laboratorium mekaniske karakteriseringer af tv-folderlagene adskilt i to sammensatte lag (A / S og F / V) ved hjælp af en mikrodissektionsteknik9. Det tidligere arbejde fremhævede forskelle i lagenes mekaniske egenskaber og hjalp med at give indsigt i, hvordan den lagdelte mikrostruktur bidrager til vævets mekaniske adfærd. Selvom denne undersøgelse forbedrede vores forståelse af tv-brochurens mikrostruktur, havde teknikken flere begrænsninger. For det første blev egenskaberne af de sammensatte lag ikke direkte sammenlignet med det intakte væv, hvilket førte til en mangel på fuldstændig forståelse af forholdet mellem mekanik og mikrostruktur. For det andet blev kollagenfiberarkitekturen af de sammensatte lag ikke undersøgt. For det tredje blev kun LAGENE I TVAL undersøgt på grund af vanskeligheder med at indsamle de sammensatte lag fra de to andre tv-foldere. Metoden beskrevet heri giver en holistisk karakteriseringsramme, der overvinder disse begrænsninger og giver komplette karakteriseringer af tv-folderne og deres sammensatte lag.

Dette papir beskriver mikrodissektionsteknikken, der adskiller de tre tv-foldere i deres sammensatte lag (A / S og F / V) til biaxiale mekaniske og mikrostrukturelle karakteriseringer 10,11,12. Denne iterative protokol inkluderer (i) biaksial mekanisk test og pSFDI-karakterisering af den intakte folder, (ii) en ny og reproducerbar mikrodissektionsteknik til pålidelig opnåelse af de sammensatte tv-lag og (iii) biaksial mekanisk test og pSFDI-karakterisering af de sammensatte tv-lag. Vævet blev udsat for biaksial trækbelastning med forskellige kraftforhold til mekanisk test. Derefter blev pSFDI brugt til at bestemme kollagenfiberorientering og justering ved forskellige belastede konfigurationer. pSFDI bevarer den oprindelige kollagenfiberarkitektur, tillader belastningsafhængig analyse og omgår det typiske behov for at fiksere eller rydde væv til kollagenfiberarkitekturanalyse, såsom i anden harmonisk generations billeddannelse eller lillevinkellysspredning. Endelig blev vævene fremstillet ved hjælp af standard histologi teknikker til at visualisere vævsmikrostrukturen. Denne iterative og holistiske ramme giver mulighed for direkte sammenligning af tv-brochurens mekaniske og mikrostrukturelle egenskaber med dets sammensatte lag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet heri blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Oklahoma. Animalsk væv blev erhvervet fra et USDA-godkendt slagteri.

1. Biaksial mekanisk karakterisering

  1. Væv forberedelse
    1. Hent en tv-folder fra fryseren, barberblade, en kirurgisk pen, pincet, en pipette med deioniseret (DI) vand og en skæremåtte. Optø tv-brochuren ved hjælp af 2-3 dråber DI-vand ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: DI-vand anvendes i stedet for fosfatbufferet saltvand (PBS) for at undgå PBS-inducerede vanskeligheder for lagmikrodisseringen.
    2. Læg prøven fladt på skæremåtten med ventricularislaget (dvs. overfladen med chordae-indsættelserne) opad. Placer prøven, så den radiale retning flugter med Y-retningen, og omkredsens retning flugter med X-retningen.
      BEMÆRK: Omkredsens retning er orienteret langs ventilens omkreds.
    3. Undersøg chordae indsættelsesstederne af vævet. Bestem et område, ideelt set ~ 12 x 12 mm, med den mindste mængde store chordae-indsættelser, mens du undgår ekstremt tynde (dvs. gennemsigtige) områder (figur 1).
    4. Vend prøven om, så atrieoverfladen (dvs. overfladen uden chordae-indsættelser) vender opad. Sørg for, at de perifere og radiale folderretninger forbliver på linje med henholdsvis X- og Y-akserne.
    5. En firkantet prøve på 12 x 12 mm skæres ud af foldervævet, så man undgår de store chordae-indsættelser eller tynde områder, der er identificeret i trin 1.1.3. Fjern de trimmede dele af brochurevævet med pincetten og læg dem i en affaldsbeholder.
      1. Hvis det ikke er muligt helt at undgå store chordae-indsættelser, skal du skære vævene, så de er langs kanten af den firkantede prøve. Det er vigtigt at undgå indsættelser af chordae, da det hjælper med at forhindre problemer for den senere mikrodissektion.
    6. Brug en kirurgisk pen til at placere en lille prik i øverste højre hjørne for at spore prøvens orientering. Lad blækket tørre i ca. 30 s.
    7. Vend prøven med den ventrikulære overflade (dvs. overfladen med chordale indsættelser) opad. Trim chordal vedhæftede filer på bagsiden af vævet ved at strække chordae fra brochuren og bruge et barberblad til at skære nær dets indsættelsessted. Vend prøven igen, så atrieoverfladen (dvs. den glatte overflade) vender opad.
  2. Måling af tykkelse
    1. Hent en ikke-kontakt-laserforskydningssensor. Nulstilling af forskydningssensoren på en flad sektion af skæremåtten nær det trimmede væv.
      FORSIGTIG: Lad ikke laseren skinne direkte ind i øjnene.
    2. Placer laseren over det centrale område af prøven. Fjern luft, der er fanget under indlægssedlens overflade, da det kan forårsage målefejl. For at frigive fanget luft skal du enten bruge pincet til at skubbe boblen til kanten af vævet eller løfte et hjørne af vævet.
    3. Optag tykkelsen vist på forskydningssensorens display. Gentag yderligere to målinger på andre steder i prøven.
    4. Beregn den gennemsnitlige brochuretykkelse ved hjælp af de tre målinger, der er registreret i det foregående trin. Brug denne værdi, når du opretter de biaksialmekaniske karakteriseringsprotokoller.
  3. Opsætning af biaksial tester og vævsmontering
    1. Forbered et DI-vandbad ved 37 °C i overensstemmelse med testsystemets retningslinjer for at sikre temperaturen under in vivo fysiologiske forhold.
    2. Hent tang, vævsprøven, monteringshardware, et fint tippet værktøj, flydende cyanoacrylatlim og sortmalede glasperler (diameter: 300-500 μm).
      BEMÆRK: Monteringshardware inkluderer tænderne, monteringsbroen og monteringsgummiet.
    3. Monter vævsprøven på testsystemet. Sørg for, at vævets omkredsretning flugter med X-retningen, som kan hjælpes af den prik, der tidligere er placeret i trin 1.1.6.
      BEMÆRK: De tænder, der bruges her, skal være jævnt fordelt over hele vævets kantlængde. Den effektive kantlængde er indstillet til 10 mm for det intakte væv og >3,3 mm for kompositlagene.
  4. Fiducial markør placering
    1. Identificer den centrale en tredjedel kvadratiske region af det monterede væv. Brug de omtrentlige hjørner af dette område til fiducial markørplacering.
    2. Placer glasperler i en åben vejebåd, og lav en lille pool af flydende cyanoacrylatlim i en separat vejebåd. Overtræk toppen af det fint tippede værktøj med en lille mængde lim. Dup overskydende lim på siden af vejebåden.
    3. Opret et hjørne af det centrale en tredjedel firkantede array ved forsigtigt at trykke den limbelagte spids på vævet. Brug pincet til at tage fat i en glasperle og læg den forsigtigt oven på limpunktet. Brug kameraet på den biaksiale testenhed til hjælp med perleplaceringen.
    4. Gentag trin 1.4.2 og 1.4.3 for yderligere tre perler, indtil det firkantede array er fuldført. Sørg for, at perlerne er sikkert fastgjort, og at deres respektive limprikker ikke rører eller klæber sammen. Tør limen, inden vævet sænkes ned i vandbadet.
      1. Hvis perlerne sidder fast sammen, skal du vente på, at limen tørrer, og brug derefter tangen til forsigtigt at gribe fat i perlen eller limen og trække den af vævet.
        BEMÆRK: Limen og perlen (e) skal komme af, så perleplaceringen kan prøves igen.
  5. Forkonditionering
    1. Opret en kraftkontrolleret prækonditioneringsprotokol, hvor vævet med kantlængde og tykkelse gennemgår seks gentagelser af ækvibuksial belastning til en topmembranspænding T-top på 40 N / m med en forspænding på 3% × T-top10 og stræknings- og genopretningstider på 30 s hver.
      1. Opret en vilkårlig testmappe, der midlertidigt gemmer dataene til fremtidige beregninger. Indstil belastningshastigheden til 4,42 N/m.
      2. Konstruer et nyt testparametersæt med navnet Preconditioning0. Indstil kontroltilstandene X-akse og Y-akse til at tvinge, og indstil kontrolfunktionerne til trin. Definer belastningsstørrelsen til at være den kraft, der er forbundet med T-top, dvs. fpeak = Tpeak · L. Definer forspændingsstørrelsen som 3% af f-toppen kun for den første gentagelse, og definer både strækningsvarigheden og restitutionsvarigheden som 30 s. Definer antallet af gentagelser som 10.
        BEMÆRK: Den beregnede top første Piola-Kirchhoff-stress, dvs. P-top = T-top / t, kan overstige 200 kPa for tyndere væv, hvilket kan resultere i vævsrivning under test. I disse scenarier blev topmembranspændingen justeret til en maksimal første Piola-Kirchhoff-belastning på 200 kPa.
    2. Udfør forkonditioneringsprotokollen. Efter prækonditionering registreres prøvens aktuelle X- og Y-dimensioner til brug i de biaksiale testprotokoller.
  6. Oprettelse og udførelse af biaxiale testprotokoller
    1. Bestem den tid, der kræves for at opnå den maksimale ækvibitaksiale konfiguration fra den postkonditionerede konfiguration med den ønskede forskydningshastighed. I betragtning af en konstant forskydningshastighed beregnes indlæsningstiderne for de resterende belastningsforhold (dvs. TXX: TYY = 1: 0.5 og TXX: TYY = 0.5: 1).
    2. Kør manuelt de lineære aktuatorer for at matche målkræfterne for et givet belastningsforhold. Gentag denne proces, og registrer indlægssedlens dimensioner for alle belastningsforhold.
    3. Der udarbejdes en forskydningskontrolleret testprotokol, der biaksialt fortrænger vævet fra den postkonditionerede konfiguration til de konfigurationer, der er registreret i trin 1.6.2 (dvs. TXX:TYY = 1:1, 1:0.5, 0.5:1) inden for de tidspunkter, der er bestemt i trin 1.6.1. Sørg for, at hver protokol har tre på- og aflæsningscyklusser for repeterbarhed af den mekaniske opførsel.
      1. Konstruer en testmappe, der gemmer dataene til fremtidige beregninger. Sørg for, at katalognavnet matcher det aktuelle eksempel.
      2. Konstruer et nyt testparametersæt med navnet 1:1, indstil kontroltilstandene X-akse og Y-akse til forskydning, og indstil kontrolfunktionerne til rampe. Strækstørrelsen defineres som den konfiguration, der er registreret i trin 1.6.1. Definer forudindlæsningsstørrelsen som 3 % af f-toppen for kun den første gentagelse, og definer både strækningsvarigheden og restitutionsvarigheden som den tid, der er registreret i trin 1.6.1. Definer antallet af gentagelser som 3.
      3. Trin 1.6.3.2 gentages for de resterende belastningsforhold (dvs. TXX:TYY = 1:0.5 og TXX:TYY = 0,5:1), bortset fra at forudbelastningsstørrelsen defineres som ikke anvendt. Sørg for, at strækningens størrelse, strækningsvarigheden og restitutionsvarigheden svarer til dem, der er registreret i trin 1.6.2.
        BEMÆRK: Kun data fra den sidste (tredje) cyklus vil blive brugt til stress- og belastningsanalyser.
    4. Udfør de forskydningskontrollerede protokoller. Efter afslutningen af biaksial test returneres vævet til dets postkonditionerede dimensioner.
      BEMÆRK: Testen skal straks afbrydes, hvis vævet begynder at rive.
  7. Yderligere karakteriseringer
    1. Lad vævet være nedsænket i DI-vand og monteret på det biaksiale testsystem. PSFDI-billeddannelse udføres som beskrevet i trin 2.1-2.3.
    2. Afmonter vævet. Hvis det er et intakt væv, fortsættes til mikrodissektion beskrevet i trin 3.1-3.7. Hvis ikke, indsamles histologi efter trin 3.7.
      BEMÆRK: DI-vandbadet kan bruges til efterfølgende karakteriseringer inden for samme dag.
    3. Trin 1.2-1.7 gentages med A/S- og F/V-lagene, der er erhvervet efter mikrodisseringen (trin 3.1-3.6).
      BEMÆRK: Gentagelsen af testprotokollen for lagene giver mulighed for direkte sammenligning af det intakte væv med dets egne lag.
  8. Procedurer for biaksial test af efterbehandling af data
    1. Udfør digital billedkorrelation af de erhvervede biaksiale testbilleder for at bestemme de tidsafhængige markørpositioner. Beregn de fiduciale markørforskydninger via Eq (1). 5
      Equation 6 (1)
      Heri er xi(t), Xi og di(t) den tidsafhængige placering, den oprindelige (reference)placering og forskydningen af markør i.
    2. Beregn deformationsgradienten F ved at betragte de fiduciale markører som et fire-node bilinært endeligt element, som vist i Eq (2)5
      Equation 1 (2)
      Hvor BXi og BYi er derivaterne af formfunktionerne for node i henholdsvis X- og Y-retningen, og ui(t) og vi(t) er komponenterne i d i(t): di(t) = [ui(t), vi(t)]T.
    3. Beregn den anvendte første Piola-Kirchhoff-belastning P ved hjælp af de registrerede kræfter, som i Eq (3)5
      Equation 3 (3)
      PXX og PYY er X- og Y-komponenterne i P; L og t er vævets kantlængde og tykkelse; fX og fY er de kræfter, der registreres i X- og Y-retningerne.
    4. Bestem andre belastnings- og spændingsmål efter behov,13 som omfatter den højre Cauchy-Green deformation C = FT/F, Green-Lagrange-stammen E = (C - I)/2, Cauchy-σ = J-1PFT og den anden Piola-Kirchhoff-belastning S = F-1P.
      BEMÆRK: Heri er jeg en andenordens identitets tensor, og J = det (F) er jakobianeren af deformationsgradienten F.

2. Polariseret rumlig frekvensdomænebilleddannelse

  1. System forberedelse
    BEMÆRK: Hvis det ønskes, kan fiducialmarkørerne fjernes fra vævet inden følgende trin.
    1. Centrer pSFDI-enheden over prøven (figur 2). Tænd projektoren og belys prøven med 490 nm (cyan) lys.
    2. Åbn kamerasoftwaren, og undersøg kameraets synsfelt. Sørg for, at prøven er centreret i rammen og er helt indeholdt i synsfeltet.
    3. Hvis den monterede prøve er en intakt folder, skal du justere projektorens lysstyrke for digital lysbehandling (DLP) for at sikre, at vævet er fuldt oplyst uden blændinger på vævsoverfladen. Juster ikke lysstyrken, hvis prøven er et af de sammensatte lag.
    4. Drej polarisatoren over hele bevægelsesområdet for at registrere mulige blændinger eller snavs på polarisatorlinsen. Rengør polarisatorlinsen forsigtigt med en mikrofiberklud efter behov.
  2. Dataindsamling
    BEMÆRK: Følgende dataindsamling kan automatiseres ved hjælp af software, såsom LabVIEW eller Python.
    1. Flyt polarisatoren til sin hjemmeposition - ideelt justeret med en af de biaksiale testakser. Tag et gråtonebillede, og gem det på computeren med polarisatorplaceringen (dvs. 0°).
    2. Drej polarisatoren 5°, og tag endnu et gråtonebillede. Gentag denne proces for at få 37 billeder, der spænder fra 0 ° til 180 ° med en stigning på 5 °.
      BEMÆRK: Billederne fra den første pSFDI-billeddannelsessekvens kan foreløbigt analyseres for at sikre den ønskede optiske respons fra vævet. Se trin 2.3 for instruktioner.
    3. Gentag pSFDI-billeddannelsessekvensen for andre ønskede vævskonfigurationer, for eksempel topkonfigurationerne af de belastningsprotokoller, der overvejes til biaksial mekanisk test.
  3. Procedurer for efterbehandling af pSFDI-data
    BEMÆRK: Følgende metode indeholder trin til MATLAB-programsproget. Ethvert foretrukket sprog (f.eks. Python, C++) kan dog bruges i stedet.
    1. Brug funktionen MATLAB imread() til at konstruere arrays, der indeholder de pixelvise intensiteter af de 37 erhvervede billeder. For nemheds skyld skal du arrangere disse som en n × m × 37 tredimensionelt array, hvor n og m er antallet af pixels langs de to akser.
    2. Definer vævsområdet af interesse (ROI) ved hjælp af den brugerdefinerede grabit () -funktion.
    3. Tilpas intensitet vs. polarisatorvinkeldata for hver ROI-pixel ved hjælp af en 3-term Fourier-serie, som i Eq (4):
      Equation 4 (4)
      Heri er I(θ) den pixelvise intensitet som funktion af polarisatorvinklen, og bi er Fourier-konstanterne. Brug standard lineær mindste kvadraters regression til at bestemme bi.
    4. Bestem den pixelvise fiberorientering som polarisatorvinklen forbundet med den maksimale værdi af I (θ). Beregn graden af optisk anisotropi (DOA) via Eq (5).
      Equation 5 (5)
    5. Brug plot () og histogram () til at visualisere den erhvervede fiberorientering og DOA-værdier. Gem de behandlede resultater til senere brug.

3. Mikrodissering af tricuspid ventilbrochure kompositlag

  1. Vævsfastgørelse til voksplade
    1. Saml de nødvendige materialer: voksbræt, DI-vand, pipette, skalpel, mikrosaks, tynde tang, buede tang, tykke tang og stifter.
      BEMÆRK: Brug kun pincet uden tænder eller greb, da tang af denne type meget let kan rive det tynde væv i A/S-laget, når du udfører dissektionen.
    2. Afmonter vævet fra den biaksiale tester, og mål dets tykkelse ved hjælp af laserforskydningssensoren beskrevet i trin 1.2. Placer vævet på voksbrættet.
    3. Undersøg ventricularis-siden af vævet for store chordae-indsættelser. Bemærk placeringen af disse indsættelser for at undgå dem under dissektionen (supplerende figur S1). Tag et billede til reference.
    4. Spred vævet fladt på voksbrættet med atrialis opad. Fastgør vævet på brættet ved hjælp af stifterne:
      1. I hvert hjørne af vævet skal du placere en stift, der er vinklet væk fra vævet (for bedre visning) og trækker vævet stramt (figur 3A). Gør dette med eller mod uret. Sørg for, at stifterne er uden for hullerne skabt af tænderne, når vævet monteres.
      2. Juster pinplaceringen lidt for at sikre, at vævet er stramt og i en firkantet konfiguration (figur 3B), så vævet ligger fladt og ikke skifter under lagets mikrodissektion.
      3. Placer om nødvendigt stifter langs siden af vævet under dissektionen for at strække vævet mere. Husk, når du placerer og fisker ekstra stifter, at de skal arbejdes rundt under dissektionen.
      4. Fjern glasperlen fiducial markører.
        BEMÆRK: Følgende trin er valgfrit. Det tilsatte DI-vand hjælper med at opretholde vævshydrering og forhindrer vævet i at klæbe til sig selv gennem mikrodissektion.
      5. Brug en pipette til at placere DI-vand på overfladen af vævet, så det helt dækker vævet på en boblelignende måde. Genopfyld DI-vandet efter behov under hele dissektionen.
  2. Lav det indledende hjørne.
    1. Vælg et hjørne af den fastgjorte prøve for at starte dissektionen. Undgå store chordae indsættelser og ekstremt tynde områder.
    2. Lav et snit i A/S-laget ved let at trække skalpellen over vævsoverfladen langs monteringshullerne fra mekanisk test (figur 3C). Sørg for, at snittet er mindst 5 mm langt, og at snittets kanter begynder at trække fra hinanden og afslører F/V-laget nedenunder.
    3. Brug den tynde tang (uden en skarp spids) til at gnide fast langs snittet og trække kanterne af snittet fra hinanden (supplerende figur S2).
      1. Hvis snittet i A/S-laget ikke begynder at trække fra hinanden, skal du let spore det samme snit igen med skalpellen, indtil det begynder at gøre dette. Pas på ikke at skære for dybt i vævet (forbi A/S kompositlaget), da det gør det vanskeligere at adskille lagene rent.
    4. Trin 3.2 og 3.2.3 gentages for at foretage endnu et snit vinkelret på det første snit (figur 3D). Sørg for, at de to snit er forbundet og danner et hjørne.
      1. Hvis de to snit ikke er forbundet, skal du køre den tynde pincet under det lille vævsområde, der adskiller de to snit (supplerende figur S3). Brug derefter forsigtigt saksen til at skære vævet.
  3. Skræl vævet fra hjørnet.
    1. Gnid langs snittene ved hjælp af de tynde tang, indtil vævet begynder at adskille sig fra F / V-laget. Så snart et lille stykke væv er adskilt, skal du gribe det med pincetten og forsigtigt trække det for yderligere at adskille kompositlagene.
      BEMÆRK: Placer altid spidsen af den tynde pincet forbi kanten af vævet, når du griber fat. Ellers kunne de ved et uheld stikke et hul i A/S kompositlaget.
    2. Fortsæt med at skrælle vævet og gnid sømmen, indtil den når slutningen af de to snit, der er lavet til hjørnet. I løbet af denne proces skal du skifte til større pincet for at gribe fat i vævet til skrælningsprocessen for at forhindre uønsket rivning og rivning af A / S-kompositlaget.
      1. Hvis det første hjørneforsøg har store problemer med adskillelse, skal du prøve et andet hjørne som udgangspunkt (gå tilbage til trin 3.2).
  4. Udvid snit, skræl vævet og lav et andet hjørne.
    1. Forlæng de to snit, der er lavet til det første hjørne, ved at placere skalpelspidsen i bunden af hvert snit og trække det let langs vævsoverfladen (figur 4A). Sørg for, at alle forlængelsesskæringer er mindst 5 mm, og at de udskårne forlængelser forbindes til de originale snit og fortsætter med at følge tand- eller suturhullerne.
      BEMÆRK: Hvis forlængelsesskæringen er for dyb, skal den kommende skrælning overvåges nøje for at sikre, at dele af fibrosa ikke adskilles med A / S-kompositlaget (figur 5A).
    2. Fortsæt med at forlænge snittene og skræl det øverste kompositlag tilbage, mens du gnider sømmen, indtil den ene side er færdig. Bemærk, at vævet vil blive adskilt fuldstændigt langs et snit; sørg for, at sømmen mellem A/S- og F/V-kompositlagene er lige (figur 4B).
    3. Gentag instruktionerne i trin 3.2 og trin 3.3 for at oprette et andet hjørne vinkelret på enden af den fuldt skrællede side (figur 4C).
  5. Adskil A/S-laget fuldstændigt.
    1. Forlæng de resterende snit, mens du undgår store chordae-indsættelser. Fortsæt med at adskille A / S- og F / V-lagene ved hjælp af de gnidnings- og trækteknikker, der anvendes til det første hjørne. Noter flere overvejelser eller problemer, der kan opstå under denne proces:
      1. Ekskluder kun chordae-indsættelserne fra A/S-separationsområdet (figur 5B), når denne udelukkelse giver mulighed for et A/S-eksemplar, der er stort nok til eksperimentelle karakteriseringer (>3,3 mm).
      2. Hvis vævet rives eller der dannes et hul, skal du straks stoppe med at adskille vævet. For at forhindre pincet i at blive fanget, skal du placere saksen i ethvert hul, der dannes, og skære vævet væk fra midten. Hvis defekten dannes langs adskillelsessømmen, skal du begynde at adskille vævet langs en anden kant for at forhindre yderligere rivning (figur 5C).
      3. Se efter mellemlagsforbindelser, der kan forekomme under adskillelse af vævet og forhindre yderligere adskillelse af vævet uden stor risiko for at rive (figur 5D). Overhold, at disse er tynde, men stærke tråde, der skal skæres omhyggeligt ved hjælp af en saks. Undgå at skabe et hul i A/S-laget eller skære nedad i F/V-laget, da dette ville medføre ujævn adskillelse.
      4. Fortsæt denne proces, indtil den størst mulige prøve af A/S-laget er blevet adskilt. Marker prøvens orientering ved hjælp af den kirurgiske pen (figur 6A).
  6. Afslut dissektion.
    1. Brug saksen til at skære langs adskillelsessømmen for den resterende vævskant (figur 6B). Sørg for, at dette snit er så tæt på adskillelsessømmen som muligt.
    2. Placer det adskilte A/S kompositlag fladt på skæremåtten. Brug om nødvendigt skalpellen til at rette vævets kanter og skabe en firkantet vævsform, der er egnet til biaksial mekanisk test. Læg A/S-laget i DI-vand, indtil det er klar til at blive testet.
    3. Marker orienteringen af det F / V-lag, der forbliver på vokspladen. Skær den størst mulige firkant ud af det område, hvor A/S-laget blev fjernet (figur 6C), og læg det derefter i DI-vand.
  7. Histologi
    1. Skær to strimler væv - justeret med de perifere og radiale retninger - til brug i histologi. Brug forskellige protokoller til de intakte og sammensatte lag (dvs. A / S og F / V).
      1. For det intakte lag skal du tage prøverne fra vævet, der forbliver fastgjort til voksbrættet. Brug vævet uden for tine/suturhullerne, da denne del af vævet ikke er blevet dissekeret og vil repræsentere den intakte folder.
      2. For A/S- og F/V-kompositlagene indsamles kun histologiprøver efter fuld afslutning af deres test og billeddannelse. Afmonter prøven fra det biaksiale testsystem, læg vævet fladt på en skæremåtte, og skær de perifere og radiale strimler ud ved hjælp af et barberblad.
    2. Anbring de udskårne strimler i vævskassetter, og nedsænk kassetterne i 10% formalin.
    3. Kassér det resterende væv. Rengør dissektionsværktøjerne ved hjælp af rengøringsforbindelse (se materialetabellen).
    4. Efter 24-48 timers fiksering overføres kassetterne til ethanol, hvor de kan opbevares på ubestemt tid indtil histologibehandling og farvning.
      BEMÆRK: Denne histologiske analyse kan bekræfte, at mikrodissektion er vellykket. FORSIGTIG: 10% formalin forårsager hudirritation og alvorlig øjenskade. Det kan også forårsage en allergisk reaktion eller kræft ved indånding. Ved håndtering skal du bære passende personligt beskyttelsesudstyr, såsom handsker, beskyttelsesbriller og en kittel, og brug kun i godt ventilerede rum, såsom i en røghætte. Når den ikke er i brug, skal du sørge for, at opbevaringsbeholderen er tæt lukket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikrodisseringen vil give A/S- og F/V-prøver med relativt ensartede tykkelser, der kan monteres på en (kommerciel) biaksial testanordning. Histologisk analyse af den intakte folder og de to dissekerede lag vil kontrollere, om vævet var korrekt adskilt langs grænsen mellem spongiosa og fibrosa (figur 7). Derudover kan histologimikrograferne bruges til at bestemme vævslagtykkelserne og bestanddelene af massefraktioner ved hjælp af ImageJ-software. En mislykket dissektion opstår, når den producerer en A / S-prøve, der er for lille til montering på den biaksiale tester. Dette sker oftest, når A/S'et river under peeling, eller når der opstår et hul i F/V-laget på grund af tykke chordae.

Den forskydningskontrollerede mekaniske test og efterbehandling producerer stressbelastningsdata, der beskriver vævets ikke-lineære mekaniske opførsel (figur 8). Prøverne er generelt anisotrope, hvor den perifere vævsretning har en stivere mekanisk respons end den radiale vævsretning (tabel 1). Disse egenskaber med lav trækstyrke og høj trækstyrke kan bestemmes kvantitativt ved hjælp af yderligere analyseteknikker 6,14. Kollektiv vurdering af rækkevidden af biaksiale kraftforhold giver yderligere indsigt i vævets retningskobling (dvs. X-aksekraften afhænger af Y-aksekraften og omvendt). Det er vigtigt at bemærke, at den mekaniske opførsel af en vævsretning i disse forskellige kraftforhold kan vise kompressionsdeformationer under ikke-quibiaksiale deformationer. Denne unikke adfærd opstår typisk på grund af stærkt justerede kollagenfibre langs trykvævsretningen.

pSFDI-dataene giver farvekort over kollagenfiberorienteringen og DOA (figur 9). Specifikt giver disse farvekort en omfattende forståelse af kollagenfiberarkitekturen på tværs af hele vævsprøven. En unik fordel ved den ikke-destruktive pSFDI-teknik er evnen til at sammenligne resultaterne på tværs af forskellige belastningskonfigurationer og forstå, hvordan kollagenfibrene omorienterer og afkriber / justeres for at understøtte den påførte belastning. Disse resultater er suboptimale, hvis det projicerede lys er for stærkt eller mørkt under billeddannelse, hvis det projicerede lys ikke holdes konsistent på tværs af den intakte folder og dens lag, hvis der er store bobler eller snavs på prøven, hvis der er for meget lim på vævet fra fiducial markørplacering, eller hvis vandbadets niveau bliver for lavt og skaber præcise lyspunkter. Alle fører til unøjagtige repræsentationer af de reflekterede intensitet versus polarisatorvinkeldata, som forstyrrer den bestemte fiberorientering og beregnede DOA.

Figure 1
Figur 1: Valg af mikrodissektionsområde. (A) Identifikation af problematiske områder, der skal undgås, og (B) målområde for lagets mikrodissektion. Skala bar = 10 mm (A, B). Forkortelser: Rad. = radial; Circ. = omkreds. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: pSFDI-systemet integreret med den biaksiale testanordning. Nøglekomponenter på begge enheder er mærket. Forkortelser: pSFDI = polariseret rumlig frekvensdomænebilleddannelse7; DLP = digital lysbehandling. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Initiering af indlægssedlens mikrodissering. (A) Strækning af vævet stramt, mens stifter placeres, (B) det fastgjorte væv klar til mikrodissektion, (C) at foretage det første snit i A / S-kompositlaget og (D) at skabe det første hjørne af snit i A / S-kompositlaget. Skalabjælker = 10 mm. Forkortelser: Rad. = radial; Circ. = omkreds; A/S = atrialis/spongiosa. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Adskillelse af A/S-kompositlaget. (A) Udvidelse af snittene i A/S-kompositlaget, (B) adskillelse af A/S-kompositlaget via omhyggelig afskalning og (C) oprettelse af det andet hjørne. Skalabjælke = 10 mm. Forkortelser: Rad. = radial; Circ. = omkreds; A/S = atrialis/spongiosa. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Potentielle problemer under indlægssedlens mikrodissering. (A) Mislykket adskillelse af A/S- og F/V-kompositlagene, (B) justering af mikrodissektionsområdet for at undgå indsættelse af chordae, (C) oprettelse af en ny separationssøm på grund af uønsket hul og (D) mellemlagsforbindelse, der forbinder A/S- og F/V-kompositlagene. Vægtstænger = 5 mm (A-C), 10 mm (D). Forkortelser: Rad. = radial; Circ. = omkreds; A/S = atrialis/spongiosa; F/V = fibrosa/ventricularis. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Afslutning af mikrodisseringen. (A) Betegnelse af øverste højre hjørne for orientering, (B) adskillelse af A/S ved hjælp af saks og (C) hentning af F/V-kompositlaget med retning markeret. Skalabjælke = 10 mm Forkortelser: Rad. = radial; Circ. = omkreds; A/S = atrialis/spongiosa; F/V = fibrosa/ventricularis. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Histologisk vurdering. Mikrografer, der viser omkredstværsnit af (A) intakte folder og (B) korrekt adskilte A/S- og F/V-lag. Skalastænger = 50 μm. Forkortelser: atrialis/spongiosa; F/V = fibrosa/ventricularis; VIC = valvulær interstitiel celle. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Repræsentative biaxiale mekaniske testresultater for det ækvibitaksielle belastningsforhold. Membranspænding versus strækdata for (A) tricuspidventil forreste folder, (B) tricuspidventil bageste folder og (C) tricuspidventil septal folder. Forkortelser: atrialis/spongiosa; F/V = fibrosa/ventricularis. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Repræsentative pSFDI-resultater. (A) Råbillede af indlægssedlen under pSFDI-vurdering, (B) kvantificeret fiberorientering vist via farvekortet og (C) kvantificeret grad af optisk anisotropi, vist via farvekortet, der angiver fiberjusteringen. Pilene angiver regioner med overskydende lim fra fiducialmarkørerne. Den øverste række viser gode billeder, mens den nederste række viser dårlige billeder. Skalabjælker = 4 mm. Forkortelser: deg. = grader; DOA = grad af optisk anisotropi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Sammensat lag λcirc λrad
A/S 1,26 ± 0,05 1.37 ± 0,05
F/V 1.17 ± 0,03 1.32 ± 0.08

Tabel 1: Gennemsnitlige sammensatte lagstrækninger. De gennemsnitlige topstrækninger af de sammensatte lag, der viser de forventede variationer i den mekaniske adfærd. Denne tabel er udtrukket fra 9. Forkortelser: atrialis/spongiosa; F/V = fibrosa/ventricularis.

Supplerende figur S1: Identifikation af områder, der skal undgås under mikrodissektion. (A) Undersøgelse af vævsprøvens ventrikulære side for indsættelse af chordae, (B) sporing, hvor vanskelige områder er, når væv placeres med atrialis opad, og (C) planlægning af indledende snit for at undgå identificerede områder. Skalabjælke = 10 mm. Forkortelser: Rad. = radial; Circ. = omkreds. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Demonstration af gnidning langs snit. (A) Snittet før gnidning med stump pincet og (B) kanter af snittet, der adskiller sig mere efter gnidning. Skalabjælke = 10 mm. Forkortelser: Rad. = radial; Circ. = omkreds. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Ikke-forbindende snit. Pincet bruges til at identificere det tynde område af væv, der adskiller de to snit, inden vævet forsigtigt skæres med en saks. Skalabjælke = 10 mm. Forkortelser: Rad. = radial; Circ. = omkreds. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trin for protokollen inkluderer: (i) lagmikrodissektion, (ii) vævsmontering, (iii) fiducial markørplacering og (iv) pSFDI-opsætningen. Passende lagmikrodissektion er det vigtigste og sværeste aspekt af metoden beskrevet heri. Før der iværksættes en undersøgelse ved hjælp af denne teknik, skal dissector (e) have langvarig praksis med mikrodissektionsteknikken og alle tre tv-foldere. Dissectoren skal sikre, at kompositlagprøverne er tilstrækkeligt store (>3,3 mm) og har en ensartet tykkelse. Histologi bør bruges til at bekræfte, at dissektioner konsekvent har nøjagtig lagseparation.

Til vævsmontering skal vævet fastgøres til den biaksiale tester, således at vævet er fladt uden kunstig strækning eller rynker. Disse fejl vil resultere i unøjagtige mekaniske data. De sammensatte lag er mere tilbøjelige til disse fejl på grund af deres tyndere natur. Ved anbringelse af fiducialmarkørerne er det afgørende, at markørerne placeres inden for det centrale en tredjedel af vævet og ikke klæber til hinanden. Uhensigtsmæssig markørplacering vil resultere i unøjagtig kvantificering af vævsstrækningerne. Endelig skal den pSFDI-projicerede lysstyrke vælges omhyggeligt og forblive uændret for det intakte væv og de sammensatte lag. Hvis lysstyrken ændres, kan pSFDI-resultaterne ikke sammenlignes mellem det intakte væv og dets sammensatte lag.

Fleksibiliteten i den heri beskrevne metode ligger primært i den biaksiale mekaniske karakterisering, mens det meste af fejlfindingen opstår under den pSFDI-baserede kollagenmikrostrukturelle kvantificering. De forskydningsstyrede testprotokoller giver to vigtige fordele i forhold til alternative kraftstyrede testprotokoller: (i) spændingsstrækkurverne er glattere uden svingninger, og (ii) forskydningshastigheden (mm/s) og belastningshastigheden (%/s) kan styres direkte i stedet for belastningshastigheden (N/m). Det er dog stadig bydende nødvendigt at udføre kraftkontrolleret prækonditionering forud for den mekaniske karakterisering for at opnå repeterbare kraftforskydningskurver og bestemme vævskonfigurationen, der giver ækvibitaksielle spændinger. Når den ækvibitaksielle konfiguration er bestemt, kan de andre ønskede belastningsforhold (f.eks. TXX: TYY = 1: 0,5 og TXX: TYY = 0,5: 1) bestemmes ved manuelt at jogge de lineære aktuatorer. Dette giver mulighed for meget nøjagtig replikering af målbiaksialspændingerne med de ekstra fordele ved et forskydningskontrolleret skema. Desuden kan denne alsidige mekaniske testprotokol justeres for at overveje flere belastningsforhold eller andre unikke belastningsforhold, såsom ren forskydning eller spændingsafslapning. Yderligere pSFDI-kvantificering kan inkluderes i disse nye protokoller eller på forskellige punkter langs belastningsstierne. Før du udfører disse pSFDI-karakteriseringer, er det utroligt vigtigt at sikre, at der ikke er blændinger, bobler eller snavs på vævet. Ofte skal man teste forskellige retninger af polarisatoren, væskehøjden på PBS-badet eller metoder til at forhindre / fjerne snavs og bobler for at sikre en vellykket og nøjagtig pSFDI-kvantificering.

Der er tre hovedbegrænsninger af lagmikrodissering. For det første kan det intakte væv kun adskilles i to sammensatte lag, hvilket betyder, at alle de fire anatomiske lag ikke kan isoleres individuelt. Dette skyldes, at vævet er for tyndt til at forsøge at adskille alle fire anatomiske lag, og manglen på strukturelle komponenter i spongiosa udelukker dets mikrodissicering. For det andet bruger denne protokol DI-vand i stedet for PBS. Mens PBS er tættere på det fysiologiske miljø15, resulterede brugen af PBS under test i konsekvente, mislykkede dissektioner på grund af hyppig rivning af det sammensatte A / S-lag. Brugen af DI-vand øgede straks dissektionernes lethed og succes ved at reducere sandsynligheden for huller og rifter i det sammensatte A/S-lag betydeligt. For det tredje, selvom den eksperimentelle protokol er designet til at give matchede data mellem de intakte og sammensatte lag, er der mærkbare prøve-til-prøve-variationer i de mekaniske og mikrostrukturelle egenskaber (tabel 1). Denne variabilitet kan i nogen grad forvirre dataanalysen; vores erfaring9 og omfattende undersøgelser fra litteraturen 4,5,16,17 viser imidlertid, at det falder inden for de typiske tricuspidventil mekaniske karakteriseringsresultater.

Den fremlagte protokol er vigtig af tre hovedårsager. For det første er dette den eneste protokol, der med succes adskiller lagene i alle tre tv-foldere. For det andet giver strukturen i denne protokol mulighed for direkte sammenligning af de mekaniske og kollagenfiber arkitektoniske egenskaber af en intakt tv-folder med dens sammensatte lag. For det tredje tillader dette unikke pSFDI-system kvantificering og visualisering af de belastningsafhængige ændringer i kollagenfiberarkitekturen.

Denne lagdissektionsmetode kan påføres yderligere væv med lagdelt morfologi, såsom øjet eller huden. Den kombinerede mekanisk-strukturelle karakteriseringsramme kan også anvendes til væv med etablerede lagadskillelsesprocedurer, såsom de resterende hjerteventiler, arterier eller spiserørvæv 18,19,20. Mens mekanisk test har en etableret rolle i forståelsen af biologiske vævs mekaniske egenskaber, er pSFDI en meget nyere udvikling, der endnu ikke er fuldt ud realiseret inden for blødt vævsbiomekanik. Denne protokol giver en ny metode til at syntetisere disse teknikker til biologiske væv og give yderligere indsigt i væv-mikrostrukturforholdet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG27760143) og Presbyterian Health Foundation. KMC blev delvist støttet af University of Oklahoma (OU) Undergraduate Research Opportunity Program og Honors Research Apprenticeship Program. DWL blev delvist støttet af National Science Foundation Graduate Research Fellowship (GRF 2019254233) og American Heart Association / Children's Heart Foundation Predoctoral Fellowship (Award #821298). Al denne støtte anerkendes taknemmeligt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Formalin Solution, Neutral Buffered Sigma-Aldrich HT501128-4L
Alconox Detergent Alconox cleaning compound
BioTester - Biaxial Tester CellScale Biomaterials Testing 1.5 N Load Cell Capacity
Cutting Mat Dahle B0027RS8DU
Deionized Water N/A
Fine-Tipped Tool HTI INSTRUMENTS NSPLS-12
Forceps - Curved Scientific Labwares 16122
Forceps - Thick Scientific Labwares 161001078
Forceps - Thin Scientific Labwares 16127
LabJoy CellScale Biomaterials Testing Version 10.66
Laser Displacement Sensor Keyence IL-030
Liquid Cyanoacrylate Glue Loctite 2436365
MATLAB MathWorks Version 2020a
Micro Scissors HTI Instruments CAS55C
Pipette Belmaks 360758081051Y4
Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device N/A Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera.
See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details.
Scalpel THINKPRICE TP-SCALPEL-3010
Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) VWR International H3515541105024
Surgical Pen LabAider LAB-Skin-6
T-Pins Business Source BSN32351
Wax Board N/A Made in-house using modeling wax and baking tray
Weigh Boat Pure Ponta mdo-azoc-1030

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vesely, I. The role of elastin in aortic valve mechanics. Journal of Biomechanics. 31 (2), 115-123 (1998).
  2. Zhang, W., Ayoub, S., Liao, J., Sacks, M. S. A meso-scale layer-specific structural constitutive model of the mitral heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 32, 238-255 (2016).
  3. Stella, J. A., Sacks, M. S. On the biaxial mechanical properties of the layers of the aortic valve leaflet. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (5), 757-766 (2007).
  4. Khoiy, K. A., Amini, R. On the biaxial mechanical response of porcine tricuspid valve leaflets. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (10), 104504 (2016).
  5. Jett, S. V., et al. An investigation of the anisotropic mechanical properties and anatomical structure of porcine atrioventricular heart valves. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 87, 155-171 (2018).
  6. Meador, W. D., et al. A detailed mechanical and microstructural analysis of ovine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 102, 100-113 (2020).
  7. Hudson, L. T., et al. A pilot study on linking tissue mechanics with load-dependent collagen microstructures in porcine tricuspid valve leaflets. Bioengineering. 7 (2), 60 (2020).
  8. Pant, A. D., et al. Pressure-induced microstructural changes in porcine tricuspid valve leaflets. Acta Biomaterialia. 67, 248-258 (2018).
  9. Kramer, K. E., et al. An investigation of layer-specific tissue biomechanics of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Acta Biomaterialia. 96, 368-384 (2019).
  10. Ross, C. J., Laurence, D. W., Wu, Y., Lee, C. -H. Biaxial mechanical characterizations of atrioventricular heart valves. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59170 (2019).
  11. Goth, W., Lesicko, J., Sacks, M. S., Tunnell, J. W. Optical-based analysis of soft tissue structures. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 357-385 (2016).
  12. Jett, S. V., et al. Integration of polarized spatial frequency domain imaging (pSFDI) with a biaxial mechanical testing system for quantification of load-dependent collagen architecture in soft collagenous tissues. Acta Biomaterialia. 102, 149-168 (2020).
  13. Reddy, J. N. An Introduction to Continuum Mechanics. , Cambridge University Press. (2013).
  14. Duginski, G. A., Ross, C. J., Laurence, D. W., Johns, C. H., Lee, C. -H. An investigation of the effect of freezing storage on the biaxial mechanical properties of excised porcine tricuspid valve anterior leaflets. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103438 (2020).
  15. Salinas, S. D., Clark, M. M., Amini, R. Mechanical response changes in porcine tricuspid valve anterior leaflet under osmotic-induced swelling. Bioengineering. 6 (3), 70 (2019).
  16. Pokutta-Paskaleva, A., Sulejmani, F., DelRocini, M., Sun, W. Comparative mechanical, morphological, and microstructural characterization of porcine mitral and tricuspid leaflets and chordae tendineae. Acta Biomaterialia. 85, 241-252 (2019).
  17. Ross, C. J., et al. An investigation of the glycosaminoglycan contribution to biaxial mechanical behaviors of porcine atrioventricular heart valve leaflets. Journal of the Royal Society Interface. 16 (156), 0069 (2019).
  18. Sommer, G., Regitnig, P., Költringer, L., Holzapfel, G. A. Biaxial mechanical properties of intact and layer-dissected human carotid arteries at physiological and supraphysiological loadings. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (3), 898-912 (2009).
  19. Holzapfel, G. A., Sommer, G., Gasser, C., Regitnig, P. Determination of the layer-specific mechanical properties ofhuman coronary arteries with intimal thickening, and related constitutive modelling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (5), 2048-2058 (2005).
  20. Sommer, G., et al. Multiaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).

Tags

Bioteknologi udgave 180
Lagmikrodissektion af tricuspidventilblade til biaksial mekanisk karakterisering og mikrostrukturel kvantificering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Casey, K. M., Laurence, D. W., Tang, … More

Casey, K. M., Laurence, D. W., Tang, M., Lee, C. H. Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification. J. Vis. Exp. (180), e63522, doi:10.3791/63522 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter