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Biology

प्राथमिक माउस रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम कोशिकाओं का अलगाव

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63543
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,3
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine, 3Oral Biology and Diagnostic Sciences, Dental College of Georgia, Augusta University

ERRATUM NOTICE

Summary

यह पांडुलिपि चरणबद्ध तरीके से माउस आंखों से रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई) कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक सरलीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। प्रोटोकॉल में माउस आंखों के एन्यूक्लिएशन और विच्छेदन शामिल हैं, इसके बाद आरपीई कोशिकाओं के अलगाव, बोने और संवर्धन शामिल हैं।

Abstract

रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई) परत फोटोरिसेप्टर्स के ठीक पीछे स्थित है और एक जटिल चयापचय प्रणाली को आश्रय देती है जो फोटोरिसेप्टर्स के कार्य को बनाए रखने में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। इस प्रकार, सामान्य दृष्टि को बनाए रखने के लिए आरपीई संरचना और कार्य आवश्यक हैं। यह पांडुलिपि प्राथमिक माउस आरपीई सेल अलगाव के लिए एक स्थापित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है। आरपीई अलगाव ओकुलर विकारों के विभिन्न माउस मॉडल में आरपीई पैथोलॉजी अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच करने के लिए एक महान उपकरण है। इसके अलावा, आरपीई अलगाव जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से अलग प्राथमिक माउस आरपीई कोशिकाओं की तुलना करने में मदद कर सकता है, साथ ही दवाओं का परीक्षण कर सकता है जो दृश्य विकारों के लिए चिकित्सा के विकास में तेजी ला सकते हैं। पांडुलिपि एक चरण-दर-चरण आरपीई अलगाव प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है; पूरी प्रक्रिया, एन्यूक्लिएशन से लेकर बोने तक, लगभग 4 घंटे लगती है। मीडिया को बोने के बाद 5-7 दिनों के लिए नहीं बदला जाना चाहिए, ताकि बिना किसी गड़बड़ी के पृथक कोशिकाओं के विकास की अनुमति मिल सके। इस प्रक्रिया के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से कोशिकाओं में आकृति विज्ञान, रंजकता और विशिष्ट मार्करों की विशेषता होती है। कोशिकाओं को अधिकतम तीन या चार बार पारित किया जा सकता है।

Introduction

रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई) कोशिकाएं कोरॉइड और तंत्रिका रेटिना के बीच स्थित होती हैं, जो घनाकार कोशिकाओं का एक साधारण मोनोलेयर बनाती हैं जो फोटोरिसेप्टर (पीआर) कोशिकाओं के पीछे स्थित होती हैं1. आरपीई पीआर कोशिकाओं के लिए एक स्वस्थ वातावरण बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, मुख्य रूप से प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के अत्यधिक संचय को कम करके और परिणामस्वरूप ऑक्सीडेटिव क्षति1. आरपीई कोशिकाएं रेटिनोइड्स के रूपांतरण और भंडारण, बिखरे हुए प्रकाश, तरल पदार्थ और आयन परिवहन के अवशोषण और शेड पीआर बाहरी खंड झिल्ली 2,3 के फागोसाइटोसिस जैसे कई कार्यों की देखरेख करती हैं। फ़ंक्शन) में परिवर्तन रेटिनोपैथी के लिए अग्रणी उनके कार्य को खराब कर सकते हैं और यह कई ओकुलर विकारों द्वारा साझा की गई एक सामान्य विशेषता है4. कई ओकुलर रोग आरपीई कोशिकाओं की आकृति विज्ञान और कार्य में परिवर्तन से जुड़े होते हैं, जिनमें कुछ आनुवंशिक रोग जैसे रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा, लेबर जन्मजात अमौरोसिस और अल्बिनिज्म 4,5,6, साथ ही उम्र से संबंधित ओकुलर विकार जैसे मधुमेह रेटिनोपैथी (डीआर) और उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) 7,8 शामिल हैं। . मानव कोशिकाएं सबसे वांछनीय हैं, इस प्रकार आरपीई मोनोलेयर बनाने के लिए प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं में आरपीई विकारों का अध्ययन करना आदर्श होगा। हालांकि, नैतिक मामलों और मानव दाताओं की सीमित उपलब्धता इस तथ्य के कारण है कि इनमें से अधिकांश विकार रुग्णता9 का कारण बनते हैं, लेकिन जरूरी नहीं कि मृत्यु दर10 हो, जिससे प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं के अलगाव को रोका जा सके। यह अमानवीय पशु दाताओं से आरपीई कोशिकाओं को संवर्धन एक पसंदीदा विकल्प बनाता है। कृन्तकों, विशेष रूप से चूहों, विभिन्न ओकुलर रोगों का अध्ययन करने के लिए एक महान मॉडल माना जाता है क्योंकि ट्रांसजेनिक तकनीक इन प्रजातियों में अधिक व्यापक रूप से स्थापित है11. भले ही सुसंस्कृत प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं का उपयोग कई फायदे प्रदान करता है, लेकिन कई मार्गों के लिए बढ़ती कोशिकाओं को बनाए रखना, या कोशिकाओं को संग्रहीत करना और पुन: उपयोग करना मुश्किल रहा है। इस प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा चूहों की उम्र है; आरपीई अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहों को बहुत कम उम्र का होना चाहिए (18-21 दिन पुराना इष्टतम है) क्योंकि वयस्क चूहों11,12,13 से आरपीई कोशिकाओं को संस्कृति करना मुश्किल है। आरपीई कोशिकाओं को किसी भी उम्र में माउस आंखों से अलग किया जा सकता है, हालांकि चार सेल मार्ग केवल युवा चूहों (18-21 दिन पुराने) के साथ सफल थे। आरपीई कोशिकाओं में एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टेट रिसेप्टर्स (एनएमडीएआर) के विलोपन के साथ सी 57 बीएल 6 चूहों और ट्रांसजेनिक चूहों दोनों का उपयोग करके माउस रेटिना से आरपीई अलगाव, एएमडी14 के विकास और प्रगति पर ऊंचा एमिनो एसिड होमोसिस्टीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया गया था। इसके अलावा, पृथक प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं ने आरपीई कोशिकाओं14 में एनएमडीएआर के निषेध द्वारा एएमडी के लिए एक चिकित्सीय लक्ष्य का प्रस्ताव करने में मदद की। कुछ एनएमडीएआर ब्लॉकर्स हैं जो खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित हैं और वर्तमान में अल्जाइमर रोग (एडी) से संबंधित मध्यम से गंभीर भ्रम (मनोभ्रंश) के इलाज के लिए उपयोग किए जाते हैं, जैसे कि मेमेंटाइन16, जो एएमडी14 के लिए एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य हो सकता है। इसके अलावा, पृथक प्राथमिक माउस आरपीई कोशिकाओं का उपयोग भड़काऊ मार्करों का पता लगाने और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस (सीबीएस) का उपयोग करके एएमडी और एडी की होमोसिस्टीन-प्रेरित विशेषताओं के लिए एक अंतर्निहित तंत्र के रूप में सूजन के प्रस्तावित प्रेरण के लिए किया गया था, जो होमोसिस्टीन16,17 का उच्च स्तर प्रस्तुत करता है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग जंगली प्रकार सी 57 बीएल / 6 चूहों और ट्रांसजेनिक चूहों दोनों से आरपीई कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया गया था, जो आसानी से लागू और विश्वसनीय प्रोटोकॉल तक पहुंचने के लिए अन्य प्रकाशित अलगाव प्रोटोकॉल13,18,19 के सरलीकृत अनुकूलन के रूप में हमारी प्रयोगशाला में विकसित हुए थे। इस प्रोटोकॉल में कोई सेक्स वरीयता नहीं है। जबकि चूहों की उम्र अलगाव प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है, युवा, वृद्ध चूहों (18-21 दिन) और किसी भी उम्र में पुराने चूहों (12 महीने तक) का उपयोग आरपीई अलगाव के लिए किया गया था। हालांकि, हमने देखा कि युवा आयु वर्ग के चूहों से अलग आरपीई कोशिकाएं लंबे समय तक जीवित रहती थीं, और चार मार्ग तक प्रदर्शन किया जा सकता था। पुराने चूहों से पृथक आरपीई कोशिकाओं को एक या दो बार पारित किया जा सकता है, फिर वे सामान्य दर से बढ़ना बंद कर देंगे और अपने आकार को अधिक लम्बी (फाइब्रोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं) में बदल देंगे। पिग्मेंटेशन का नुकसान और टिशू कल्चर प्लेट में आसंजन में कमी के बाद टुकड़ी भी देखी गई।

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Protocol

ओकलैंड विश्वविद्यालय आईएसीयूसी पशु प्रोटोकॉल संख्या 21063 के दिशानिर्देशों और नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए एआरवीओ स्टेटमेंट के दिशानिर्देशों के अनुसार जानवरों का उपयोग किया गया था।

1. समाधान की तैयारी

  1. पोषक तत्व मिश्रण एफ -12 (डीएमईएम / एफ 12) को 25% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1.5% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.02% जेंटामाइसिन के साथ पूरक करके पूर्ण आरपीई सेल संस्कृति मीडिया तैयार करें।
  2. कोलेजनेज स्टॉक समाधान के 127 μL और हाइलूरोनिडेज़ स्टॉक समाधान के 132 μL के साथ हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 741 μL को पूरक करके एंजाइम ए तैयार करें। यह 1 एमएल की अंतिम मात्रा बनाता है, जो चार आंखों का इलाज कर सकता है।
    1. एचबीएसएस के 41 एमएल (19.5 इकाइयों / एमएल) में क्लोस्ट्रीडियम हिस्टोलिटिकम से 1 मिलीग्राम कोलेजनेज को भंग करके कोलेजनेज स्टॉक समाधान तैयार करें।
    2. एचबीएसएस (38 इकाइयों / एमएल) के 18.4 एमएल में गोजातीय वृषण से 1 मिलीग्राम हाइलूरोनिडेस को भंग करके हाइलूरोनिडेस स्टॉक समाधान तैयार करें।
  3. एचबीएसएस के तीन भागों में 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के दो भागों को जोड़कर एंजाइम बी तैयार करें। ध्यान दें कि कुल मात्रा विच्छेदित आंखों की संख्या पर निर्भर है; एंजाइम बी के 1 एमएल का उपयोग चार आंखों के इलाज के लिए किया जा सकता है।

2. एन्यूक्लिएशन

  1. नैतिक रूप से आईएसीयूसी मानकों21 के अनुसार कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) साँस लेना का उपयोग करके माउस को इच्छामृत्यु दें।
    1. संक्षेप में, सीओ 2 कक्ष में जानवर (ओं) जगह सीओ2 के साथ प्रति मिनट चैंबर मात्राका 30% -70% की भरने की दर के साथ 100% सीओ 2 पेश करने के लिए2 से 3 मिनट के भीतर बेहोशी प्राप्त करने के लिए, चूहों के लिए न्यूनतम संकट के साथ।
    2. मृत्यु की पुष्टि करें (श्वसन की कमी और फीका आंखों का रंग), फिर पिंजरे से माउस को निष्फल सर्जिकल उपकरणों से लैस एक साफ निष्फल सर्जिकल क्षेत्र (अल्कोहल से साफ़) में ले जाएं।
  2. एक बाँझ अंडरपैड पर माउस रखें।
  3. प्रोप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए कक्षीय क्षेत्र पर 5/45 शैली के चिमटी दबाकर आंखों को एन्यूक्लिएट करें, इसके बाद चिमटी को आंख के पीछे ले जाएं। आंखों को कक्षीय गुहा से धीरे-धीरे खींचकर, ऑप्टिक तंत्रिका बरकरार रखने के साथ आंखों को निकालें।
  4. संदंश का उपयोग करके, 5% पोविडोन-आयोडीन के 1 एमएल युक्त 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में आंखों को डुबोएं। 2-3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर आंखों सेते हैं।
  5. पोविडोन-आयोडीन समाधान से आंखों को निकालें और उन्हें पेट्री डिश में रखें। एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करके, एचबीएसएस के साथ आंखों को धो लें जब तक कि पोविडोन-आयोडीन का नारंगी रंग नहीं चला जाता है। इसमें लगभग दो या तीन वॉश लगते हैं।
  6. आंखों को एक नए 60 मिमी पेट्री डिश में रखें और उन्हें ठंड (2-8 डिग्री सेल्सियस) पूर्ण आरपीई सेल संस्कृति मीडिया में डुबोएं जो चरण 1.1 में तैयार किया गया है।

3. विच्छेदन

  1. सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत, संयोजी ऊतक और एक्स्ट्राओकुलर मांसपेशियों को हटाने के लिए एम 5 एस शैली चिमटी और वन्नास कैंची का उपयोग करें।
    नोट: विच्छेदन एक पूरी तरह से बाँझ वातावरण में एक ऊतक हुड के तहत किया जाता है। हालांकि, वीडियो प्रयोजनों के लिए, विदारक माइक्रोस्कोप को उच्च गुणवत्ता वाले प्रदर्शन / फिल्मांकन को प्राप्त करने के लिए हुड के बाहर रखा गया था। आंखों के नीचे लिंट-फ्री टिशू पेपर का एक छोटा टुकड़ा रखने से विच्छेदन के दौरान स्थिरता में सुधार होता है। आंखों को ठंडे आरपीई सेल संस्कृति मीडिया में अस्थायी रूप से (1 घंटे से अधिक नहीं) आयोजित किया जा सकता है। हालांकि, आंखों को साफ करने के तुरंत बाद सीधे अगले चरण पर आगे बढ़ना बेहतर है।
  2. आंखों को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें हर चार आंखों के लिए 1 एमएल एंजाइम ए समाधान होता है। फिर, 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में आंखों सेते हैं।
  3. इनक्यूबेटर और माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब से आंखों को हटा दें। फिर, उन्हें एक नई माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें हर चार आंखों के लिए एंजाइम बी समाधान के 1 एमएल होते हैं। 50 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में ट्यूब सेते हैं।
  4. पूर्ण आरपीई सेल विकास मीडिया के 10 एमएल युक्त एक नए 60 मिमी निलंबन संस्कृति पकवान में आंखों को रखें। फिर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर आंखों सेते हैं।
  5. एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत पकवान रखें और विदारक शुरू करें।
  6. आंख के पूर्वकाल भाग (कॉर्निया, आईरिस और लेंस) को आईकप (पीछे रेटिना) के पीछे के हिस्से से हटा दें।
    1. एम 5 एस शैली संदंश के साथ आंख को समझें और ओरा सेराटा सेक्शन (रेटिना का अधिकांश पूर्वकाल हिस्सा जहां हल्का नीला समाप्त होता है) में # 11 ब्लेड या सिरिंज की सुई के साथ चीरा बनाएं।
    2. संदंश की एक जोड़ी के साथ चीरा के भीतरी हिस्से को समझें, और संदंश की एक और जोड़ी के साथ कॉर्निया को समझें। रेटिना से कॉर्निया को धीरे-धीरे खींचना या फाड़ना शुरू करें। छोटे वेतन वृद्धि में फाड़ना सुनिश्चित करें और कॉर्निया को हटाते समय आंसू को नीचे ले जाएं, यह सुनिश्चित करने के लिए कि आरपीई ज्यादातर बरकरार रहे और परिणामस्वरूप क्लीनर आंसू हो।
      नोट: एक बार कॉर्निया पूरी तरह से अलग हो जाने के बाद, आईरिस और लेंस को देखा जा सकता है।
    3. कॉर्निया और आईरिस दोनों को अलग करें।
  7. आंख के पीछे के आधे हिस्से के कोमल संपीड़न के साथ आईकप से लेंस को अलग करें।
  8. आरपीई परत से तंत्रिका रेटिना को हटाने के लिए, चिमटी की एक जोड़ी के साथ आईकप की बाहरी परत को समझें और आरपीई और तंत्रिका परतों दोनों के बीच चिमटी की दूसरी जोड़ी की बांह को रखें। वहां से, धीरे-धीरे तंत्रिका रेटिना को आरपीई परत से दूर खींचें या स्कूप करें। तंत्रिका रेटिना को त्यागें।
    नोट: वीडियो में, तंत्रिका रेटिना और लेंस को एक साथ हटा दिया जाता है। हालांकि, शुरुआती लोगों के लिए, प्रत्येक को अलग से हटाना आसान होगा। जो बचा है वह आरपीई, कोरॉइड और श्वेतपटल है।
  9. कॉर्निया, आईरिस, लेंस और तंत्रिका रेटिना को त्यागें। शेष आईकप को मलबे से मुक्त पकवान पर एक नए क्षेत्र में ले जाएं।
  10. कोरॉइड और श्वेतपटल से आरपीई को अलग करने के लिए, आरपीई कोशिकाओं के पृथक्करण को सुनिश्चित करने के लिए 5/45 शैली चिमटी के साथ आईकप के अंदर धीरे-धीरे परिमार्जन करें। पूर्ण आरपीई सेल ग्रोथ मीडिया में निलंबित होने पर आरपीई कोशिकाएं बादल दिखाई देती हैं।
  11. एक 3.2 एमएल बाँझ हस्तांतरण विंदुक का उपयोग कर कोशिकाओं की आकांक्षा और पूर्ण आरपीई सेल विकास मीडिया युक्त एक नया 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए स्थानांतरण।

4. सेंट्रीफ्यूजेशन

  1. एक अपकेंद्रित्र के अंदर प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं युक्त 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें।
  2. सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें और पूर्ण आरपीई विकास मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। पूर्ण आरपीई विकास मीडिया अन्य दूषित कोशिकाओं की तुलना में आरपीई विकास के लिए अधिक विशिष्ट है, जैसे कि मुलर कोशिकाएं या कोरॉइडल एंडोथेलियल कोशिकाएं। मुलर कोशिकाओं को उच्च ग्लूकोज मीडिया की आवश्यकता होती है, जबकि कोरॉइडल एंडोथेलियल कोशिकाओं को विशिष्ट विकास कारकों की आवश्यकता होती है। मीडिया को बदलकर और संस्कृति को पारित करके, केवल आरपीई कोशिकाएं बढ़ती रहेंगी।

5. सेल संस्कृति

  1. एक बाँझ 100 मिमी पेट्री डिश पर पुन: निलंबित प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं को प्लेट करें और उन्हें इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें (विशिष्ट आरपीई / मुलर सेल मार्करों के साथ धुंधला कोशिकाओं द्वारा शुद्धता को सत्यापित करने के बाद, जैसा कि चित्रा 1ई-एन में दर्शाया गया है)। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर कोशिकाओं सेते हैं।
    नोट: उपयोग किए जाने वाले मार्कर सामग्री की तालिका में उल्लिखित हैं। यह कदम संस्कृति की स्थापना के बाद किया जाता है।
  2. बढ़ने के लिए लगभग 5 दिनों के लिए कोशिकाओं सेते हैं। इस समय के दौरान, मीडिया को न बदलें, कोशिकाओं को परेशान न करें, या सेल संस्कृति प्लेट को स्थानांतरित करें (यह प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है; अलगाव के बाद, कोशिकाओं को ऊष्मायन किया जाना चाहिए और 5 दिनों के लिए परेशान नहीं किया जाना चाहिए)।
    नोट: कोशिकाओं की संख्या अलगाव के लिए उपयोग की जाने वाली आंखों की संख्या पर निर्भर करती है। पृथक आंखों की एक बड़ी संख्या कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या उपज होगी। दो आंखों से आरपीई अलगाव ~ 440,000-880,000 कोशिकाओं, या 100 मिमी पेट्री डिश का 5% -10% उपज देगा, जो 8.8 मिलियन कोशिकाओं को पकड़ सकता है।

6. पासिंग

  1. मीडिया को बाहर निकालें और पीबीएस के 2 एमएल के साथ धो लें। फिर पीबीएस को बाहर निकालें।
  2. 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए (1 एक्स) के 4 एमएल जोड़ें, या पकवान के आधार को कवर करने के लिए पर्याप्त है। कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. पूर्व-गर्म आरपीई मीडिया के 8 एमएल या चरण 6.2 में ट्रिप्सिन का उपयोग कितना किया गया था, इसकी मात्रा से दोगुना जोड़ें। फिर कोशिकाओं को इकट्ठा करें और उन्हें 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें।
  4. कमरे के तापमान पर 7 मिनट के लिए 300 x g पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा और पूर्ण आरपीई सेल संस्कृति मीडिया के 10 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। एक बाँझ 100 मिमी पेट्री डिश में पूरे निलंबन प्लेट।
    नोट: कोशिकाओं को चार या पांच बार18 तक पारित किया जा सकता है। हालांकि, सबसे सुसंगत प्रयोग परिणाम दो या तीन मार्गों के बाद पाए जाते हैं। दो से चार मार्गों के बाद, कोशिकाओं ने अपने आकार को बदल दिया (जैसा कि चित्रा 1 डी में दिखाया गया है) अधिक लम्बी होने के लिए, प्लेट के बीच में संचित, बढ़ना बंद कर दिया, और अलग हो गया।
  5. आरपीई विशिष्टता को दागने और मान्य करने के लिए पहले प्रकाशित विधियों 8,14,15,16 के अनुसार इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का उपयोग करें।

7. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

नोट: इम्यूनोफ्लोरेसेंस आरपीई विशिष्टता को दागने और मान्य करने के लिए पहले प्रकाशित विधियों 8,14,15,16,17,18 के अनुसार किया गया था। प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं का धुंधला होना आमतौर पर मार्ग पी 1 और पी 2 पर किया गया था। यहां, इम्यूनोफ्लोरोसेंट प्रोटोकॉल का एक संक्षिप्त अवलोकन प्रस्तुत किया गया है।

  1. एक सेल संस्कृति कक्ष स्लाइड पर कोशिकाओं बीज (8 अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड के लिए अच्छी तरह से प्रति 30,000 कोशिकाओं)।
  2. 24-48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर पूर्ण आरपीई सेल संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं की संस्कृति।
  3. जब कोशिकाएं 80% -90% संगम होती हैं, तो मीडिया को बाहर निकालें और 1x पीबीएस के साथ कक्ष स्लाइड को धो लें।
  4. 10-15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ स्लाइड को ठीक करें।
  5. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड को बाहर निकालें और फिर अवरुद्ध समाधान के साथ ब्लॉक करें (सामग्री की तालिका देखें)।
  6. अवरुद्ध समाधान की आकांक्षा करें और प्राथमिक एंटीबॉडी, आरपीई 65 जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर तीन घंटे के लिए सेते हैं (अवरुद्ध बफर में 1: 200-1: 250 से लेकर एंटीबॉडी एकाग्रता के साथ, 150-200 μL / फिर, पीबीएस / टीएक्स -100 (5-10 मिनट प्रत्येक धोने) के साथ तीन बार धो लें।
  7. प्राथमिक एंटीबॉडी को बाहर निकालें और माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें (अवरुद्ध बफर में एंटीबॉडी एकाग्रता 1: 1,000 के साथ, 150-200 μL / 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए सेते हैं।
  8. माध्यमिक एंटीबॉडी को बाहर निकालें। ट्रशन एक्स -100 (5-10 मिनट प्रत्येक धोने) के साथ तीन बार धोएं।
  9. नाभिक को लेबल करने के लिए डीएपीआई बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें और स्लाइड पर एक कवरस्लिप रखें। सुनिश्चित करें कि कवरस्लिप के नीचे कोई बुलबुले नहीं हैं।
  10. फिर, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ छवियां लें, एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप (एचआरएम) कैमरा और छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के साथ ( सामग्री की तालिका देखें)।

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Representative Results

पृथक आरपीई कोशिकाओं की विशिष्टता, शुद्धता और बाधा समारोह / गठन का सत्यापन
पृथक कोशिकाओं को उनकी व्यवहार्यता, आकृति विज्ञान और रंजकता को सत्यापित करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत जांच की गई थी। पी 0 और पी 1 (चित्रा 1 ए, बी) से छवियां और पी 0 और पी 4 से छवियों को कोशिकाओं में परिवर्तन दिखाने के लिए (चित्रा 1 सी, डी) पर कब्जा कर लिया गया था; आकार, आकार और रंजकता के रूप में मार्ग चौथे मार्ग पर आगे बढ़े (काले तीर पी 4 में पृथक आरपीई कोशिकाओं की ओर इशारा कर रहे हैं)। पृथक कोशिकाओं की पहचान को सत्यापित करने के लिए आरपीई 65 प्रोटीन के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। पृथक कोशिकाओं के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला आरपीई 65 के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ प्रदर्शन किया गया था, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 ई, एफ: कम आवर्धन, और चित्रा 1 जी, एच: उच्च आवर्धन, हरे रंग में सकारात्मक दाग आरपीई कोशिकाओं और नीले रंग में एक परमाणु मार्कर, डीएपीआई दिखा) के तहत परीक्षा के बाद। आरपीई 65 आरपीई में व्यक्त एक आइसोमेरोहाइड्रोलेज है। छड़- और शंकु-मध्यस्थता दृष्टि21 के लिए आवश्यक दृश्य वर्णक के उत्थान के लिए यह आवश्यक है। पृथक के बाधा समारोह को मान्य करने के लिए
कोशिकाओं, पृथक कोशिकाओं के लिए साइटोस्केलेटल प्रोटीन एफ-एक्टिन और तंग जंक्शन प्रोटीन ज़ो -1 इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला8 दोनों का उपयोग किया गया था (चित्रा 1 आई, जे: हरा ज़ो -1 और नीला परमाणु धुंधला)। और चित्रा 1 के, एल: लाल एफ-एक्टिन और नीले परमाणु धुंधला)। हालांकि, आरपीई का विशिष्ट कोबलस्टोन आकार बहुत स्पष्ट है जब कोशिकाएं पूरी तरह से संगम होती हैं।

नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग उन प्रयोगों में किया गया था जहां प्राथमिक एंटीबॉडी को जोड़े बिना माध्यमिक एंटीबॉडी को आरपीई कोशिकाओं में जोड़ा गया था, यह सुनिश्चित करने के लिए कि एंटीबॉडी की विशिष्टता और परिणामी रंग एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट है जो उपयोग किए गए थे (नहीं दिखाया गया था)।

मुलर कोशिकाओं द्वारा पृथक आरपीई की शुद्धता और संदूषण को मान्य करने के लिए, मुलर कोशिकाओं के लिए एक विशिष्ट सेल मार्कर के साथ पृथक कोशिकाओं के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला, विमेंटिन का उपयोग किया गया था (परमाणु धुंधला के लिए हरा और नीला जैसा कि चित्रा 1 एम, एन में दिखाया गया है) मुलर कोशिकाओं को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करना। पृथक आरपीई कोशिकाओं ने विमेंटिन के लिए नकारात्मक धुंधला दिखाया।

पृथक कोशिकाओं को उनकी व्यवहार्यता, आकृति विज्ञान और रंजकता को सत्यापित करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत जांच की गई थी। पी 0 और पी 1 (चित्रा 1 के, एल) और पी 0 और पी 4 से छवियों को कोशिकाओं के आकार, आकार और रंजकता में परिवर्तन दिखाने के लिए कब्जा कर लिया गया था क्योंकि मार्ग चौथे मार्ग पर आगे बढ़े (काले तीर पी 4 में पृथक आरपीई कोशिकाओं की ओर इशारा कर रहे हैं)।

Figure 1
चित्रा 1: आरपीई अलगाव सत्यापन ( ए ) आरपीई मार्ग शून्य (पी 0) के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोप। (बी) आरपीई मार्ग एक (पी 1) के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोप। (सी) पी 0 पर आकृति विज्ञान लक्षण वर्णन। (डी) पी 4 पर आकृति विज्ञान लक्षण वर्णन। (ई) कम आवर्धन पर आरपीई 65 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग। (एफ) डीएपीआई के साथ परमाणु धुंधला के साथ आरपीई 65 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग। (जी) उच्च आवर्धन पर आरपीई 65 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग। (एच) उच्च आवर्धन पर डीएपीआई के साथ परमाणु धुंधला के साथ आरपीई 65 के लिए इम्यूनोस्टेनिंग। (मैं) आरपीई कोशिकाओं के लिए ज़ो -1 धुंधला। (जी) डीएपीआई के साथ परमाणु धुंधला के साथ आरपीई कोशिकाओं के लिए ज़ो -1 धुंधला। (के) आरपीई कोशिकाओं के लिए एफ-एक्टिन धुंधला हो जाना। (एल) डीएपीआई के साथ परमाणु धुंधला के साथ आरपीई कोशिकाओं के लिए एफ-एक्टिन धुंधला हो जाना। (एम) आरपीई कोशिकाओं के लिए विमेंटिन धुंधला हो जाना। (एन) डीएपीआई के साथ परमाणु धुंधला के साथ एक सकारात्मक नियंत्रण (आरएमसी -1) के रूप में मुलर कोशिकाओं के लिए विमेंटिन धुंधला हो जाना। स्केल बार क्रमशः 300 μm, 20 μm, 300 μm, 300 μm, 50 μm, 10 μm, 50 μm, 50 μm और 50 μm के बराबर हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल माउस आंखों से आरपीई अलगाव के लिए एक रिपोर्ट, संशोधित और सरलीकृत विस्तृत प्रक्रिया है। प्रोटोकॉल में माउस आंखों से पृथक आरपीई कोशिकाओं के एन्यूक्लिएशन, विच्छेदन, संग्रह, बीजारोपण, संस्कृति और लक्षण वर्णन शामिल हैं।

कुछ सीमाएं और महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें सफल आरपीई अलगाव के लिए पूरा किया जाना चाहिए, जैसे चूहों की उम्र, विच्छेदित आंखों की संख्या, टिशू कल्चर प्लेट या डिश का आकार, और बोने, भंडारण और पासिंग के बाद सावधानी बरतते हैं। पृथक कोशिकाओं को तीन या चार बार पारित करने में सक्षम होने के लिए, सबसे अच्छा चूहों की उम्र 18-21 दिनों के बीच होती है। पृथक कोशिकाओं की उचित संख्या के लिए जो बढ़ने और गुणा करने में सक्षम हैं, एकल अलगाव के लिए कम से कम दो आंखों की आवश्यकता होती है। अलगाव के परिणामस्वरूप कोशिकाओं की संख्या विच्छेदित आंखों की संख्या (~ 220,000 कोशिकाओं / एक बाँझ 100 मिमी पेट्री डिश / फ्लास्क को प्रारंभिक मार्ग (पी 0) में बड़ी संख्या में कोशिकाओं को प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है। बोने के बाद, इनक्यूबेटर से टिशू कल्चर प्लेट को स्थानांतरित करके या कम से कम 5 दिनों के लिए मीडिया को बदलकर कोशिकाओं को परेशान नहीं किया जाना चाहिए। इसके अलावा, की सीमाओं में से एकयह तकनीक पृथक कोशिकाओं का भंडारण और पासिंग है। कोशिकाओं को संग्रहीत नहीं किया जा सकता है (फ्रीज और रिथव किया गया है) और केवल तीन या चार बार पारित किया जा सकता है। पारित होने के बाद 4, कोशिकाएं सेल पिग्मेंटेशन (चित्रा 1 डी) में उल्लेखनीय कमी के साथ लम्बी (धुरी आकार) बनने के लिए अपने आकार और आकार को बदलना शुरू कर देती हैं।

यह प्रोटोकॉल प्राथमिक माउस आरपीई अलगाव1 3,19,20 के लिए अन्य मूल्यवान और विश्वसनीय प्रकाशित प्रोटोकॉल से अलग है जिसमें यह कुछ चरणों के साथ सरलीकृत है जो पालन करना आसान है। आरपीई कोशिकाओं को उनकी आकृति विज्ञान, रंजकता और विशिष्ट आरपीई मार्करों जैसे आरपीई 65 4,5,21 द्वारा पहचाना जा सकता है। मुलर कोशिकाओं की शुद्धता और संदूषण का सत्यापन मुलर कोशिकाओं (विमेंटिन) 22 के लिए एक विशिष्ट सेल मार्कर के साथ पृथक कोशिकाओं को धुंधला करके प्राप्त किया गया था। इन विट्रो में रक्त-रेटिना बाधा (बीआरबी) की अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया गया है, जैसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ईएम) परीक्षा, तंग जंक्शन प्रोटीन (टीजेपी) का मूल्यांकन, एफआईटीआईसी डेक्सट्रान रिसाव परख, और ट्रांसएपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेसिस्टेंस (टीईआर) माप जो मोनोलेयर 8,23 के रूप में आरपीई के शारीरिक कार्य का मूल्यांकन करता है . आरपीई कोशिकाएं बाहरी बीआरबी को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, और इस फ़ंक्शन को मान्य करने के लिए, हमने तंग जंक्शन प्रोटीन (टीजेपी) जैसे ज़ोना ओक्लुडिन -1 (जेडओ -1) और एफ-एक्टिन जैसे साइटोस्केलेटल प्रोटीन का मूल्यांकनकिया जैसा कि पहले प्रकाशित 8. टीजेपी मूल्यांकन बीआरबी अखंडता और बाधा समारोह के मूल्यांकन के लिए एक अधिक सुविधाजनक तरीका है जिसके लिए महंगे उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है जो ईएम मूल्यांकन या टीईआर के विपरीत सभी अनुसंधान प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं हो सकते हैं।

प्राथमिक आरपीई अलगाव एक ऐसी तकनीक है जो अंतर्निहित तंत्र और रोगजनन का अध्ययन करने और विभिन्न आंखों की बीमारियों के लिए नए चिकित्सीय अनुप्रयोगों का प्रस्ताव करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकती है। वर्तमान तकनीक ने आरपीई सेल संरचना और कार्य में परिवर्तन और उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन में बाहरी बीआरबी पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने में सक्षम बनाया8. इसके अलावा, इसने जंगली प्रकार के सी 57 बीएल 6 चूहों और विभिन्न आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से अलग आरपीई कोशिकाओं में परिवर्तन का अध्ययन करने में मदद की, साथ ही एएमडी14,16 के लिए चिकित्सीय लक्ष्य की मांग करने वाले विभिन्न औषधीय यौगिकों का परीक्षण किया।

अंत में, कई उपलब्ध प्रकाशित प्रोटोकॉल ने प्राथमिक माउस आरपीई अलगाव का प्रदर्शन किया। प्रस्तुत प्रोटोकॉल कुछ मौजूदा प्रोटोकॉल को संशोधित करने के परिणामस्वरूप एक सरलीकृत प्रक्रिया है, सामग्री, विधियों और उपकरणों का उपयोग करके जो माउस आंखों से प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं को अलग करने के लिए अधिकांश शोध प्रयोगशालाओं में उपलब्ध हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास यह घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है जो इस लेख की सामग्री के लिए प्रासंगिक हैं।

Acknowledgments

इस कार्य को राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (एनईआई), राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (एनईआई) फंड आर01 ईवाई029751-04 द्वारा समर्थित किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker : 100mL KIMAX 14000
Collagenase from Clostridium histolyticum  Sigma-Aldrich C7657-25MG For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile 13-711-20
DMEM/F12  gibco  11330 Media to grow RPE cells 
Fetal Bovine Serum (FBS) gibco 26140079 For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution gibco 15750-060 For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Scientific 88284 For working enzymes (A&B) 
Heracell VISO 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Hyaluronidase from bovine testes Sigma-Aldrich H3506-500MG For working enzyme A
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL B-D 309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL Grainger 11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody  Abcam, Cambridge, MA, USA ab78036 For IF staining 
Pen Strep gibco 15140-122 For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45 Dumont 72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm GARANA INDUSTRIES 2595
Sorvall St8 Centrifuge ThermoScientific 75007200
Stemi 305 Microscope Zeiss n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel Bard-Parker 371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style Corning 430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style Corning 353003
Tornado Tubes: 15mL Midsci C15B
Tornado Tubes: 50mL Midsci C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25% gibco 2186962 For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips Dumont 501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL Electron Microscopy Sciences Dumont 50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36" McKesson 4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge FST 15000-08
Zeiss AxioImager Z2 Zeiss n/a
Zeiss Zen Blue 2.6 Zeiss n/a

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References

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  24. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).

Tags

जीव विज्ञान अंक 189

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24th reference was added:

  1. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
प्राथमिक माउस रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम कोशिकाओं का अलगाव
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Tomaszewski, R., Rajpurohit, P.,… More

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P., Cheng, M., Tawfik, A. Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. J. Vis. Exp. (189), e63543, doi:10.3791/63543 (2022).

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