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Biology

Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63543
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,3
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine, 3Oral Biology and Diagnostic Sciences, Dental College of Georgia, Augusta University

ERRATUM NOTICE

Summary

Dieses Manuskript beschreibt ein vereinfachtes Protokoll zur schrittweisen Isolierung von retinalen pigmentierten Epithelzellen (RPE) aus Mausaugen. Das Protokoll umfasst die Enukleation und Dissektion von Mausaugen, gefolgt von der Isolierung, Aussaat und Kultivierung von RPE-Zellen.

Abstract

Die retinale pigmentierte Epithelschicht (RPE) liegt unmittelbar hinter den Photorezeptoren und beherbergt ein komplexes Stoffwechselsystem, das mehrere entscheidende Rollen bei der Aufrechterhaltung der Funktion der Photorezeptoren spielt. Daher sind die RPE-Struktur und -Funktion unerlässlich, um ein normales Sehvermögen aufrechtzuerhalten. Dieses Manuskript stellt ein etabliertes Protokoll für die primäre RPE-Zellisolierung von Mäusen vor. Die RPE-Isolierung ist ein großartiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der RPE-Pathologie in den verschiedenen Mausmodellen für Augenerkrankungen zugrunde liegen. Darüber hinaus kann die RPE-Isolierung helfen, primäre Maus-RPE-Zellen zu vergleichen, die aus Wildtyp- und genetisch veränderten Mäusen isoliert wurden, sowie Medikamente zu testen, die die Entwicklung von Therapien für Sehstörungen beschleunigen können. Das Manuskript stellt ein schrittweises RPE-Isolationsprotokoll vor; Der gesamte Vorgang von der Enukleation bis zur Aussaat dauert ca. 4 Stunden. Das Medium sollte 5-7 Tage nach der Aussaat nicht gewechselt werden, damit die isolierten Zellen ungestört wachsen können. Diesem Prozess folgt die Charakterisierung von Morphologie, Pigmentierung und spezifischen Markern in den Zellen mittels Immunfluoreszenz. Zellen können maximal drei- oder viermal durchlaufen werden.

Introduction

Retinale pigmentierte Epithelzellen (RPE) befinden sich zwischen der Aderhaut und der neuronalen Netzhaut und bilden eine einfache Monoschicht von quaderförmigen Zellen, die hinter den Photorezeptorzellen (PR) liegen1. Das RPE spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer gesunden Umgebung für PR-Zellen, hauptsächlich durch die Verringerung der übermäßigen Anhäufung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und der daraus resultierenden oxidativen Schäden1. RPE-Zellen überwachen viele Funktionen, wie die Umwandlung und Speicherung von Retinoide, die Absorption von Streulicht, den Flüssigkeits- und Ionentransport und die Phagozytose der abgestoßenen PR-Außensegmentmembran 2,3. Veränderungen in der RPE (Morphologie/Funktion) können ihre Funktion beeinträchtigen und zu einer Retinopathie führen, und dies ist ein gemeinsames Merkmal vieler Augenerkrankungen4. Viele Augenerkrankungen sind mit Veränderungen in der Morphologie und Funktion von RPE-Zellen verbunden, darunter einige genetische Erkrankungen wie Retinitis pigmentosa, Lebersche kongenitale Amaurose und Albinismus 4,5,6 sowie altersbedingte Augenerkrankungen wie diabetische Retinopathie (DR) und altersbedingte Makuladegeneration (AMD)7,8 . Menschliche Zellen sind am wünschenswertesten, daher wäre es ideal, RPE-Störungen in primären menschlichen RPE-Zellen zur Bildung von RPE-Monoschichten zu untersuchen. Ethische Fragen und die begrenzte Verfügbarkeit menschlicher Spender aufgrund der Tatsache, dass die meisten dieser Störungen zu Morbiditätführen 9, aber nicht unbedingt zur Mortalität10, verhindern dadurch die Isolierung primärer humaner RPE-Zellen. Dies macht die Kultivierung von RPE-Zellen von nichtmenschlichen Tierspendern zu einer bevorzugten Alternative. Nagetiere, insbesondere Mäuse, gelten als hervorragendes Modell für die Untersuchung verschiedener Augenerkrankungen, da die transgene Technologie bei diesen Arten weiter verbreitet ist11. Obwohl die Verwendung von kultivierten primären RPE-Zellen viele Vorteile bietet, war es schwierig, wachsende Zellen für viele Passagen aufrechtzuerhalten oder die Zellen zu speichern und wiederzuverwenden. Die Haupteinschränkung dieses Protokolls ist das Alter der Mäuse; Mäuse, die für die RPE-Isolierung verwendet werden, sollten ein sehr junges Alter haben (18-21 Tage alt ist optimal), da es schwierig war, RPE-Zellen von erwachsenen Mäusen zu kultivieren11,12,13. RPE-Zellen können in jedem Alter aus Mausaugen isoliert werden, jedoch waren bis zu vier Zellpassagen nur bei jungen Mäusen (18-21 Tage alt) erfolgreich. Die RPE-Isolierung aus Mausnetzhäuten unter Verwendung von C57BL6-Mäusen und transgenen Mäusen mit Deletion der N-Methyl-D-Aspartatrezeptoren (NMDARs) an den RPE-Zellen wurde durchgeführt, um die Wirkung von erhöhtem Aminosäure-Homocystein auf die Entwicklung und das Fortschreiten von AMD14 zu untersuchen. Darüber hinaus halfen isolierte primäre RPE-Zellen dabei, ein therapeutisches Ziel für AMD vorzuschlagen, indem sie die NMDARs an RPE-Zellen hemmten14. Es gibt einige NMDAR-Blocker, die von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassen sind und derzeit zur Behandlung von mittelschwerer bis schwerer Verwirrung (Demenz) im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit (AD) eingesetzt werden, wie Memantin16, das ein potenzielles therapeutisches Ziel für AMD14 sein könnte. Darüber hinaus wurden isolierte primäre Maus-RPE-Zellen für den Nachweis von Entzündungsmarkern und die vorgeschlagene Induktion von Entzündungen als zugrunde liegenden Mechanismus für Homocystein-induzierte Merkmale von AMD und AD unter Verwendung einer genetisch veränderten Maus (CBS) verwendet, die einen hohen Homocysteinspiegel aufweist16,17.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um RPE-Zellen sowohl von Wildtyp-C57BL/6-Mäusen als auch von transgenen Mäusen zu isolieren, die in unserem Labor als vereinfachte Anpassung anderer veröffentlichter Isolationsprotokolle13,18,19 entwickelt wurden, um ein leicht anwendbares und zuverlässiges Protokoll zu erreichen. Es gibt keine Geschlechtspräferenz in diesem Protokoll. Während das Alter der Mäuse für den Isolationsprozess entscheidend ist, wurden junge, ältere Mäuse (18-21 Tage alt) und ältere Mäuse in jedem Alter (bis zu 12 Monate) für die RPE-Isolierung verwendet. Wir stellten jedoch fest, dass die RPE-Zellen, die aus den jungen Mäusen isoliert wurden, länger lebten und bis zu vier Passagen durchgeführt werden konnten. Die RPE-Zellen, die aus älteren Mäusen isoliert wurden, könnten ein- oder zweimal durchquert werden, dann würden sie aufhören zu wachsen und ihre Form ändern, um länglicher zu sein (Fibroblasten-ähnliche Zellen). Ein Verlust der Pigmentierung und eine verminderte Adhäsion an der Gewebekulturplatte, gefolgt von einer Ablösung, wurden ebenfalls beobachtet.

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Protocol

Die Tiere wurden gemäß den Richtlinien des IACUC-Tierprotokolls Nr. 21063 der Universität Oakland und den Richtlinien der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung verwendet.

1. Lösungsvorbereitung

  1. Bereiten Sie das komplette RPE-Zellkulturmedium vor, indem Sie Dulbeccos modifizierte Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) mit 25% fetalem Rinderserum (FBS), 1,5% Penicillin / Streptomycin und 0,02% Gentamicin ergänzen.
  2. Bereiten Sie Enzym A vor, indem Sie 741 μL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) mit 127 μL Kollagenase-Stammlösung und 132 μL Hyaluronidase-Stammlösung ergänzen. Dies ergibt ein Endvolumen von 1 ml, das vier Augen behandeln kann.
    1. Die Kollagenase-Stammlösung wird durch Auflösen von 1 mg Kollagenase aus Clostridium histolyticum in 41 ml HBSS (19,5 Einheiten/ml) hergestellt.
    2. Die Hyaluronidase-Stammlösung wird durch Auflösen von 1 mg Hyaluronidase aus Rinderhoden in 18,4 ml HBSS (38 Einheiten/ml) hergestellt.
  3. Bereiten Sie Enzym B vor, indem Sie drei Teilen HBSS zwei Teile 0,25% Trypsin-EDTA hinzufügen. Beachten Sie, dass das Gesamtvolumen von der Anzahl der sezierten Augen abhängt. 1 ml Enzym B kann zur Behandlung von vier Augen verwendet werden.

2. Enukleation

  1. Euthanasieren Sie die Maus ethisch durch Inhalation von Kohlendioxid (CO2) gemäß IACUC-Standards21.
    1. Setzen Sie das/die Tier(e) kurz in die CO 2 -Kammer, um 100% CO 2 mit einer Füllrate von 30%-70% des Kammervolumens pro Minute mit CO 2 einzubringen, um innerhalb von2 bis 3 min Bewusstlosigkeit mit minimaler Belastung für die Mäuse zu erreichen.
    2. Bestätigen Sie den Tod (mangelnde Atmung und verblasste Augenfarbe), dann bewegen Sie die Maus aus dem Käfig in einen sauberen sterilisierten chirurgischen Bereich (mit Alkohol geschrubbt), der mit sterilisierten chirurgischen Geräten ausgestattet ist.
  2. Legen Sie die Maus auf eine sterile Unterlage.
  3. Enukleieren Sie die Augen, indem Sie eine 5/45-Pinzette auf den Orbitalbereich drücken, um Proptose zu induzieren, gefolgt von einer Pinzette zur Hinterseite des Auges. Extrahieren Sie die Augen mit intaktem Sehnerv, indem Sie die Augen sanft aus der Augenhöhle ziehen.
  4. Tauchen Sie die Augen mit einer Pinzette in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das 1 ml 5% Povidon-Jod enthält. Inkubieren Sie die Augen bei Raumtemperatur für 2-3 min.
  5. Entfernen Sie die Augen von der Povidon-Jod-Lösung und legen Sie sie in eine Petrischale. Waschen Sie die Augen mit einer sterilen Transferpipette mit HBSS, bis die orange Farbe des Povidon-Jods verschwunden ist. Dies dauert etwa zwei oder drei Wäschen.
  6. Legen Sie die Augen in eine neue 60 mm Petrischale und tauchen Sie sie in kalte (2-8 °C) komplette RPE-Zellkulturmedien, die in Schritt 1.1 vorbereitet wurden.

3. Sezieren

  1. Verwenden Sie unter einem chirurgischen Mikroskop eine Pinzette im M5S-Stil und eine Vannas-Schere, um das Bindegewebe und die extraokularen Muskeln zu entfernen.
    HINWEIS: Die Dissektion erfolgt unter einer Gewebehaube in einer völlig sterilen Umgebung. Für Videozwecke wurde das Seziermikroskop jedoch außerhalb der Haube platziert, um eine höhere Qualität der Demonstration / des Filmens zu erreichen. Das Legen eines kleinen Stücks fusselfreies Seidenpapier unter das Auge verbessert die Stabilität während der Dissektion. Die Augen können dann vorübergehend (nicht länger als 1 Stunde) in den kalten RPE-Zellkulturmedien gehalten werden. Es ist jedoch vorzuziehen, direkt nach der Reinigung der Augen mit dem nächsten Schritt fortzufahren.
  2. Die Augen werden in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das 1 ml Enzym-A-Lösung für jeweils vier Augen enthält. Dann die Augen in einem Inkubator bei 37 °C für 40 min inkubieren.
  3. Entfernen Sie die Augen aus dem Inkubator und dem Mikrozentrifugenröhrchen. Dann übertragen Sie sie in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, das 1 ml Enzym-B-Lösung für jeweils vier Augen enthält. Inkubieren Sie das Röhrchen in einem Inkubator bei 37 °C für 50 min.
  4. Legen Sie die Augen in eine neue 60-mm-Suspensionskulturschale, die 10 ml komplettes RPE-Zellwachstumsmedium enthält. Anschließend die Augen bei 4 °C für 30 min inkubieren.
  5. Stellen Sie die Schale unter ein Operationsmikroskop und beginnen Sie mit dem Sezieren.
  6. Entfernen Sie den vorderen Teil des Auges (Hornhaut, Iris und Linse) aus dem hinteren Teil der Augenmuschel (hintere Netzhaut).
    1. Fassen Sie das Auge mit einer Zange im M5S-Stil und machen Sie einen Schnitt im Ora Serrata-Abschnitt (der vorderste Teil der Netzhaut, wo das Hellblau endet) mit einer # 11-Klinge oder der Nadel einer Spritze.
    2. Fassen Sie den inneren Teil des Einschnitts mit einer Pinzette und greifen Sie die Hornhaut mit einer anderen Pinzette. Beginnen Sie, die Hornhaut langsam von der Netzhaut zu ziehen oder zu reißen. Achten Sie darauf, in kleinen Schritten zu reißen und den Riss nach unten zu bewegen, während Sie die Hornhaut entfernen, um sicherzustellen, dass die RPE weitgehend intakt bleibt und zu einem saubereren Riss führt.
      HINWEIS: Sobald die Hornhaut vollständig abgelöst ist, können die Iris und die Linse gesehen werden.
    3. Trennen Sie Hornhaut und Iris.
  7. Trennen Sie die Linse von der Augenmuschel mit sanfter Kompression der hinteren Augenhälfte.
  8. Um die neuronale Netzhaut von der RPE-Schicht zu entfernen, greifen Sie die äußere Schicht der Augenmuschel mit einer Pinzette und positionieren Sie den Arm einer zweiten Pinzette zwischen der RPE- und der Neuralschicht. Von dort ziehen oder schöpfen Sie die neuronale Netzhaut vorsichtig von der RPE-Schicht weg. Verwerfen Sie die neuronale Netzhaut.
    HINWEIS: Im Video werden die neuronale Netzhaut und die Linse zusammen entfernt. Für Anfänger ist es jedoch einfacher, sie separat zu entfernen. Was bleibt, ist die RPE, Aderhaut und Sklera.
  9. Verwerfen Sie Hornhaut, Iris, Linse und neuronale Netzhaut. Bewegen Sie die verbleibende Augenmuschel in einen neuen Bereich auf der Schale, der frei von Ablagerungen ist.
  10. Um das RPE von der Aderhaut und Sklera zu trennen, kratzen Sie die Innenseite der Augenmuschel vorsichtig mit einer Pinzette im 5/45-Stil, um die Trennung der RPE-Zellen sicherzustellen. Die RPE-Zellen erscheinen trüb, wenn sie im gesamten RPE-Zellwachstumsmedium suspendiert sind.
  11. Die Zellen werden mit einer sterilen 3,2-ml-Transferpipette abgesaugt und in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit vollständigen RPE-Zellwachstumsmedien überführt.

4. Zentrifugation

  1. Legen Sie das 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit den primären RPE-Zellen in eine Zentrifuge und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
  2. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet mit 10 ml vollständigem RPE-Wachstumsmedium. Das komplette RPE-Wachstumsmedium ist spezifischer für das RPE-Wachstum als andere kontaminierende Zellen wie Müller-Zellen oder Aderhaut-Endothelzellen. Müller-Zellen benötigen hohe Glukosemedien, während Aderhaut-Endothelzellen spezifische Wachstumsfaktoren benötigen. Durch den Wechsel der Medien und die Weitergabe der Kultur werden nur die RPE-Zellen weiter wachsen.

5. Zellkultur

  1. Die resuspendierten primären RPE-Zellen werden auf eine sterile 100-mm-Petrischale aufgetragen und in einen Inkubator überführt (nach Überprüfung der Reinheit durch Färbung der Zellen mit spezifischen RPE/Müller-Zellmarkern, wie in Abbildung 1E-N dargestellt). Die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren.
    HINWEIS: Die verwendeten Marker sind in der Materialtabelle aufgeführt. Dieser Schritt wird ausgeführt, nachdem die Kultur eingerichtet wurde.
  2. Inkubieren Sie die Zellen für etwa 5 Tage, um zu wachsen. Wechseln Sie während dieser Zeit nicht das Medium, stören Sie die Zellen nicht und bewegen Sie die Zellkulturplatte nicht (dies ist ein kritischer Schritt im Protokoll; nach der Isolierung sollten die Zellen inkubiert und 5 Tage lang nicht gestört werden).
    HINWEIS: Die Anzahl der Zellen hängt von der Anzahl der Augen ab, die für die Isolierung verwendet werden. Eine größere Anzahl von isolierten Augen ergibt eine größere Anzahl von Zellen. Die RPE-Isolierung von zwei Augen ergibt ~ 440.000-880.000 Zellen oder 5% -10% der 100 mm Petrischale, die 8,8 Millionen Zellen aufnehmen kann.

6. Passaging

  1. Die Medien absaugen und mit 2 ml PBS waschen. Dann saugen Sie die PBS ab.
  2. Fügen Sie 4 ml 0,25% Trypsin-EDTA (1x) hinzu oder genug, um den Boden der Schale zu bedecken. 5-10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Fügen Sie 8 ml vorgewärmtes RPE-Medium oder das doppelte Volumen der in Schritt 6.2 verwendeten Menge an Trypsin hinzu. Dann sammeln Sie die Zellen und legen Sie sie in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen.
  4. Bei 300 x g 7 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml vollständigem RPE-Zellkulturmedium. Die gesamte Suspension in eine sterile 100 mm Petrischale geben.
    HINWEIS: Die Zellen können bis zu vier oder fünf mal18 durchquert werden. Die konsistentesten Experimentergebnisse finden sich jedoch nach zwei oder drei Passagen. Nach zwei bis vier Passagen änderten die Zellen ihre Form (wie in Abbildung 1D gezeigt), um länglicher zu sein, sammelten sich in der Mitte der Platte an, hörten auf zu wachsen und lösten sich ab.
  5. Verwenden Sie Immunfluoreszenzprotokolle gemäß den zuvor veröffentlichten Methoden8, 14, 15, 16, um die RPE-Spezifität zu färben und zu validieren.

7. Immunfluoreszenz

HINWEIS: Die Immunfluoreszenz wurde gemäß den zuvor veröffentlichten Methoden 8,14,15,16,17,18 durchgeführt , um die RPE-Spezifität zu färben und zu validieren. Die Färbung der primären RPE-Zellen erfolgte typischerweise an den Passagen P1 und P2. Hier wird ein kurzer Überblick über das Immunfluoreszenzprotokoll gegeben.

  1. Aussaat der Zellen auf einem Zellkulturkammerobjektträger (30.000 Zellen pro Vertiefung für den 8-Well-Kammerobjektträger).
  2. Kultur der Zellen in vollständigen RPE-Zellkulturmedien bei 37 °C und 5%CO2 für 24-48 h.
  3. Wenn die Zellen zu 80%-90% konfluent sind, saugen Sie die Medien aus und waschen Sie den Kammerobjektträger mit 1x PBS.
  4. Fixieren Sie den Objektträger mit 4% Paraformaldehyd für 10-15 min.
  5. Das 4%ige Paraformaldehyd absaugen und dann mit einer blockierenden Lösung blockieren (siehe Materialtabelle).
  6. Die Blockierlösung wird abgesaugt, der primäre Antikörper RPE65 hinzugefügt und drei Stunden bei 37 °C inkubiert (mit einer Antikörperkonzentration im Bereich von 1:200-1:250 im Blockierungspuffer bei einem Volumen von 150-200 μL/Objektträger). Dann dreimal mit PBS/TX-100 waschen (jeweils 5-10 min).
  7. Saugen Sie den primären Antikörper aus und fügen Sie den sekundären Antikörper hinzu (mit einer Antikörperkonzentration von 1:1.000 im Blockierpuffer bei einem Volumen von 150-200 μL/Objektträger). Eine Stunde bei 37 °C inkubieren.
  8. Saugen Sie den sekundären Antikörper ab. Dreimal mit PBS/Trtion X-100 waschen (jeweils 5-10 min).
  9. Fügen Sie einen Tropfen DAPI-Montagemedium hinzu, um die Kerne zu kennzeichnen, und legen Sie ein Deckglas über den Objektträger. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen unter dem Deckglas befinden.
  10. Nehmen Sie dann Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop auf, begleitet von einer hochauflösenden Mikroskopkamera (HRM) und einer Bildverarbeitungssoftware (siehe Materialtabelle).

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Representative Results

Validierung der Spezifität, Reinheit und Barrierefunktion/-bildung isolierter RPE-Zellen
Die isolierten Zellen wurden unter einem Lichtmikroskop untersucht, um ihre Lebensfähigkeit, Morphologie und Pigmentierung zu überprüfen. Bilder von P0 und P1 (Abbildung 1A,B) und Bilder von P0 und P4 wurden aufgenommen (Abbildung 1C,D), um die Veränderungen in den Zellen zu zeigen; Form, Größe und Pigmentierung, als die Passagen zur vierten Passage fortgingen (schwarze Pfeile zeigen auf die isolierten RPE-Zellen in P4). Ein Antikörper für das RPE65-Protein wurde verwendet, um die Identität der isolierten Zellen zu verifizieren. Die Immunfluoreszenzfärbung der isolierten Zellen wurde mit einem Antikörper gegen RPE65 durchgeführt, gefolgt von einer Untersuchung unter dem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 1E,F: geringe Vergrößerung und Abbildung 1G,H: hohe Vergrößerung, die positiv gefärbte RPE-Zellen in grün und einen nuklearen Marker, DAPI, in blau zeigt). RPE65 ist eine Isomerohydrolase, die in der RPE exprimiert wird. Es ist essentiell für die Regeneration des Sehpigments, das für das stäbchen- und kegelvermittelte Sehen benötigtwird 21 . So validieren Sie die Barrierefunktion des isolierten
Zellen, sowohl das Zytoskelettprotein F-Aktin als auch das Tight Junction Protein ZO-1 Immunfluoreszenzfärbung8 für die isolierten Zellen wurden verwendet (Abbildung 1I,J: grüne ZO-1 und blaue Kernfärbung). und Abbildung 1K,L: rotes F-Aktin und blaue Kernfärbung). Die typische Kopfsteinpflasterform des RPE ist jedoch sehr deutlich, wenn die Zellen vollständig konfluent sind.

Die Negativkontrolle wurde in den Experimenten verwendet, in denen der sekundäre Antikörper zu den RPE-Zellen hinzugefügt wurde, ohne den primären Antikörper hinzuzufügen, um sicherzustellen, dass die Spezifität des Antikörpers und die resultierende Farbe spezifisch für die verwendeten Antikörper sind (nicht gezeigt).

Um die Reinheit und Kontamination des isolierten RPE durch Müller-Zellen zu validieren, wurde eine Immunfluoreszenzfärbung der isolierten Zellen mit einem spezifischen Zellmarker für Müller-Zellen, Vimentin, verwendet (grün und blau für die Kernfärbung wie in Abbildung 1M,N gezeigt) unter Verwendung von Müller-Zellen als Positivkontrolle. Isolierte RPE-Zellen zeigten eine negative Färbung für Vimentin.

Die isolierten Zellen wurden unter einem Lichtmikroskop untersucht, um ihre Lebensfähigkeit, Morphologie und Pigmentierung zu überprüfen. Bilder von P0 und P1 (Abbildung 1K,L) und Bilder von P0 und P4 wurden aufgenommen (Abbildung 1M,N), um die Veränderungen in Form, Größe und Pigmentierung der Zellen zu zeigen, während die Passagen zur vierten Passage fortfuhren (schwarze Pfeile zeigen auf die isolierten RPE-Zellen in P4).

Figure 1
Abbildung 1: RPE-Isolationsvalidierung. (A) Lichtmikroskop für RPE-Durchgang Null (P0). (B) Lichtmikroskop für RPE-Durchgang eins (P1). (C) Charakterisierung der Morphologie bei P0. (D) Charakterisierung der Morphologie bei P4. (E) Immunfärbung für RPE65 bei geringer Vergrößerung. (F) Immunfärbung für RPE65 mit nuklearer Färbung mit DAPI. (G) Immunfärbung für RPE65 bei hoher Vergrößerung. (H) Immunfärbung für RPE65 mit Kernfärbung mit DAPI bei hoher Vergrößerung. (I) ZO-1-Färbung für RPE-Zellen. (G) ZO-1-Färbung für RPE-Zellen mit Kernfärbung mit DAPI. (K) F-Aktin-Färbung für RPE-Zellen. (L) F-Aktin-Färbung für RPE-Zellen mit Kernfärbung mit DAPI. (M) Vimentin-Färbung für RPE-Zellen. (N) Vimentin-Färbung für Müller-Zellen als Positivkontrolle (RMc-1) mit Kernfärbung mit DAPI. Maßstäbe sind gleich 300 μm, 20 μm, 300 μm, 300 μm, 50 μm, 10 μm, 50 μm, 50 μm bzw. 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Das aktuelle Protokoll ist ein berichtetes, modifiziertes und vereinfachtes detailliertes Verfahren zur RPE-Isolierung von Mausaugen. Das Protokoll umfasst Enukleation, Dissektion, Sammlung, Seeding, Kultur und Charakterisierung von RPE-Zellen, die aus Mausaugen isoliert wurden.

Es gibt einige Einschränkungen und kritische Schritte, die für eine erfolgreiche RPE-Isolierung erfüllt werden müssen, z. B. das Alter der Mäuse, die Anzahl der sezierten Augen, die Größe der Gewebekulturplatte oder -schale und Vorsichtsmaßnahmen nach der Aussaat, Lagerung und Passaging. Um die isolierten Zellen bis zu drei- oder viermal passieren zu können, liegen die besten Mäuse zwischen 18 und 21 Tagen. Um eine angemessene Anzahl von isolierten Zellen zu haben, die wachsen und sich vermehren können, werden mindestens zwei Augen für die Einzelisolierung benötigt. Die Anzahl der Zellen, die zu einer Isolierung führen, ist proportional zur Anzahl der sezierten Augen (~ 220.000 Zellen / Auge). Eine sterile 100 mm Petrischale / Flasche wird empfohlen, um eine größere Anzahl von Zellen in einem frühen Durchgang zu erhalten (P0). Nach der Aussaat sollten die Zellen nicht durch Bewegen der Gewebekulturplatte aus dem Inkubator oder durch Medienwechsel für mindestens 5 Tage gestört werden. Eine der Einschränkungen dieser Technik ist auch die Lagerung und Weitergabe der isolierten Zellen. Zellen können nicht gelagert (eingefroren und aufgetaut) und nur drei- oder viermal durchlässig werden. Nach Passage 4 beginnen die Zellen, ihre Größe und Form zu ändern, um länglich zu werden (Spindelform) mit einer deutlichen Abnahme der Zellpigmentierung (Abbildung 1D).

Dieses Protokoll unterscheidet sich von anderen wertvollen und zuverlässigen veröffentlichten Protokollen für die primäre Maus-RPE-Isolierung1 3,19,20 dadurch, dass es mit einigen leicht zu befolgenden Schritten vereinfacht wird. RPE-Zellen können anhand ihrer Morphologie, Pigmentierung und spezifischer RPE-Marker wie RPE65 4,5,21 identifiziert werden. Die Validierung der Reinheit und Kontamination von Müller-Zellen wurde durch Färbung isolierter Zellen mit einem spezifischen Zellmarker für Müller-Zellen (Vimentin) erreicht22. Viele Techniken wurden verwendet, um die Integrität der Blut-Retina-Barriere (BRB) in vitro zu bewerten, wie Elektronenmikroskop (EM) Untersuchung, Bewertung von Tight Junction Proteinen (TJPs), FITIC Dextran Leckage Assay und transepitheliale elektrische Widerstandsmessung (TER), die die physiologische Funktion von RPE als Monoschicht bewertet 8,23 . RPE-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des äußeren BRB, und um diese Funktion zu validieren, haben wir Tight-Junction-Proteine (TJPs) wie Zona ocludin-1 (ZO-1) und Zytoskelettproteine wie F-Aktin untersucht, wie zuvor veröffentlicht8. Die TJP-Bewertung ist eine bequemere Methode zur Bewertung der BRB-Integrität und Barrierefunktion, die keine teure Ausrüstung erfordert, die möglicherweise nicht in allen Forschungslabors verfügbar ist, im Gegensatz zur EM-Bewertung oder TER.

Die primäre RPE-Isolierung ist eine Technik, die ein wichtiges Werkzeug sein könnte, um die zugrunde liegenden Mechanismen und die Pathogenese zu untersuchen und neue therapeutische Anwendungen für verschiedene Augenerkrankungen vorzuschlagen. Die aktuelle Technik ermöglichte es, die Veränderungen in der RPE-Zellstruktur und -funktion und deren Auswirkungen auf die äußere BRB bei altersbedingter Makuladegenerationzu untersuchen 8. Darüber hinaus half es bei der Untersuchung der Veränderungen in RPE-Zellen, die aus Wildtyp-C57BL6-Mäusen und verschiedenen genetisch veränderten Mäusen isoliert wurden, sowie beim Testen der verschiedenen pharmakologischen Verbindungen, die ein therapeutisches Ziel für AMD14,16 suchen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass viele verfügbare veröffentlichte Protokolle die primäre RPE-Isolierung von Mäusen zeigten. Das vorgestellte Protokoll ist ein vereinfachtes Verfahren, das sich aus der Änderung einiger bestehender Protokolle ergibt, wobei Material, Methoden und Geräte verwendet werden, die in den meisten Forschungslabors verfügbar sind, um primäre RPE-Zellen aus Mausaugen zu isolieren.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären, die für den Inhalt dieses Artikels relevant sind.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) Fonds R01 EY029751-04

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker : 100mL KIMAX 14000
Collagenase from Clostridium histolyticum  Sigma-Aldrich C7657-25MG For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile 13-711-20
DMEM/F12  gibco  11330 Media to grow RPE cells 
Fetal Bovine Serum (FBS) gibco 26140079 For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution gibco 15750-060 For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Scientific 88284 For working enzymes (A&B) 
Heracell VISO 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Hyaluronidase from bovine testes Sigma-Aldrich H3506-500MG For working enzyme A
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL B-D 309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL Grainger 11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody  Abcam, Cambridge, MA, USA ab78036 For IF staining 
Pen Strep gibco 15140-122 For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45 Dumont 72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm GARANA INDUSTRIES 2595
Sorvall St8 Centrifuge ThermoScientific 75007200
Stemi 305 Microscope Zeiss n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel Bard-Parker 371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style Corning 430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style Corning 353003
Tornado Tubes: 15mL Midsci C15B
Tornado Tubes: 50mL Midsci C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25% gibco 2186962 For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips Dumont 501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL Electron Microscopy Sciences Dumont 50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36" McKesson 4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge FST 15000-08
Zeiss AxioImager Z2 Zeiss n/a
Zeiss Zen Blue 2.6 Zeiss n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
  2. Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
  5. Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
  6. Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
  7. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  8. Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
  9. Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
  10. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
  11. Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
  12. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
  13. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  14. Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
  15. van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer's disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
  16. Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
  17. Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
  18. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
  19. Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020).
  21. Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
  22. Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
  23. Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
  24. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).

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Biologie Ausgabe 189

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24th reference was added:

  1. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
Isolierung von primären retinalen pigmentierten Epithelzellen der Maus
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Tomaszewski, R., Rajpurohit, P.,… More

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P., Cheng, M., Tawfik, A. Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. J. Vis. Exp. (189), e63543, doi:10.3791/63543 (2022).

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