Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד של תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית של עכברים ראשוניים

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63543
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,3
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine, 3Oral Biology and Diagnostic Sciences, Dental College of Georgia, Augusta University

ERRATUM NOTICE

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוט לבידוד תאי אפיתל פיגמנטציה ברשתית (RPE) מעיני עכבר באופן מדורג. הפרוטוקול כולל אנוקליזציה ונתיחה של עיני עכבר, ולאחר מכן בידוד, זריעה והתרבות של תאי RPE.

Abstract

שכבת האפיתל הפיגמנטי ברשתית (RPE) נמצאת מיד מאחורי הפוטורצפטורים ומכילה מערכת מטבולית מורכבת הממלאת מספר תפקידים קריטיים בשמירה על תפקודם של הפוטורצפטורים. לפיכך, המבנה והתפקוד של RPE חיוניים לשמירה על ראייה תקינה. כתב יד זה מציג פרוטוקול מבוסס לבידוד תאי RPE של עכבר ראשוני. בידוד RPE הוא כלי נהדר לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפתולוגיה של RPE במודלים שונים של עכברים של הפרעות עיניים. יתר על כן, בידוד RPE יכול לסייע בהשוואת תאי RPE ראשוניים של עכברים שבודדו מעכברים מסוג בר ומעכברים מהונדסים גנטית, כמו גם בבדיקת תרופות שיכולות להאיץ את התפתחות הטיפול בהפרעות ראייה. כתב היד מציג פרוטוקול בידוד RPE שלב אחר שלב; ההליך כולו, מן enucleation כדי זריעה, לוקח בערך 4 שעות. אין לשנות את המדיה במשך 5-7 ימים לאחר הזריעה, כדי לאפשר צמיחה של התאים המבודדים ללא הפרעה. תהליך זה מלווה באפיון של מורפולוגיה, פיגמנטציה וסמנים ספציפיים בתאים באמצעות אימונופלואורסצנציה. ניתן להעביר תאים לכל היותר שלוש או ארבע פעמים.

Introduction

תאי אפיתל פיגמנטי רשתית (RPE) ממוקמים בין הכורואיד לרשתית העצבית, ויוצרים שכבה חד-שכבתית פשוטה של תאים קובואידים הנמצאת מאחורי תאי הפוטורצפטור (PR)1. ה-RPE ממלא תפקיד קריטי בשמירה על סביבה בריאה לתאי PR, בעיקר על ידי הפחתת הצטברות מופרזת של מיני חמצן תגובתי (ROS) ונזקי חמצון כתוצאה מכך1. תאי RPE מפקחים על תפקודים רבים, כגון המרה ואחסון של רטינואידים, קליטת אור מפוזר, הובלת נוזלים ויונים, ופאגוציטוזה של קרום המקטע החיצוני PR 2,3. שינויים ב-RPE (מורפולוגיה/תפקוד) יכולים לפגוע בתפקודם ולהוביל לרטינופתיה וזוהי תכונה משותפת להפרעות עיניים רבות4. מחלות עיניים רבות קשורות לשינויים במורפולוגיה ובתפקוד של תאי RPE, כולל מחלות גנטיות מסוימות כגון רטיניטיס פיגמנטוזה, אמאורוזיס מולד של לבר ולבקנות 4,5,6, כמו גם הפרעות עיניים הקשורות לגיל כגון רטינופתיה סוכרתית (DR) וניוון מקולרי תלוי גיל (AMD)7,8 . תאים אנושיים הם הרצויים ביותר, ולכן זה יהיה אידיאלי לחקור הפרעות RPE בתאי RPE אנושיים ראשוניים ליצירת מונולרים RPE. עם זאת, עניינים אתיים והזמינות המוגבלת של תורמים אנושיים בשל העובדה שרוב ההפרעות הללו מובילות לתחלואה9, אך לא בהכרח לתמותה10, ובכך מונעות בידוד של תאי RPE אנושיים ראשוניים. עובדה זו הופכת את התרבות של תאי RPE מתורמים לא אנושיים של בעלי חיים לחלופה מועדפת. מכרסמים, במיוחד עכברים, נחשבים למודל נהדר לחקר מחלות עיניים שונות מכיוון שטכנולוגיה מהונדסת מבוססת באופן נרחב יותר במינים אלה11. אף על פי שהשימוש בתאי RPE ראשוניים בתרבית מציע יתרונות רבים, היה קשה לשמור על תאים גדלים במשך מעברים רבים, או לאחסן את התאים ולעשות בהם שימוש חוזר. המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא גיל העכברים; עכברים המשמשים לבידוד RPE צריכים להיות בגיל צעיר מאוד (18-21 ימים הוא אופטימלי) מכיוון שהיה קשה לתרבת תאי RPE מעכברים בוגרים11,12,13. ניתן לבודד תאי RPE מעיני עכברים בכל גיל, אולם עד ארבעה מעברי תאים הצליחו רק עם עכברים צעירים (בני 18-21 ימים). בידוד RPE מרשתיות עכברים, תוך שימוש הן בעכברי C57BL6 והן בעכברים מהונדסים עם מחיקת קולטני N-מתיל-D-אספרטט (NMDARs) בתאי ה-RPE, בוצע כדי לחקור את ההשפעה של הומוציסטאין של חומצת אמינו מוגברת על ההתפתחות וההתקדמות של AMD14. בנוסף, תאי RPE ראשוניים מבודדים סייעו בהצעת מטרה טיפולית ל-AMD על ידי עיכוב של NMDARs בתאי RPE14. ישנם כמה חוסמי NMDAR שאושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) ומשמשים כיום לטיפול בבלבול בינוני עד חמור (דמנציה) הקשור למחלת אלצהיימר (AD), כגון ממנטין16, אשר יכול להיות מטרה טיפולית פוטנציאלית עבור AMD14. יתר על כן, תאי RPE ראשוניים מבודדים של עכברים שימשו לזיהוי סמני דלקת ולאינדוקציה המוצעת של דלקת כמנגנון בסיסי לתכונות הנגרמות על ידי הומוציסטאין של AMD ו- AD באמצעות עכבר מהונדס גנטית (CBS), המציג רמה גבוהה של הומוציסטאין16,17.

פרוטוקול זה שימש לבידוד תאי RPE הן מעכברי C57BL/6 מסוג בר והן מעכברים מהונדסים שפותחו במעבדה שלנו כהתאמה פשוטה של פרוטוקולי בידודאחרים שפורסמו 13,18,19 כדי להגיע לפרוטוקול ישים ואמין בקלות. אין העדפת מין בפרוטוקול זה. בעוד שגילי עכברים הם קריטיים לתהליך הבידוד, עכברים צעירים ומבוגרים יותר (גילאי 18-21 יום) ועכברים מבוגרים יותר בכל גיל (עד 12 חודשים) שימשו לבידוד RPE. עם זאת, שמנו לב שתאי ה-RPE שבודדו מהעכברים בגיל צעיר חיו זמן רב יותר, וניתן היה לבצע עד ארבעה מעברים. ניתן היה להעביר את תאי ה-RPE שבודדו מעכברים מבוגרים פעם או פעמיים, ואז הם יפסיקו לגדול בקצב רגיל וישנו את צורתם כך שיהיו מוארכים יותר (תאים דמויי פיברובלסט). כמו כן נצפה אובדן פיגמנטציה וירידה בהידבקות לצלחת תרבית הרקמה ואחריה ניתוק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

נעשה שימוש בבעלי חיים בהתאם להנחיות פרוטוקול החיות IACUC של אוניברסיטת אוקלנד מספר 21063 וההנחיות של הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים בחקר עיניים וראייה.

1. הכנת פתרון

  1. הכינו את מדיית תרבית תאי ה-RPE המלאה על ידי השלמת תערובת הנשר המתוקן הבינוני/מזין F-12 (DMEM/F12) של דולבקו עם 25% סרום בקר עוברי (FBS), 1.5% פניצילין/סטרפטומיצין ו-0.02% גנטמיצין.
  2. הכינו את אנזים A על ידי תוספת של 741 μL של תמיסת המלח המאוזנת (HBSS) של Hank עם 127 μL של תמיסת מלאי קולגן ו-132 μL של תמיסת מלאי היאלורונידאז. זה עושה נפח סופי של 1 מ"ל, אשר יכול לטפל ארבע עיניים.
    1. הכינו את תמיסת מלאי הקולגן על ידי המסת 1 מ"ג קולגן מקלוסטרידיום היסטוליטיקום ב-41 מ"ל של HBSS (19.5 יחידות למ"ל).
    2. הכינו את תמיסת המלאי של היאלורונידאז על ידי המסת 1 מ"ג של היאלורונידאז מאשכי בקר ב-18.4 מ"ל של HBSS (38 יחידות למ"ל).
  3. הכינו את אנזים B על-ידי הוספת שני חלקים של 0.25% טריפסין-EDTA לשלושה חלקים של HBSS. שים לב שהנפח הכולל תלוי במספר העיניים שנותחו; ניתן להשתמש ב-1 מ"ל של אנזים B לטיפול בארבע עיניים.

2. אנוקליזציה

  1. המתת עכבר באופן אתי באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני (CO2) בהתאם לתקני IACUC21.
    1. בקצרה, מקם את בעלי החיים בתא CO 2 כדי להציג 100% CO 2 עם קצב מילוי של 30%-70% מנפח התא לדקה עם CO 2 כדי להשיג חוסר הכרה תוך2 עד 3 דקות, עם מצוקה מינימלית לעכברים.
    2. אשר מוות (חוסר נשימה וצבע עיניים דהוי), ולאחר מכן להעביר את העכבר מן הכלוב לאזור כירורגי מעוקר נקי (קרצוף עם אלכוהול) מצויד בציוד כירורגי מעוקר.
  2. הנח את העכבר על משטח תחתון סטרילי.
  3. נצנום את העיניים על ידי לחיצה על פינצטה בסגנון 5/45 על אזור המסלול כדי לגרום לפרופטוזה, ולאחר מכן הזזת הפינצטה לחלק האחורי של העין. חלץ את העיניים, עם עצב הראייה שלם, על ידי משיכת העיניים בעדינות מחלל המסלול.
  4. באמצעות מלקחיים, לטבול את העיניים בצינור microcentrifuge 2 מ"ל המכיל 1mL של 5% Povidone-יוד. לדגור את העיניים בטמפרטורת החדר במשך 2-3 דקות.
  5. הסר את העיניים מתמיסת פובידון-יוד והנח אותן בצלחת פטרי. באמצעות פיפטה העברה סטרילית, לשטוף את העיניים עם HBSS עד צבע כתום של פובידון-יוד נעלם. זה לוקח בערך שתיים או שלוש כביסות.
  6. הניחו את העיניים בצלחת פטרי חדשה בקוטר 60 מ"מ וטבלו אותן בקור (2-8 מעלות צלזיוס) במדיית תרבית תאי RPE מלאה שהוכנה בשלב 1.1.

3. דיסקציה

  1. תחת מיקרוסקופ כירורגי, השתמש בפינצטה בסגנון M5S ובמספריים של Vannas כדי להסיר את רקמת החיבור והשרירים החוץ-עיניים.
    הערה: הדיסקציה נעשית מתחת למכסה המנוע של הרקמה בסביבה סטרילית לחלוטין. עם זאת, למטרות וידאו, המיקרוסקופ המנתח הוצב מחוץ למכסה המנוע כדי להשיג הדגמה/צילום באיכות גבוהה יותר. הנחת פיסת נייר טישו קטנה ללא מוך מתחת לעין משפרת את היציבות במהלך הנתיחה. לאחר מכן ניתן להחזיק את העיניים באופן זמני (לא יותר משעה) במדיה של תרבית תאי RPE קרים. עם זאת, עדיף להמשיך ישירות לשלב הבא מיד לאחר ניקוי העיניים.
  2. העבירו את העיניים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של תמיסת אנזים A לכל ארבע עיניים. לאחר מכן, לדגור את העיניים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות.
  3. הסר את העיניים מן האינקובטור ואת צינור microcentrifuge. לאחר מכן, העבירו אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש המכיל 1 מ"ל של תמיסת אנזים B לכל ארבע עיניים. לדגור את הצינור באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 50 דקות.
  4. הניחו את העיניים בצלחת תרבית תרחיף חדשה בקוטר 60 מ"מ המכילה 10 מ"ל של מדיית גידול מלאה של תאי RPE. לאחר מכן לדגור את העיניים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
  5. מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ כירורגי ומתחילים לנתח.
  6. הסר את החלק הקדמי של העין (קרנית, איריס ועדשה) מהחלק האחורי של העין (הרשתית האחורית).
    1. תפסו את העין עם מלקחיים בסגנון M5S ובצעו חתך בקטע ora serrata (החלק הקדמי ביותר של הרשתית שבו מסתיים התכלת) עם להב #11 או מחט של מזרק.
    2. תפסו את החלק הפנימי של החתך עם זוג מלקחיים אחד, ותפסו את הקרנית עם זוג מלקחיים נוסף. מתחילים למשוך או לקרוע לאט את הקרנית מהרשתית. הקפידו לקרוע במרווחים קטנים ולרדת מהקרע תוך כדי הסרת הקרנית, כדי להבטיח שה-RPE יישאר ברובו שלם ויגרום לקרע נקי יותר.
      הערה: לאחר ניתוק מוחלט של הקרנית, ניתן לראות את הקשתית והעדשה.
    3. מפרידים גם את הקרנית וגם את הקשתית.
  7. הפרד את העדשה מהעין בדחיסה עדינה של החצי האחורי של העין.
  8. כדי להסיר את הרשתית העצבית משכבת ה-RPE, תפסו את השכבה החיצונית של העין בעזרת זוג פינצטה אחד ומקמו את הזרוע של זוג פינצטה שני בין ה-RPE לשכבות העצביות. משם, משכו בעדינות או הוציאו את הרשתית העצבית הרחק משכבת ה-RPE. יש להשליך את הרשתית העצבית.
    הערה: בסרטון, הרשתית העצבית והעדשה מוסרות יחד. עם זאת, למתחילים, יהיה קל יותר להסיר כל אחד בנפרד. מה שנותר הוא RPE, כורואיד וסקלרה.
  9. יש להשליך את הקרנית, הקשתית, העדשה והרשתית העצבית. העבירו את העינית הנותרת לאזור חדש על המנה נקי מפסולת.
  10. כדי להפריד את ה-RPE מהכורואיד והסקלרה, יש לגרד בעדינות את החלק הפנימי של ה-EYECUP בעזרת פינצטה בסגנון 5/45 כדי להבטיח את הפרדת תאי ה-RPE. תאי ה-RPE נראים מעוננים כאשר הם מושעים במדיית הגדילה המלאה של תאי ה-RPE.
  11. שאפו את התאים באמצעות פיפטה סטרילית של 3.2 מ"ל והעבירו לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל המכיל מדיית גידול מלאה של תאי RPE.

4. צנטריפוגה

  1. מניחים את שפופרת הצנטריפוגה 15 מ"ל המכילה תאי RPE ראשוניים בתוך צנטריפוגה וצנטריפוגה את התאים בגודל 300 x g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. שאפו את הסופר-נאטנט והחזירו את הכדור עם 10 מ"ל של מדיית צמיחה מלאה של RPE. מדיית הגידול המלאה של RPE ספציפית יותר לצמיחת RPE מאשר תאים מזהמים אחרים, כגון תאי מולר או תאי אנדותל כורואידים. תאי מולר זקוקים למדיית גלוקוז גבוהה, בעוד שתאי אנדותל כורואידיים זקוקים לגורמי גדילה ספציפיים. על ידי שינוי המדיה והעברת התרבית, רק תאי ה-RPE ימשיכו לגדול.

5. תרבית תאים

  1. צלחת את תאי ה-RPE הראשוניים שעברו החייאה על צלחת פטרי סטרילית בקוטר 100 מ"מ והעבירו אותם לאינקובטור (לאחר אימות הטוהר על-ידי צביעת תאים בסמנים ספציפיים של תאי RPE/Müller, כפי שמצוין באיור 1E-N). דגירה של התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    הערה: הסמנים שבהם נעשה שימוש מוזכרים בטבלת החומרים. שלב זה מבוצע לאחר הקמת התרבות.
  2. לדגור על התאים במשך כ -5 ימים כדי לגדול. במהלך תקופה זו, אין לשנות את המדיה, להפריע לתאים, או להזיז את צלחת תרבית התא (זהו שלב קריטי בפרוטוקול; לאחר בידוד, התאים צריכים להיות דגירה ולא להיות מופרע במשך 5 ימים).
    הערה: מספר התאים תלוי במספר העיניים המשמשות לבידוד. מספר גדול יותר של עיניים מבודדות יניב מספר גדול יותר של תאים. בידוד RPE משתי עיניים יניב ~ 440,000-880,000 תאים, או 5%-10% מצלחת פטרי 100 מ"מ, שיכולה להכיל 8.8 מיליון תאים.

6. מעבר

  1. שאפו את התקשורת ושטפו עם 2 מ"ל של PBS. לאחר מכן שאפו את ה- PBS.
  2. מוסיפים 4 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA (1x), או מספיק כדי לכסות את בסיס המנה. דגירה במשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הוסף 8 מ"ל של מדיית RPE שחוממה מראש או פי שניים מהנפח של כמות הטריפסין ששימשה בשלב 6.2. לאחר מכן לאסוף את התאים ולמקם אותם בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
  4. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופר-נאטנט והחזירו את הכדור ב-10 מ"ל של מדיה מלאה של תרבית תאי RPE. צלחת את כל המתלה בצלחת סטרילית 100 מ"מ פטרי.
    הערה: ניתן להעביר את התאים עד ארבע או חמש פעמים18. עם זאת, תוצאות הניסוי העקביות ביותר נמצאות לאחר שניים או שלושה מעברים. לאחר שניים עד ארבעה מעברים, התאים שינו את צורתם (כפי שניתן לראות באיור 1D) כך שיהיו מוארכים יותר, הצטברו במרכז הצלחת, הפסיקו לגדול והתנתקו.
  5. השתמש בפרוטוקולים אימונופלואורסצנטיים, בהתאם לשיטות שפורסמו בעבר 8,14,15,16, כדי להכתים ולאמת את הספציפיות של RPE.

7. אימונופלואורסצנציה

הערה: אימונופלואורסצנציה בוצעה לפי השיטות שפורסמו בעבר 8,14,15,16,17,18 כדי להכתים ולאמת את הספציפיות של RPE. הצביעה של תאי RPE ראשוניים נעשתה בדרך כלל במעברים P1 ו-P2. כאן, סקירה קצרה של פרוטוקול immunofluorescent מוצג.

  1. זרע את התאים על שקופית תא תרבית תאים (30,000 תאים לכל באר עבור שקופית תא 8 בארות).
  2. תרבית את התאים במדיית תרבית תאי RPE מלאה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24-48 שעות.
  3. כאשר התאים נפגשים ב-80%-90%, שאפו החוצה את המדיה ושטפו את שקופית התא עם PBS אחד.
  4. תקן את השקופית עם 4% paraformaldehyde במשך 10-15 דקות.
  5. שאף החוצה את 4% paraformaldehyde ולאחר מכן לחסום עם פתרון חסימה (ראה טבלת חומרים).
  6. שאפו את תמיסת החסימה והוסיפו את הנוגדן העיקרי, RPE65, ודגרה במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (עם ריכוז נוגדנים הנע בין 1:200-1:250 במאגר חוסם, בנפח של 150-200 μL/slide). לאחר מכן, יש לכבס שלוש פעמים עם PBS/TX-100 (5-10 דקות כל כביסה).
  7. שאפו את הנוגדן הראשוני והוסיפו את הנוגדן המשני (עם ריכוז נוגדנים 1:1,000 במאגר חוסם, בנפח של 150-200 μL/slide). דגירה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.
  8. שאפו את הנוגדן המשני. יש לכבס שלוש פעמים עם PBS/Trtion X-100 (5-10 דקות כל כביסה).
  9. הוסף טיפה של מדיום הרכבה DAPI כדי לסמן את הגרעינים והנח כיסוי מעל המגלשה. ודא שאין בועות מתחת לכיסוי.
  10. לאחר מכן, צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, בליווי מצלמת מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה (HRM) ותוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלת חומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אימות הספציפיות, הטוהר ותפקוד המחסום/היווצרות של תאי RPE מבודדים
התאים שבודדו נבדקו תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא את הכדאיות, המורפולוגיה והפיגמנטציה שלהם. תמונות מ-P0 ו-P1 (איור 1A,B) ותמונות מ-P0 ו-P4 צולמו (איור 1C,D) כדי להראות את השינויים בתאים; צורה, גודל ופיגמנטציה ככל שהמעברים התקדמו למעבר הרביעי (חצים שחורים מצביעים על תאי ה-RPE המבודדים ב-P4). נוגדן לחלבון RPE65 שימש לאימות זהותם של התאים המבודדים. צביעה אימונופלואורסצנטית של התאים המבודדים בוצעה עם נוגדן כנגד RPE65, ולאחר מכן בדיקה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1E,F: הגדלה נמוכה, ואיור 1G,H: הגדלה גבוהה, מראה תאי RPE מוכתמים חיובית בירוק וסמן גרעיני, DAPI, בכחול). RPE65 הוא איזומרוהידרולאז המתבטא ב-RPE. הוא חיוני להתחדשות הפיגמנט החזותי הנדרש לראייה בתיווך מוטות וחרוטים21 . כדי לאמת את פונקציית המחסום של המבודדים
נעשה שימוש בתאים, הן חלבון ציטוסקטלי F-אקטין והן חלבון צומת הדוק ZO-1 מכתים8 עבור התאים המבודדים (איור 1I,J: ZO-1 ירוק והכתמה גרעינית כחולה). ואיור 1K,L: F-אקטין אדום וכתמים גרעיניים כחולים). עם זאת, הצורה המרוצפת הטיפוסית של ה-RPE ניכרת מאוד כאשר התאים נפגשים באופן מלא.

בניסויים נעשה שימוש בבקרה שלילית שבה הנוגדן המשני נוסף לתאי ה-RPE מבלי להוסיף את הנוגדן הראשוני, כדי לוודא שהספציפיות של הנוגדן והצבע המתקבל הם ספציפיים לנוגדנים שבהם נעשה שימוש (לא הוצגו).

כדי לאמת את הטוהר והזיהום של ה-RPE המבודד על-ידי תאי מולר, נעשה שימוש בצביעה אימונופלואורסצנטית של התאים המבודדים עם סמן תאים ספציפי לתאי מולר, וימנטין, (ירוק וכחול להכתמה גרעינית כפי שמוצג באיור 1M,N) תוך שימוש בתאי מולר כבקרה חיובית. תאי RPE מבודדים הראו כתמים שליליים על וימנטין.

התאים שבודדו נבדקו תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא את הכדאיות, המורפולוגיה והפיגמנטציה שלהם. תמונות מ-P0 ו-P1 (איור 1K,L) ותמונות מ-P0 ו-P4 צולמו (איור 1M,N) כדי להראות את השינויים בצורה, בגודל ובפיגמנטציה של התאים ככל שהמעברים התקדמו למעבר הרביעי (חצים שחורים מצביעים על תאי ה-RPE המבודדים ב-P4).

Figure 1
איור 1: אימות בידוד RPE. (A) מיקרוסקופ אור עבור אפס מעבר RPE (P0). (B) מיקרוסקופ אור למעבר RPE אחד (P1). (C) אפיון מורפולוגיה ב-P0. (D) אפיון מורפולוגיה בעמ' 4. (E) חיסון עבור RPE65 בהגדלה נמוכה. (F) חיסון עבור RPE65 עם צביעה גרעינית עם DAPI. (G) חיסון עבור RPE65 בהגדלה גבוהה. (H) חיסון עבור RPE65 עם צביעה גרעינית עם DAPI בהגדלה גבוהה. (I) צביעת ZO-1 עבור תאי RPE. (G) צביעת ZO-1 עבור תאי RPE עם צביעה גרעינית עם DAPI. (K) צביעת F-אקטין עבור תאי RPE. (L) צביעת F-אקטין עבור תאי RPE עם צביעה גרעינית עם DAPI. (M) צביעת וימנטין לתאי RPE. (N) צביעת וימנטין עבור תאי מולר כבקרה חיובית (RMc-1) עם צביעה גרעינית עם DAPI. סרגלי קנה מידה שווים ל- 300 מיקרומטר, 20 מיקרומטר, 300 מיקרומטר, 300 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, 50 מיקרומטר ו- 50 מיקרומטר, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי הוא הליך מפורט מדווח, שונה ופשוט לבידוד RPE מעיני עכבר. הפרוטוקול כולל אנוקליציה, דיסקציה, איסוף, זריעה, תרבית ואפיון של תאי RPE שבודדו מעיני עכבר.

ישנן כמה מגבלות וצעדים קריטיים שיש למלא לבידוד RPE מוצלח, כגון גיל העכברים, מספר העיניים שנותחו, גודל צלחת תרבית הרקמה או המנה, ואזהרות לאחר זריעה, אחסון והעברה. כדי להיות מסוגלים להעביר את התאים המבודדים עד שלוש או ארבע פעמים, העכברים הטובים ביותר הגילאים הם בין 18-21 ימים. כדי שיהיה מספר סביר של תאים מבודדים המסוגלים לגדול ולהתרבות, יש צורך בשתי עיניים לפחות לבידוד יחיד. מספר התאים הגורמים לבידוד הוא פרופורציונלי למספר העיניים שנותחו (~220,000 תאים/עין). מומלץ להשתמש בצלחת/בקבוק פטרי סטרילי בקוטר 100 מ"מ כדי להשיג מספר גדול יותר של תאים במעבר מוקדם (P0). לאחר זריעה, תאים לא צריך להיות מופרע על ידי הזזת צלחת תרבית רקמה מן האינקובטור או על ידי שינוי התקשורת לפחות 5 ימים. כמו כן, אחת המגבלות של טכניקה זו היא אחסון ומעבר של תאים מבודדים. לא ניתן לאחסן תאים (להקפיא ולהפילם) וניתן להעבירם רק שלוש או ארבע פעמים. לאחר מעבר 4, תאים מתחילים לשנות את גודלם וצורתם כדי להפוך למוארכים (צורת ציר) עם ירידה ניכרת בפיגמנטציה של התאים (איור 1D).

פרוטוקול זה שונה מפרוטוקולים אחרים בעלי ערך ואמינים שפורסמו עבור בידוד RPE עכבר ראשי1 3,19,20 בכך שהוא פשוט עם כמה צעדים שקל לעקוב אחריהם. תאי RPE מסוגלים להיות מזוהים על ידי המורפולוגיה שלהם, פיגמנטציה, וסמני RPE ספציפיים כגון RPE65 4,5,21. אימות הטוהר והזיהום של תאי מולר הושג על ידי צביעת תאים מבודדים בסמן תאים ספציפי לתאי מולר (וימנטין)22. טכניקות רבות שימשו להערכת שלמות מחסום הדם-רשתית (BRB) במבחנה, כגון בדיקת מיקרוסקופ אלקטרונים (EM), הערכה של חלבוני צומת הדוקים (TJPs), בדיקת דליפת דקסטרן FITIC ומדידת התנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית (TER) המעריכה את התפקוד הפיזיולוגי של RPE כמונולאייר 8,23 . תאי RPE ממלאים תפקיד חשוב בשמירה על ה-BRB החיצוני, וכדי לאמת פונקציה זו, הערכנו חלבוני צומת הדוקים (TJPs) כגון Zona ocludin-1 (ZO-1) וחלבונים ציטוסקטליים כמו F-actin כפי שפורסם בעבר8. הערכת TJPs היא שיטה נוחה יותר להערכת שלמות BRB ותפקוד מחסום שאינה דורשת ציוד יקר שאולי לא יהיה זמין בכל מעבדות המחקר, בניגוד להערכת EM או TER.

בידוד RPE ראשוני הוא טכניקה שיכולה להיות כלי חשוב לחקר מנגנונים בסיסיים ופתוגנזה, ולהצעת יישומים טיפוליים חדשים למחלות עיניים שונות. הטכניקה הנוכחית אפשרה לחקור את השינויים במבנה ובתפקוד של תאי RPE ואת השפעתם על ה-BRB החיצוני בניוון מקולרי תלוי גיל8. יתר על כן, הוא סייע בחקר השינויים בתאי RPE שבודדו מעכברי C57BL6 מסוג בר ועכברים שונים מהונדסים גנטית, כמו גם בבדיקת התרכובות הפרמקולוגיות השונות המחפשות מטרה טיפולית עבור AMD14,16.

לסיכום, פרוטוקולים רבים שפורסמו הדגימו בידוד RPE ראשוני של עכבר. הפרוטוקול המוצג הוא הליך פשוט הנובע משינוי כמה פרוטוקולים קיימים, תוך שימוש בחומר, שיטות וציוד הזמינים ברוב מעבדות המחקר כדי לבודד תאי RPE ראשוניים מעיני עכבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר כי הם רלוונטיים לתוכן מאמר זה.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לעיניים (NEI), קרן מכון העיניים הלאומי (NEI) R01 EY029751-04

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker : 100mL KIMAX 14000
Collagenase from Clostridium histolyticum  Sigma-Aldrich C7657-25MG For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile 13-711-20
DMEM/F12  gibco  11330 Media to grow RPE cells 
Fetal Bovine Serum (FBS) gibco 26140079 For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution gibco 15750-060 For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Scientific 88284 For working enzymes (A&B) 
Heracell VISO 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Hyaluronidase from bovine testes Sigma-Aldrich H3506-500MG For working enzyme A
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL B-D 309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL Grainger 11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody  Abcam, Cambridge, MA, USA ab78036 For IF staining 
Pen Strep gibco 15140-122 For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45 Dumont 72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm GARANA INDUSTRIES 2595
Sorvall St8 Centrifuge ThermoScientific 75007200
Stemi 305 Microscope Zeiss n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel Bard-Parker 371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style Corning 430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style Corning 353003
Tornado Tubes: 15mL Midsci C15B
Tornado Tubes: 50mL Midsci C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25% gibco 2186962 For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips Dumont 501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL Electron Microscopy Sciences Dumont 50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36" McKesson 4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge FST 15000-08
Zeiss AxioImager Z2 Zeiss n/a
Zeiss Zen Blue 2.6 Zeiss n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
  2. Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
  5. Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
  6. Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
  7. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  8. Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
  9. Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
  10. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
  11. Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
  12. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
  13. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  14. Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
  15. van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer's disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
  16. Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
  17. Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
  18. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
  19. Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020).
  21. Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
  22. Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
  23. Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
  24. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).

Tags

ביולוגיה גיליון 189

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24th reference was added:

  1. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
בידוד של תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית של עכברים ראשוניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P.,… More

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P., Cheng, M., Tawfik, A. Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. J. Vis. Exp. (189), e63543, doi:10.3791/63543 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter