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Biology

Isolamento delle cellule primarie dell'epitelio pigmentato retinico del topo

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63543
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,3
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine, 3Oral Biology and Diagnostic Sciences, Dental College of Georgia, Augusta University

ERRATUM NOTICE

Summary

Questo manoscritto descrive un protocollo semplificato per l'isolamento delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi dei topi in modo graduale. Il protocollo include l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule RPE.

Abstract

Lo strato di epitelio pigmentato retinico (RPE) si trova immediatamente dietro i fotorecettori e ospita un complesso sistema metabolico che svolge diversi ruoli critici nel mantenimento della funzione dei fotorecettori. Pertanto, la struttura e la funzione RPE sono essenziali per sostenere la visione normale. Questo manoscritto presenta un protocollo stabilito per l'isolamento delle celle RPE primarie del topo. L'isolamento RPE è un ottimo strumento per studiare i meccanismi molecolari alla base della patologia RPE nei diversi modelli murini di disturbi oculari. Inoltre, l'isolamento RPE può aiutare a confrontare le cellule RPE primarie di topo isolate da topi wild-type e geneticamente modificati, oltre a testare farmaci che possono accelerare lo sviluppo della terapia per i disturbi visivi. Il manoscritto presenta un protocollo di isolamento RPE passo-passo; L'intera procedura, dall'enucleazione alla semina, richiede circa 4 ore. Il terreno non deve essere cambiato per 5-7 giorni dopo la semina, per consentire la crescita delle cellule isolate senza disturbi. Questo processo è seguito dalla caratterizzazione della morfologia, della pigmentazione e dei marcatori specifici nelle cellule tramite immunofluorescenza. Le celle possono essere fatte passare un massimo di tre o quattro volte.

Introduction

Le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) si trovano tra la coroide e la retina neurale, formando un semplice monostrato di cellule cuboidali che si trova dietro le cellule dei fotorecettori (PR)1. L'RPE svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento di un ambiente sano per le cellule PR, principalmente riducendo l'eccessivo accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il conseguente danno ossidativo1. Le cellule RPE sovrintendono a molte funzioni, come la conversione e lo stoccaggio dei retinoidi, l'assorbimento della luce diffusa, il trasporto di fluidi e ioni e la fagocitosi della membrana del segmento esterno PR 2,3. Alterazioni dell'RPE (morfologia/funzione) possono compromettere la loro funzione portando alla retinopatia e questa è una caratteristica comune condivisa da molti disturbi oculari4. Molte malattie oculari sono associate ad alterazioni della morfologia e della funzione delle cellule RPE, tra cui alcune malattie genetiche come la retinite pigmentosa, l'amaurosi congenita di Leber e l'albinismo 4,5,6, nonché disturbi oculari legati all'età come la retinopatia diabetica (DR) e la degenerazione maculare legata all'età (AMD)7,8 . Le cellule umane sono le più desiderabili, quindi sarebbe ideale studiare i disturbi RPE nelle cellule RPE umane primarie per formare monostrati RPE. Tuttavia, le questioni etiche e la limitata disponibilità di donatori umani a causa del fatto che la maggior parte di questi disturbi portano alla morbilità9, ma non necessariamente alla mortalità10, impediscono così l'isolamento delle cellule RPE umane primarie. Ciò rende la coltura di cellule RPE da donatori animali non umani un'alternativa preferita. I roditori, in particolare i topi, sono considerati un ottimo modello per lo studio di diverse malattie oculari poiché la tecnologia transgenica è più ampiamente affermata in queste specie11. Anche se l'uso di cellule RPE primarie in coltura offre molti vantaggi, è stato difficile mantenere le cellule in crescita per molti passaggi, o immagazzinare e riutilizzare le cellule. La principale limitazione di questo protocollo è l'età dei topi; i topi utilizzati per l'isolamento RPE dovrebbero essere di età molto giovane (18-21 giorni è ottimale) poiché è stato difficile coltivare cellule RPE da topi adulti11,12,13. Le cellule RPE possono essere isolate dagli occhi dei topi a qualsiasi età, tuttavia fino a quattro passaggi cellulari hanno avuto successo solo con topi giovani (18-21 giorni di età). L'isolamento RPE dalle retine di topo, utilizzando sia topi C57BL6 che topi transgenici con delezione dei recettori N-metil-D-aspartato (NMDAR) nelle cellule RPE, è stato eseguito per studiare l'effetto dell'omocisteina aminoacidica elevata sullo sviluppo e la progressione dell'AMD14. Inoltre, cellule RPE primarie isolate hanno contribuito a proporre un bersaglio terapeutico per AMD mediante l'inibizione degli NMDAR alle cellule RPE14. Ci sono alcuni bloccanti NMDAR che sono approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) e sono attualmente utilizzati per trattare la confusione da moderata a grave (demenza) correlata alla malattia di Alzheimer (AD), come la memantina16, che potrebbe essere un potenziale bersaglio terapeutico per AMD14. Inoltre, cellule RPE primarie di topo isolate sono state utilizzate per la rilevazione di marcatori infiammatori e l'induzione proposta dell'infiammazione come meccanismo sottostante per le caratteristiche indotte dall'omocisteina di AMD e AD utilizzando un topo geneticamente modificato (CBS), che presenta un alto livello di omocisteina16,17.

Questo protocollo è stato utilizzato per isolare le cellule RPE sia da topi C57BL / 6 wild-type che da topi transgenici sviluppati nel nostro laboratorio come adattamento semplificato di altri protocolli di isolamento pubblicati13,18,19 per raggiungere un protocollo facilmente applicabile e affidabile. Non c'è preferenza sessuale in questo protocollo. Mentre l'età dei topi è fondamentale per il processo di isolamento, per l'isolamento RPE sono stati utilizzati topi giovani e anziani (18-21 giorni) e topi più anziani di qualsiasi età (fino a 12 mesi). Tuttavia, abbiamo notato che le cellule RPE isolate dai topi di giovane età vivevano più a lungo e potevano essere eseguiti fino a quattro passaggi. Le cellule RPE isolate dai topi più anziani potrebbero essere fatte passare una o due volte, quindi smetterebbero di crescere a un ritmo normale e cambierebbero la loro forma per essere più allungate (cellule simili ai fibroblasti). È stata osservata anche perdita di pigmentazione e diminuzione dell'adesione alla piastra di coltura tissutale seguita da distacco.

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Protocol

Gli animali sono stati utilizzati secondo le linee guida del protocollo animale IACUC dell'università di Oakland numero 21063 e le linee guida della dichiarazione ARVO per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva.

1. Preparazione della soluzione

  1. Preparare il terreno di coltura cellulare RPE completo integrando il mezzo di coltura Modified Eagle / Nutrient Mixture F-12 di Dulbecco (DMEM / F12) con il 25% di siero bovino fetale (FBS), l'1,5% di penicillina / streptomicina e lo 0,02% di gentamicina.
  2. Preparare l'enzima A integrando 741 μL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con 127 μL di soluzione madre di collagenasi e 132 μL di soluzione madre di ialuronidasi. Questo rende un volume finale di 1 ml, che può trattare quattro occhi.
    1. Preparare la soluzione madre di collagenasi sciogliendo 1 mg di collagenasi da Clostridium histolyticum in 41 mL di HBSS (19,5 unità/ml).
    2. Preparare la soluzione madre di ialuronidasi sciogliendo 1 mg di ialuronidasi dai testicoli bovini in 18,4 mL di HBSS (38 unità/ml).
  3. Preparare l'enzima B aggiungendo due parti di tripsina-EDTA allo 0,25% a tre parti di HBSS. Si noti che il volume totale dipende dal numero di occhi sezionati; 1 mL di enzima B può essere usato per trattare quattro occhi.

2. Enucleazione

  1. Praticare eticamente l'eutanasia del topo usando l'inalazione di anidride carbonica (CO2) secondo gli standard IACUC21.
    1. In breve, posizionare l'animale (i) nella camera CO 2 per introdurre il 100% di CO 2 con un tasso di riempimento del 30% -70% del volume della camera al minuto con CO 2 per ottenere l'incoscienza entro2 o 3 minuti, con un disagio minimo per i topi.
    2. Confermare la morte (mancanza di respirazione e colore degli occhi sbiadito), quindi spostare il topo dalla gabbia a un'area chirurgica sterilizzata pulita (lavata con alcool) dotata di attrezzature chirurgiche sterilizzate.
  2. Posizionare il mouse su un sottobosco sterile.
  3. Enucleare gli occhi premendo 5/45 pinzette stile sull'area orbitale per indurre la proptosi, seguita spostando le pinzette nella parte posteriore dell'occhio. Estrarre gli occhi, con il nervo ottico intatto, tirando delicatamente gli occhi dalla cavità orbitale.
  4. Utilizzando una pinza, immergere gli occhi in una provetta da microcentrifuga da 2 ml contenente 1 ml di Povidone-Iodio al 5%. Incubare gli occhi a temperatura ambiente per 2-3 min.
  5. Rimuovere gli occhi dalla soluzione di povidone-iodio e metterli in una capsula di Petri. Utilizzando una pipetta di trasferimento sterile, lavare gli occhi con HBSS fino a quando il colore arancione del povidone-iodio è sparito. Questo richiede circa due o tre lavaggi.
  6. Collocare gli occhi in una nuova capsula di Petri da 60 mm e immergerli in terreni di coltura cellulare RPE completi a freddo (2-8 °C) preparati al punto 1.1.

3. Dissezione

  1. Sotto un microscopio chirurgico, utilizzare pinzette in stile M5S e forbici Vannas per rimuovere il tessuto connettivo e i muscoli extraoculari.
    NOTA: La dissezione viene eseguita sotto una cappa di tessuto in un ambiente completamente sterile. Tuttavia, per scopi video, il microscopio da dissezione è stato posizionato all'esterno del cofano per ottenere una dimostrazione / ripresa di qualità superiore. Posizionare un piccolo pezzo di carta velina priva di lanugine sotto l'occhio migliora la stabilità durante la dissezione. Gli occhi possono quindi essere trattenuti temporaneamente (non per più di 1 ora) nel terreno di coltura cellulare RPE freddo. Tuttavia, è preferibile procedere direttamente al passaggio successivo immediatamente dopo aver pulito gli occhi.
  2. Trasferire gli occhi in una provetta da microcentrifuga da 2 mL contenente 1 mL di soluzione di Enzima A ogni quattro occhi. Quindi, incubare gli occhi in un'incubatrice a 37 ° C per 40 minuti.
  3. Rimuovere gli occhi dall'incubatore e dal tubo della microcentrifuga. Quindi, trasferirli in una nuova provetta da microcentrifuga contenente 1 ml di soluzione di enzima B ogni quattro occhi. Incubare il tubo in un'incubatrice a 37 °C per 50 minuti.
  4. Posizionare gli occhi in un nuovo piatto di coltura in sospensione da 60 mm contenente 10 ml di terreno di coltura cellulare RPE completo. Quindi incubare gli occhi a 4 °C per 30 minuti.
  5. Posizionare il piatto sotto un microscopio chirurgico e iniziare a sezionare.
  6. Rimuovere la parte anteriore dell'occhio (cornea, iride e lente) dalla parte posteriore della coppa oculare (retina posteriore).
    1. Afferrare l'occhio con una pinza stile M5S e fare un'incisione nella sezione ora serrata (parte più anteriore della retina dove termina l'azzurro) con una lama #11 o l'ago di una siringa.
    2. Afferrare la parte interna dell'incisione con un paio di pinze e afferrare la cornea con un altro paio di pinze. Inizia a tirare o strappare lentamente la cornea dalla retina. Assicurati di strappare in piccoli incrementi e spostarti verso il basso mentre rimuovi la cornea, per assicurarti che l'RPE rimanga per lo più intatto e si traduca in una lacrima più pulita.
      NOTA: Una volta che la cornea è completamente staccata, l'iride e la lente possono essere viste.
    3. Separare sia la cornea che l'iride.
  7. Separare la lente dalla concia oculare con una leggera compressione della metà posteriore dell'occhio.
  8. Per rimuovere la retina neurale dallo strato RPE, afferrare lo strato esterno della concia oculare con un paio di pinzette e posizionare il braccio di un secondo paio di pinzette tra l'RPE e gli strati neurali. Da lì, tirare delicatamente o raccogliere la retina neurale lontano dallo strato RPE. Scartare la retina neurale.
    NOTA: Nel video, la retina neurale e la lente vengono rimosse insieme. Tuttavia, per i principianti, sarà più facile rimuovere ciascuno separatamente. Ciò che rimane è l'RPE, la coroide e la sclera.
  9. Scartare la cornea, l'iride, la lente e la retina neurale. Spostare la concia oculare rimanente in una nuova area del piatto priva di detriti.
  10. Per separare l'RPE dalla coroide e dalla sclera, raschiare delicatamente l'interno della concia oculare con una pinzetta stile 5/45 per garantire la separazione delle cellule RPE. Le celle RPE appaiono torbide quando sospese nel mezzo di crescita completo delle celle RPE.
  11. Aspirare le cellule utilizzando una pipetta di trasferimento sterile da 3,2 mL e trasferirle in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL contenente un mezzo di crescita completo delle cellule RPE.

4. Centrifugazione

  1. Posizionare la provetta da centrifuga da 15 mL contenente celle RPE primarie all'interno di una centrifuga e centrifugare le celle a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
  2. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet con 10 ml di terreno di crescita RPE completo. Il mezzo di crescita RPE completo è più specifico per la crescita RPE rispetto ad altre cellule contaminanti, come le cellule di Müller o le cellule endoteliali coroideali. Le cellule di Müller richiedono un alto contenuto di glucosio, mentre le cellule endoteliali coroideali richiedono fattori di crescita specifici. Cambiando i terreni e passando la coltura, solo le cellule RPE continueranno a crescere.

5. Coltura cellulare

  1. Placcare le celle RPE primarie risospese su una capsula di Petri sterile da 100 mm e trasferirle in un incubatore (dopo aver verificato la purezza colorando le cellule con specifici marcatori cellulari RPE/Müller, come indicato nella Figura 1E-N). Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2.
    NOTA: I marcatori utilizzati sono menzionati nella tabella dei materiali. Questo passaggio viene eseguito dopo che la coltura è stata stabilita.
  2. Incubare le cellule per circa 5 giorni per crescere. Durante questo periodo, non cambiare il supporto, disturbare le cellule o spostare la piastra di coltura cellulare (questo è un passaggio critico nel protocollo; dopo l'isolamento, le cellule devono essere incubate e non essere disturbate per 5 giorni).
    NOTA: Il numero di celle dipende dal numero di occhi utilizzati per l'isolamento. Un maggior numero di occhi isolati produrrà un numero maggiore di cellule. L'isolamento RPE da due occhi produrrà ~ 440.000-880.000 cellule, o il 5% -10% della capsula di Petri da 100 mm, che può contenere 8,8 milioni di cellule.

6. Passaggio

  1. Aspirare il fluido e lavare con 2 mL di PBS. Quindi aspirare il PBS.
  2. Aggiungere 4 ml di tripsina-EDTA allo 0,25% (1x), o abbastanza per coprire la base del piatto. Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
  3. Aggiungere 8 mL di supporto RPE preriscaldato o il doppio del volume della quantità di tripsina utilizzata nel passaggio 6.2. Quindi raccogliere le cellule e metterle in una provetta da centrifuga da 15 ml.
  4. Centrifugare a 300 x g per 7 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di terreno di coltura cellulare RPE completo. Placcare l'intera sospensione in una capsula di Petri sterile da 100 mm.
    NOTA: Le celle possono essere fatte passare fino a quattro o cinque volte18. Tuttavia, i risultati dell'esperimento più coerenti si trovano dopo due o tre passaggi. Dopo due o quattro passaggi, le cellule hanno cambiato forma (come mostrato nella Figura 1D) per essere più allungate, accumulate nel mezzo della piastra, hanno smesso di crescere e si sono staccate.
  5. Utilizzare protocolli di immunofluorescenza, secondo i metodi precedentemente pubblicati 8,14,15,16, per colorare e convalidare la specificità RPE.

7. Immunofluorescenza

NOTA: L'immunofluorescenza è stata eseguita secondo i metodi precedentemente pubblicati 8,14,15,16,17,18 per colorare e convalidare la specificità RPE. La colorazione delle celle RPE primarie è stata tipicamente eseguita nei passaggi P1 e P2. Qui viene presentata una breve panoramica del protocollo immunofluorescente.

  1. Seminare le cellule su un vetrino della camera di coltura cellulare (30.000 cellule per pozzetto per il vetrino della camera a 8 pozzetti).
  2. Coltura delle cellule in terreni di coltura cellulari RPE completi a 37 °C e 5% di CO2 per 24-48 ore.
  3. Quando le celle sono confluenti all'80% -90%, aspirare il fluido e lavare il vetrino della camera con 1x PBS.
  4. Fissare il vetrino con paraformaldeide al 4% per 10-15 minuti.
  5. Aspirare la paraformaldeide al 4% e quindi bloccare con la soluzione bloccante (vedere Tabella dei materiali).
  6. Aspirare la soluzione bloccante e aggiungere l'anticorpo primario, RPE65, e incubare per tre ore a 37 °C (con una concentrazione di anticorpi compresa tra 1:200-1:250 in tampone bloccante, ad un volume di 150-200 μL/vetrino). Quindi, lavare tre volte con PBS / TX-100 (5-10 minuti ogni lavaggio).
  7. Aspirare l'anticorpo primario e aggiungere l'anticorpo secondario (con una concentrazione anticorpale 1:1.000 in tampone bloccante, ad un volume di 150-200 μL/vetrino). Incubare per un'ora a 37 °C.
  8. Aspirare l'anticorpo secondario. Lavare tre volte con PBS/Trtion X-100 (5-10 minuti ogni lavaggio).
  9. Aggiungere una goccia di supporto di montaggio DAPI per etichettare i nuclei e posizionare un coprivetrino sopra il vetrino. Assicurarsi che non ci siano bolle sotto il coprifoglio.
  10. Quindi, scatta immagini con un microscopio fluorescente, accompagnato da una fotocamera per microscopio ad alta risoluzione (HRM) e da un software di elaborazione delle immagini (vedi Tabella dei materiali).

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Representative Results

Validazione della specificità, purezza e funzione/formazione barriera di celle RPE isolate
Le cellule isolate sono state esaminate al microscopio ottico per verificarne la vitalità, la morfologia e la pigmentazione. Sono state catturate immagini da P0 e P1 (Figura 1A,B) e immagini da P0 e P4 (Figura 1C,D) per mostrare i cambiamenti nelle celle; forma, dimensione e pigmentazione man mano che i passaggi procedevano verso il quarto passaggio (le frecce nere puntano alle celle RPE isolate in P4). Un anticorpo per la proteina RPE65 è stato utilizzato per verificare l'identità delle cellule isolate. La colorazione con immunofluorescenza delle cellule isolate è stata eseguita con un anticorpo contro RPE65, seguita da un esame al microscopio fluorescente (Figura 1E, F: basso ingrandimento e Figura 1G, H: alto ingrandimento, che mostra cellule RPE colorate positivamente in verde e un marcatore nucleare, DAPI, in blu). RPE65 è una isomeroidrolasi espressa nell'RPE. È essenziale per la rigenerazione del pigmento visivo richiesto per la visione mediata da bastoncelli e coni21 . Per convalidare la funzione barriera dell'isolato
sono state utilizzate sia la proteina citoscheletrica F-actina che la colorazione immunofluorescenza ZO-1 della proteina a giunzione stretta8 per le cellule isolate (Figura 1I,J: colorazione nucleare verde ZO-1 e blu). e Figura 1K,L: colorazione nucleare rossa F-actina e blu). Tuttavia, la tipica forma a ciottoli dell'RPE è molto evidente quando le cellule sono completamente confluenti.

Il controllo negativo è stato utilizzato negli esperimenti in cui l'anticorpo secondario è stato aggiunto alle cellule RPE senza aggiungere l'anticorpo primario, per assicurarsi che la specificità dell'anticorpo e il colore risultante siano specifici per gli anticorpi utilizzati (non mostrato).

Per convalidare la purezza e la contaminazione dell'RPE isolato da parte delle cellule di Müller, è stata utilizzata la colorazione con immunofluorescenza delle cellule isolate con un marcatore cellulare specifico per le cellule di Müller, la vimentina, (verde e blu per la colorazione nucleare come mostrato nella Figura 1M,N) utilizzando le cellule di Müller come controllo positivo. Le cellule RPE isolate hanno mostrato colorazione negativa per vimentina.

Le cellule isolate sono state esaminate al microscopio ottico per verificarne la vitalità, la morfologia e la pigmentazione. Sono state catturate immagini da P0 e P1 (Figura 1K, L) e immagini da P0 e P4 (Figura 1M, N) per mostrare i cambiamenti nella forma, nelle dimensioni e nella pigmentazione delle cellule mentre i passaggi procedevano al quarto passaggio (le frecce nere puntano alle celle RPE isolate in P4).

Figure 1
Figura 1: Convalida dell'isolamento RPE. (A) Microscopio ottico per RPE passaggio zero (P0). (B) Microscopio ottico per RPE passaggio uno (P1). (C) Caratterizzazione morfologica a P0. (D) Caratterizzazione morfologica a P4. (E) Immunocolorazione per RPE65 a basso ingrandimento. (F) Immunocolorazione per RPE65 con colorazione nucleare con DAPI. (G) Immunocolorazione per RPE65 ad alto ingrandimento. (H) Immunocolorazione per RPE65 con colorazione nucleare con DAPI ad alto ingrandimento. (I) Colorazione ZO-1 per celle RPE. (G) Colorazione ZO-1 per celle RPE con colorazione nucleare con DAPI. (K) Colorazione F-actina per cellule RPE. (L) Colorazione F-actina per cellule RPE con colorazione nucleare con DAPI. (M) Colorazione con vimentina per cellule RPE. (N) Colorazione con vimentina per cellule di Müller come controllo positivo (RMc-1) con colorazione nucleare con DAPI. Le barre della scala sono pari rispettivamente a 300 μm, 20 μm, 300 μm, 300 μm, 50 μm, 10 μm, 50 μm, 50 μm e 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Il protocollo attuale è una procedura dettagliata segnalata, modificata e semplificata per l'isolamento RPE dagli occhi del mouse. Il protocollo include enucleazione, dissezione, raccolta, semina, coltura e caratterizzazione di cellule RPE isolate dagli occhi di topo.

Ci sono alcune limitazioni e passaggi critici che devono essere soddisfatti per un isolamento RPE di successo, come l'età dei topi, il numero di occhi sezionati, le dimensioni della piastra o del piatto di coltura tissutale e le precauzioni dopo la semina, la conservazione e il passaggio. Per essere in grado di far passare le cellule isolate fino a tre o quattro volte, le migliori età dei topi sono tra 18-21 giorni. Per avere un numero ragionevole di cellule isolate che sono in grado di crescere e moltiplicarsi, sono necessari almeno due occhi per l'isolamento singolo. Il numero di cellule risultanti dall'isolamento è proporzionale al numero di occhi sezionati (~ 220.000 cellule / occhio). Si raccomanda una capsula/pallone di Petri sterile da 100 mm per ottenere un numero maggiore di cellule in un passaggio precoce (P0). Dopo la semina, le cellule non devono essere disturbate spostando la piastra di coltura tissutale dall'incubatore o cambiando il terreno per almeno 5 giorni. Inoltre, uno dei limiti di questa tecnica è la conservazione e il passaggio delle cellule isolate. Le cellule non possono essere conservate (congelate e scongelate) e possono essere fatte passare solo tre o quattro volte. Dopo il passaggio 4, le cellule iniziano a cambiare dimensione e forma per diventare allungate (forma del fuso) con una marcata diminuzione della pigmentazione cellulare (Figura 1D).

Questo protocollo è diverso da altri protocolli pubblicati preziosi e affidabili per l'isolamento RPE primario del mouse1 3,19,20 in quanto è semplificato con alcuni passaggi facili da seguire. Le cellule RPE possono essere identificate dalla loro morfologia, pigmentazione e marcatori RPE specifici come RPE65 4,5,21. La convalida della purezza e della contaminazione delle cellule di Müller è stata ottenuta colorando cellule isolate con un marcatore cellulare specifico per le cellule di Müller (vimentina)22. Molte tecniche sono state utilizzate per valutare l'integrità della barriera emato-retinica (BRB) in vitro, come l'esame al microscopio elettronico (EM), la valutazione delle proteine a giunzione stretta (TJP), il saggio di perdita di destrano FITIC e la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TER) che valuta la funzione fisiologica di RPE come monostrato 8,23 . Le cellule RPE svolgono un ruolo importante nel mantenimento del BRB esterno e, per convalidare questa funzione, abbiamo valutato proteine a giunzione stretta (TJP) come Zona ocludin-1 (ZO-1) e proteine citoscheletriche come F-actina come precedentemente pubblicato8. La valutazione TJP è un metodo più conveniente per la valutazione dell'integrità BRB e della funzione barriera che non richiede costose apparecchiature che potrebbero non essere disponibili in tutti i laboratori di ricerca, al contrario della valutazione EM o TER.

L'isolamento RPE primario è una tecnica che potrebbe essere uno strumento importante per studiare i meccanismi sottostanti e la patogenesi, e per proporre nuove applicazioni terapeutiche per diverse patologie oculari. La tecnica attuale ha permesso di studiare i cambiamenti nella struttura e nella funzione delle cellule RPE e il loro impatto sul BRB esterno nella degenerazione maculare legata all'età8. Inoltre, ha aiutato a studiare i cambiamenti nelle cellule RPE isolate da topi C57BL6 wild-type e diversi topi geneticamente modificati, oltre a testare i diversi composti farmacologici alla ricerca di un bersaglio terapeutico per AMD14,16.

In conclusione, molti protocolli pubblicati disponibili hanno dimostrato l'isolamento RPE primario del mouse. Il protocollo presentato è una procedura semplificata derivante dalla modifica di alcuni protocolli esistenti, utilizzando materiali, metodi e attrezzature disponibili nella maggior parte dei laboratori di ricerca per isolare le cellule RPE primarie dagli occhi del topo.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse per dichiarare che sono rilevanti per il contenuto di questo articolo.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo R01 EY029751-04 del National Eye Institute (NEI)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker : 100mL KIMAX 14000
Collagenase from Clostridium histolyticum  Sigma-Aldrich C7657-25MG For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile 13-711-20
DMEM/F12  gibco  11330 Media to grow RPE cells 
Fetal Bovine Serum (FBS) gibco 26140079 For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution gibco 15750-060 For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Scientific 88284 For working enzymes (A&B) 
Heracell VISO 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Hyaluronidase from bovine testes Sigma-Aldrich H3506-500MG For working enzyme A
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL B-D 309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL Grainger 11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody  Abcam, Cambridge, MA, USA ab78036 For IF staining 
Pen Strep gibco 15140-122 For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45 Dumont 72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm GARANA INDUSTRIES 2595
Sorvall St8 Centrifuge ThermoScientific 75007200
Stemi 305 Microscope Zeiss n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel Bard-Parker 371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style Corning 430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style Corning 353003
Tornado Tubes: 15mL Midsci C15B
Tornado Tubes: 50mL Midsci C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25% gibco 2186962 For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips Dumont 501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL Electron Microscopy Sciences Dumont 50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36" McKesson 4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge FST 15000-08
Zeiss AxioImager Z2 Zeiss n/a
Zeiss Zen Blue 2.6 Zeiss n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
  2. Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
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Biologia Numero 189

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24th reference was added:

  1. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
Isolamento delle cellule primarie dell'epitelio pigmentato retinico del topo
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Tomaszewski, R., Rajpurohit, P.,… More

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P., Cheng, M., Tawfik, A. Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. J. Vis. Exp. (189), e63543, doi:10.3791/63543 (2022).

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