Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolement de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes primaires de souris

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63543
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,3
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine, 3Oral Biology and Diagnostic Sciences, Dental College of Georgia, Augusta University

ERRATUM NOTICE

Summary

Ce manuscrit décrit un protocole simplifié pour l’isolement progressif des cellules de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) des yeux de souris. Le protocole comprend l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules EPR.

Abstract

La couche d’épithélium pigmenté rétinien (EPR) se trouve immédiatement derrière les photorécepteurs et abrite un système métabolique complexe qui joue plusieurs rôles critiques dans le maintien de la fonction des photorécepteurs. Ainsi, la structure et la fonction de l’EPR sont essentielles pour maintenir une vision normale. Ce manuscrit présente un protocole établi pour l’isolement primaire des cellules EPR de souris. L’isolement de l’EPR est un excellent outil pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la pathologie de l’EPR dans les différents modèles murins de troubles oculaires. En outre, l’isolement de l’EPR peut aider à comparer les cellules RPE primaires de souris isolées de souris de type sauvage et génétiquement modifiées, ainsi qu’à tester des médicaments qui peuvent accélérer le développement de thérapies pour les troubles visuels. Le manuscrit présente un protocole d’isolement RPE étape par étape; L’ensemble de la procédure, de l’énucléation à l’ensemencement, prend environ 4 heures. Le milieu ne doit pas être changé pendant 5 à 7 jours après l’ensemencement, pour permettre la croissance des cellules isolées sans perturbation. Ce processus est suivi par la caractérisation de la morphologie, de la pigmentation et des marqueurs spécifiques dans les cellules via l’immunofluorescence. Les cellules peuvent être traversées un maximum de trois ou quatre fois.

Introduction

Les cellules de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) sont situées entre la choroïde et la rétine neurale, formant une simple monocouche de cellules cuboïdes qui se trouve derrière les cellules photoréceptrices (PR)1. L’EPR joue un rôle essentiel dans le maintien d’un environnement sain pour les cellules PR, principalement en réduisant l’accumulation excessive d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et les dommages oxydatifs qui en découlent1. Les cellules EPR supervisent de nombreuses fonctions, telles que la conversion et le stockage des rétinoïdes, l’absorption de la lumière diffusée, le transport des fluides et des ions et la phagocytose dela membrane du segment externe 2,3 du PR. Les altérations de l’EPR (morphologie/fonction) peuvent altérer leur fonction conduisant à la rétinopathie et c’est une caractéristique commune à de nombreux troubles oculaires4. De nombreuses maladies oculaires sont associées à des altérations de la morphologie et de la fonction des cellules EPR, y compris certaines maladies génétiques comme la rétinite pigmentaire, l’amaurose congénitale de Leber et l’albinisme 4,5,6, ainsi que des troubles oculaires liés à l’âge comme la rétinopathie diabétique (RD) et la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA)7,8 . Les cellules humaines sont les plus souhaitables, il serait donc idéal d’étudier les troubles de l’EPR dans les cellules RPE humaines primaires pour former des monocouches d’EPR. Cependant, les questions éthiques et la disponibilité limitée des donneurs humains en raison du fait que la plupart de ces troubles entraînent une morbidité9, mais pas nécessairement la mortalité10, empêchant ainsi l’isolement des cellules humaines primaires de l’EPR. Cela fait de la culture de cellules EPR provenant de donneurs animaux non humains une alternative privilégiée. Les rongeurs, en particulier les souris, sont considérés comme un excellent modèle pour l’étude de différentes maladies oculaires puisque la technologie transgénique est plus largement établie chez ces espèces11. Même si l’utilisation de cellules EPR primaires en culture offre de nombreux avantages, il a été difficile de maintenir des cellules en croissance pendant de nombreux passages, ou de stocker et de réutiliser les cellules. La principale limitation de ce protocole est l’âge des souris; les souris utilisées pour l’isolement de l’EPR doivent être très jeunes (18-21 jours est optimal) car il a été difficile de cultiver des cellules EPR à partir de souris adultes11,12,13. Les cellules EPR peuvent être isolées des yeux de souris à tout âge, mais jusqu’à quatre passages cellulaires n’ont été efficaces qu’avec de jeunes souris (âgées de 18 à 21 jours). L’isolement de l’EPR à partir de la rétine de souris, en utilisant à la fois des souris C57BL6 et des souris transgéniques avec délétion des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDAR) au niveau des cellules EPR, a été réalisé pour étudier l’effet de l’homocystéine d’acides aminés élevés sur le développement et la progression de la DMLA14. De plus, des cellules RPE primaires isolées ont aidé à proposer une cible thérapeutique pour la DMLA par inhibition des NMDARs sur les cellules RPE14. Certains bloqueurs NMDAR sont approuvés par la Food and Drug Administration (FDA) et sont actuellement utilisés pour traiter la confusion modérée à grave (démence) liée à la maladie d’Alzheimer (MA), comme la mémantine16, qui pourrait être une cible thérapeutique potentielle pour la DMLA14. De plus, des cellules RPE primaires isolées de souris ont été utilisées pour la détection de marqueurs inflammatoires et l’induction proposée de l’inflammation comme mécanisme sous-jacent des caractéristiques induites par l’homocystéine de la DMLA et de la MA à l’aide d’une souris génétiquement modifiée (CBS), qui présente un niveau élevé d’homocystéine16,17.

Ce protocole a été utilisé pour isoler des cellules EPR de souris C57BL/6 de type sauvage et de souris transgéniques développées dans notre laboratoire comme une adaptation simplifiée d’autres protocoles d’isolement publiés13,18,19 pour atteindre un protocole facilement applicable et fiable. Il n’y a pas de préférence sexuelle dans ce protocole. Bien que l’âge des souris soit essentiel pour le processus d’isolement, des souris jeunes et âgées (âgées de 18 à 21 jours) et des souris plus âgées de tout âge (jusqu’à 12 mois) ont été utilisées pour l’isolement de l’EPR. Cependant, nous avons remarqué que les cellules EPR isolées des souris jeunes vivaient plus longtemps et que jusqu’à quatre passages pouvaient être effectués. Les cellules EPR isolées de souris plus âgées pourraient être transmises une ou deux fois, puis elles cesseraient de croître à un rythme normal et changeraient de forme pour être plus allongées (cellules ressemblant à des fibroblastes). Une perte de pigmentation et une diminution de l’adhérence à la plaque de culture tissulaire suivies d’un décollement ont également été observées.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Les animaux ont été utilisés conformément aux directives du protocole animal IACUC numéro 21063 de l’Université d’Oakland et aux directives de la déclaration ARVO pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.

1. Préparation de la solution

  1. Préparer le milieu complet de culture cellulaire EPR en complétant le mélange F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco avec 25 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1,5 % de pénicilline/streptomycine et 0,02 % de gentamicine.
  2. Préparer l’enzyme A en complétant 741 μL de solution de sel équilibrée de Hank (HBSS) avec 127 μL de solution mère de collagénase et 132 μL de solution mère de hyaluronidase. Cela fait un volume final de 1 mL, qui peut traiter quatre yeux.
    1. Préparer la solution mère de collagénase en dissolvant 1 mg de collagénase de Clostridium histolyticum dans 41 mL de HBSS (19,5 unités / mL).
    2. Préparer la solution mère de Hyaluronidase en dissolvant 1 mg de Hyaluronidase provenant de testicules bovins dans 18,4 mL de HBSS (38 unités/mL).
  3. Préparer l’enzyme B en ajoutant deux parties de trypsine-EDTA à 0,25% à trois parties de HBSS. Notez que le volume total dépend du nombre d’yeux disséqués; On peut avoir recours à 1 mL d’enzyme B pour traiter quatre yeux.

2. Énucléation

  1. Euthanasier éthiquement la souris par inhalation de dioxyde de carbone (CO2) conformément aux normesIACUC 21.
    1. Brièvement, placer le(s) animal(s) dans la chambre CO 2 pour introduire 100% CO 2 avec un taux de remplissage de 30% à 70% du volume de la chambre par minute avec CO 2 pour atteindre l’inconscience dans les2 à 3 minutes, avec une détresse minimale pour les souris.
    2. Confirmez la mort (manque de respiration et couleur des yeux fanée), puis déplacez la souris de la cage vers une zone chirurgicale stérilisée propre (nettoyée avec de l’alcool) équipée d’un équipement chirurgical stérilisé.
  2. Placez la souris sur un sous-tampon stérile.
  3. Énucléez les yeux en appuyant sur une pince à épiler de style 5/45 sur la zone orbitale pour induire la proptose, puis en déplaçant la pince à épiler vers l’arrière de l’œil. Extraire les yeux, avec le nerf optique intact, en tirant doucement les yeux de la cavité orbitaire.
  4. À l’aide d’une pince, immergez les yeux dans un tube microcentrifuge de 2 mL contenant 1 ml de povidone iodée à 5 %. Incuber les yeux à température ambiante pendant 2-3 min.
  5. Retirez les yeux de la solution de povidone iodée et placez-les dans une boîte de Pétri. À l’aide d’une pipette de transfert stérile, laver les yeux avec HBSS jusqu’à ce que la couleur orange de la povidone iodée ait disparu. Cela prend environ deux ou trois lavages.
  6. Placer les yeux dans une nouvelle boîte de Petri de 60 mm et les plonger dans un milieu de culture cellulaire EPR complet à froid (2-8 °C) préparé à l’étape 1.1.

3. Dissection

  1. Sous un microscope chirurgical, utilisez une pince à épiler de style M5S et des ciseaux Vannas pour enlever le tissu conjonctif et les muscles extraoculaires.
    REMARQUE : La dissection se fait sous une capuche tissulaire dans un environnement complètement stérile. Cependant, à des fins vidéo, le microscope à dissection a été placé à l’extérieur du capot pour obtenir une démonstration / filmage de meilleure qualité. Placer un petit morceau de papier de soie non pelucheux sous l’œil améliore la stabilité pendant la dissection. Les yeux peuvent ensuite être maintenus temporairement (pas plus de 1 heure) dans le milieu de culture cellulaire EPR froid. Cependant, il est préférable de passer directement à l’étape suivante immédiatement après le nettoyage des yeux.
  2. Transférer les yeux dans un tube microcentrifuge de 2 mL contenant 1 mL de solution d’enzyme A pour quatre yeux. Ensuite, incuber les yeux dans un incubateur à 37 °C pendant 40 min.
  3. Retirez les yeux de l’incubateur et du tube microcentrifugeux. Ensuite, transférez-les dans un nouveau tube microcentrifuge contenant 1 mL de solution d’enzyme B pour quatre yeux. Incuber le tube dans un incubateur à 37 °C pendant 50 min.
  4. Placer les yeux dans une nouvelle boîte de culture en suspension de 60 mm contenant 10 mL de milieu de croissance complet des cellules EPR. Incuber ensuite les yeux à 4 °C pendant 30 min.
  5. Placez la capsule sous un microscope chirurgical et commencez à disséquer.
  6. Enlevez la partie antérieure de l’œil (cornée, iris et cristallin) de la partie postérieure de l’œilleton (rétine postérieure).
    1. Saisissez l’œil avec une pince de style M5S et faites une incision dans la section ora serrata (partie la plus antérieure de la rétine où se termine le bleu clair) avec une lame #11 ou l’aiguille d’une seringue.
    2. Saisissez la partie interne de l’incision avec une paire de pinces et saisissez la cornée avec une autre paire de pinces. Commencez à tirer ou à déchirer lentement la cornée de la rétine. Assurez-vous de déchirer par petits incréments et de descendre la déchirure tout en retirant la cornée, pour vous assurer que l’EPR reste en grande partie intacte et entraîne une déchirure plus propre.
      REMARQUE: Une fois que la cornée est complètement détachée, l’iris et le cristallin peuvent être vus.
    3. Séparez la cornée et l’iris.
  7. Séparez la lentille de l’œilleton avec une légère compression de la moitié postérieure de l’œil.
  8. Pour retirer la rétine neurale de la couche RPE, saisissez la couche externe de l’œilleton avec une paire de pincettes et positionnez le bras d’une deuxième paire de pincettes entre l’EPR et les couches neuronales. De là, tirez ou retirez doucement la rétine neurale de la couche d’EPR. Jetez la rétine neurale.
    REMARQUE: Dans la vidéo, la rétine neurale et le cristallin sont enlevés ensemble. Cependant, pour les débutants, il sera plus facile de supprimer chacun séparément. Ce qui reste, c’est l’EPR, la choroïde et la sclérotique.
  9. Jetez la cornée, l’iris, le cristallin et la rétine neurale. Déplacez l’œilleton restant dans une nouvelle zone de l’assiette exempte de débris.
  10. Pour séparer l’EPR de la choroïde et de la sclérotique, grattez doucement l’intérieur de l’œilleton avec une pince à épiler de style 5/45 pour assurer la séparation des cellules EPR. Les cellules EPR apparaissent troubles lorsqu’elles sont suspendues dans le milieu de croissance complet des cellules EPR.
  11. Aspirer les cellules à l’aide d’une pipette de transfert stérile de 3,2 mL et transférer dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL contenant un milieu de croissance complet des cellules EPR.

4. Centrifugation

  1. Placer le tube à centrifuger de 15 mL contenant les cellules EPR primaires à l’intérieur d’une centrifugeuse et centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 minutes à température ambiante.
  2. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille avec 10 mL de milieu de croissance complet de l’EPR. Le milieu de croissance complet de l’EPR est plus spécifique pour la croissance de l’EPR que d’autres cellules contaminantes, telles que les cellules de Müller ou les cellules endothéliales choroïdiennes. Les cellules de Müller nécessitent un milieu glycémique élevé, tandis que les cellules endothéliales choroïdiennes nécessitent des facteurs de croissance spécifiques. En changeant le milieu et en faisant passer la culture, seules les cellules EPR continueront à croître.

5. Culture cellulaire

  1. Plaquer les cellules primaires EPR en remise en suspension sur une boîte de Petri stérile de 100 mm et les transférer dans un incubateur (après avoir vérifié la pureté en colorant les cellules avec des marqueurs spécifiques de cellules EPR/Müller, comme indiqué à la figure 1E-N). Incuber les cellules à 37 °C et 5% de CO2.
    NOTE: Les marqueurs utilisés sont mentionnés dans le tableau des matériaux. Cette étape est effectuée après l’établissement de la culture.
  2. Incuber les cellules pendant environ 5 jours pour se développer. Pendant ce temps, ne changez pas le milieu, ne perturbez pas les cellules ou ne déplacez pas la plaque de culture cellulaire (il s’agit d’une étape critique du protocole; après l’isolement, les cellules doivent être incubées et ne pas être perturbées pendant 5 jours).
    REMARQUE: Le nombre de cellules dépend du nombre d’yeux utilisés pour l’isolement. Un plus grand nombre d’yeux isolés donnera un plus grand nombre de cellules. L’isolement de l’EPR à partir de deux yeux donnera ~ 440 000-880 000 cellules, soit 5% -10% de la boîte de Petri de 100 mm, qui peut contenir 8,8 millions de cellules.

6. Passage

  1. Aspirer le média et laver avec 2 ml de PBS. Puis aspirez le PBS.
  2. Ajouter 4 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % (1x), ou assez pour couvrir la base du plat. Incuber pendant 5-10 min à température ambiante.
  3. Ajouter 8 mL de milieu RPE préchauffé ou deux fois le volume de la quantité de trypsine utilisée à l’étape 6.2. Ensuite, recueillez les cellules et placez-les dans un tube à centrifuger de 15 mL.
  4. Centrifuger à 300 x g pendant 7 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 10 mL de milieux de culture cellulaire EPR complets. Plaquer la suspension entière dans une boîte de Petri stérile de 100 mm.
    REMARQUE: Les cellules peuvent être passées jusqu’à quatre ou cinq fois18. Cependant, les résultats d’expérience les plus cohérents se trouvent après deux ou trois passages. Après deux à quatre passages, les cellules ont changé de forme (comme le montre la figure 1D) pour être plus allongées, accumulées au milieu de la plaque, ont cessé de croître et se sont détachées.
  5. Utiliser des protocoles d’immunofluorescence, selonles méthodes 8,14,15,16 publiées précédemment, pour colorer et valider la spécificité de l’EPR.

7. Immunofluorescence

NOTE: L’immunofluorescence a été réalisée selon les méthodes 8,14,15,16,17,18 précédemment publiées pour colorer et valider la spécificité de l’EPR. La coloration des cellules EPR primaires était généralement effectuée aux passages P1 et P2. Ici, un bref aperçu du protocole d’immunofluorescence est présenté.

  1. Ensemencer les cellules sur une lame de chambre de culture cellulaire (30 000 cellules par puits pour la lame de chambre à 8 puits).
  2. Culture des cellules dans des milieux de culture cellulaire EPR complets à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24-48 h.
  3. Lorsque les cellules sont confluentes à 80%-90%, aspirez le média et lavez la lame de chambre avec 1x PBS.
  4. Fixez la lame avec 4% de paraformaldéhyde pendant 10-15 min.
  5. Aspirer le paraformaldéhyde à 4%, puis bloquer avec une solution de blocage (voir le tableau des matériaux).
  6. Aspirer la solution bloquante et ajouter l’anticorps primaire, RPE65, et incuber pendant trois heures à 37 °C (avec une concentration d’anticorps allant de 1:200-1:250 dans le tampon de blocage, à un volume de 150-200 μL/lame). Ensuite, lavez trois fois avec PBS / TX-100 (5-10 min chaque lavage).
  7. Aspirer l’anticorps primaire et ajouter l’anticorps secondaire (avec une concentration d’anticorps de 1:1 000 dans le tampon de blocage, à un volume de 150-200 μL/lame). Incuber pendant une heure à 37 °C.
  8. Aspirer l’anticorps secondaire. Lavez trois fois avec PBS/Trtion X-100 (5-10 min chaque lavage).
  9. Ajoutez une goutte de support de montage DAPI pour étiqueter les noyaux et placez un couvercle sur la lame. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles sous la lame.
  10. Ensuite, prenez des images avec un microscope fluorescent, accompagné d’une caméra de microscope haute résolution (HRM) et d’un logiciel de traitement d’image (voir Tableau des matériaux).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validation de la spécificité, de la pureté et de la fonction/formation de barrière des cellules EPR isolées
Les cellules isolées ont été examinées au microscope optique pour vérifier leur viabilité, leur morphologie et leur pigmentation. Des images de P0 et P1 (Figure 1A,B) et des images de P0 et P4 ont été capturées (Figure 1C,D) pour montrer les changements dans les cellules; forme, taille et pigmentation au fur et à mesure que les passages passaient au quatrième passage (les flèches noires pointent vers les cellules RPE isolées dans P4). Un anticorps de la protéine RPE65 a été utilisé pour vérifier l’identité des cellules isolées. La coloration par immunofluorescence des cellules isolées a été réalisée avec un anticorps contre RPE65, suivie d’un examen au microscope fluorescent (Figure 1E,F : faible grossissement, et Figure 1G,H : grossissement élevé, montrant des cellules RPE colorées positivement en vert et un marqueur nucléaire, DAPI, en bleu). RPE65 est une isomérohydrolase exprimée dans l’EPR. Il est essentiel pour la régénération du pigment visuel nécessaire à la vision médiée par les bâtonnets et les cônes21 . Valider la fonction barrière de l’isolé
, la protéine F-actine du cytosquelette et la coloration par immunofluorescence de la protéine à jonction serrée ZO-1 8 pour les cellules isolées ont été utilisées (Figure 1I,J : coloration nucléaire verteZO-1 et bleue). et Figure 1K,L : F-actine rouge et coloration nucléaire bleue). Cependant, la forme pavée typique de l’EPR est très évidente lorsque les cellules sont entièrement confluentes.

Un contrôle négatif a été utilisé dans les expériences où l’anticorps secondaire a été ajouté aux cellules EPR sans ajouter l’anticorps primaire, pour s’assurer que la spécificité de l’anticorps et la couleur résultante sont spécifiques aux anticorps utilisés (non illustré).

Pour valider la pureté et la contamination de l’EPR isolée par les cellules de Müller, une coloration par immunofluorescence des cellules isolées avec un marqueur cellulaire spécifique pour les cellules de Müller, la vimentine, a été utilisée (vert et bleu pour la coloration nucléaire comme le montre la figure 1M,N) en utilisant des cellules de Müller comme témoin positif. Les cellules RPE isolées ont montré une coloration négative pour la vimentine.

Les cellules isolées ont été examinées au microscope optique pour vérifier leur viabilité, leur morphologie et leur pigmentation. Des images de P0 et P1 (Figure 1K,L) et des images de P0 et P4 ont été capturées (Figure 1M,N) pour montrer les changements dans la forme, la taille et la pigmentation des cellules au fur et à mesure que les passages passaient au quatrième passage (les flèches noires pointent vers les cellules RPE isolées dans P4).

Figure 1
Figure 1 : Validation de l’isolement de l’EPR. (A) Microscope optique pour le passage zéro de l’EPR (P0). (B) Microscope optique pour le passage RPE un (P1). (C) Caractérisation morphologique à P0. (D) Caractérisation morphologique à P4. (E) Immunocoloration du RPE65 à faible grossissement. (F) Immunomarquage pour RPE65 avec coloration nucléaire avec DAPI. (G) Immunomarquage pour RPE65 à fort grossissement. (H) Immunomarquage pour le RPE65 avec coloration nucléaire avec DAPI à fort grossissement. (I) coloration ZO-1 pour les cellules EPR. G) Coloration ZO-1 pour les cellules EPR avec coloration nucléaire avec DAPI. (K) Coloration F-actine pour les cellules EPR. (L) Coloration F-actine pour les cellules EPR avec coloration nucléaire avec DAPI. (M) Coloration au vimentine pour les cellules EPR. (N) Coloration au vimentine pour les cellules de Müller en tant que témoin positif (RMc-1) avec coloration nucléaire avec DAPI. Les barres d’échelle sont égales à 300 μm, 20 μm, 300 μm, 300 μm, 50 μm, 10 μm, 50 μm, 50 μm et 50 μm, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Le protocole actuel est une procédure détaillée rapportée, modifiée et simplifiée pour l’isolement de l’EPR à partir des yeux de souris. Le protocole comprend l’énucléation, la dissection, la collecte, l’ensemencement, la culture et la caractérisation des cellules EPR isolées dans les yeux de souris.

Certaines limites et étapes critiques doivent être respectées pour une isolation réussie de l’EPR, telles que l’âge des souris, le nombre d’yeux disséqués, la taille de la plaque ou de la boîte de culture tissulaire et les mises en garde après l’ensemencement, l’entreposage et le passage. Pour pouvoir faire passer les cellules isolées jusqu’à trois ou quatre fois, les meilleures souris vieillissent entre 18 et 21 jours. Pour avoir un nombre raisonnable de cellules isolées capables de croître et de se multiplier, au moins deux yeux sont nécessaires pour un seul isolement. Le nombre de cellules résultant de l’isolement est proportionnel au nombre d’yeux disséqués (~220 000 cellules/œil). Une boîte de Pétri/fiole stérile de 100 mm est recommandée pour obtenir un plus grand nombre de cellules dans un passage précoce (P0). Après l’ensemencement, les cellules ne doivent pas être perturbées en déplaçant la plaque de culture tissulaire de l’incubateur ou en changeant le milieu pendant au moins 5 jours. En outre, l’une des limites de cette technique est le stockage et le passage des cellules isolées. Les cellules ne peuvent pas être stockées (congelées et décongelées) et ne peuvent être traversées que trois ou quatre fois. Après le passage 4, les cellules commencent à changer de taille et de forme pour devenir allongées (forme fusiforme) avec une diminution marquée de la pigmentation cellulaire (Figure 1D).

Ce protocole est différent des autres protocoles publiés précieux et fiables pour l’isolation RPE de la souris primaire1 3,19,20 en ce qu’il est simplifié en quelques étapes faciles à suivre. Les cellules EPR peuvent être identifiées par leur morphologie, leur pigmentation et des marqueurs RPE spécifiques tels que RPE65 4,5,21. La validation de la pureté et de la contamination des cellules de Müller a été obtenue en colorant des cellules isolées avec un marqueur cellulaire spécifique pour les cellules de Müller (vimentine)22. De nombreuses techniques ont été utilisées pour évaluer l’intégrité de la barrière hémato-rétinienne (BRB) in vitro, telles que l’examen au microscope électronique (EM), l’évaluation des protéines de jonction serrée (TJP), le test de fuite FITIC dextran et la mesure de la résistance électrique transépithéliale (TER) qui évalue la fonction physiologique de l’EPR en tant que monocouche 8,23 . Les cellules EPR jouent un rôle important dans le maintien du BRB externe, et pour valider cette fonction, nous avons évalué des protéines à jonction serrée (TJP) telles que Zona ocludin-1 (ZO-1) et des protéines cytosquelettiques comme F-actine comme précédemment publié8. L’évaluation TJP est une méthode plus pratique pour l’évaluation de l’intégrité du BRB et de la fonction de barrière qui ne nécessite pas d’équipement coûteux qui peut ne pas être disponible dans tous les laboratoires de recherche, par opposition à l’évaluation EM ou TER.

L’isolement primaire de l’EPR est une technique qui pourrait être un outil important pour étudier les mécanismes sous-jacents et la pathogenèse, et pour proposer de nouvelles applications thérapeutiques pour différentes maladies oculaires. La technique actuelle a permis d’étudier les changements dans la structure et la fonction des cellules EPR et leur impact sur le BRB externe dans la dégénérescence maculaire liée à l’âge8. De plus, il a aidé à étudier les changements dans les cellules EPR isolées de souris C57BL6 de type sauvage et différentes souris génétiquement modifiées, ainsi qu’à tester les différents composés pharmacologiques à la recherche d’une cible thérapeutique pour la DMLA14,16.

En conclusion, de nombreux protocoles publiés disponibles ont démontré l’isolement RPE primaire de la souris. Le protocole présenté est une procédure simplifiée résultant de la modification de certains protocoles existants, en utilisant du matériel, des méthodes et de l’équipement disponibles dans la plupart des laboratoires de recherche pour isoler les cellules primaires de l’EPR à partir des yeux de souris.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer qui soit pertinent pour le contenu de cet article.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) fund R01 EY029751-04

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker : 100mL KIMAX 14000
Collagenase from Clostridium histolyticum  Sigma-Aldrich C7657-25MG For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile 13-711-20
DMEM/F12  gibco  11330 Media to grow RPE cells 
Fetal Bovine Serum (FBS) gibco 26140079 For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution gibco 15750-060 For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Scientific 88284 For working enzymes (A&B) 
Heracell VISO 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Hyaluronidase from bovine testes Sigma-Aldrich H3506-500MG For working enzyme A
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL B-D 309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL Grainger 11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody  Abcam, Cambridge, MA, USA ab78036 For IF staining 
Pen Strep gibco 15140-122 For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45 Dumont 72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm GARANA INDUSTRIES 2595
Sorvall St8 Centrifuge ThermoScientific 75007200
Stemi 305 Microscope Zeiss n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel Bard-Parker 371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style Corning 430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style Corning 353003
Tornado Tubes: 15mL Midsci C15B
Tornado Tubes: 50mL Midsci C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25% gibco 2186962 For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips Dumont 501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL Electron Microscopy Sciences Dumont 50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36" McKesson 4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge FST 15000-08
Zeiss AxioImager Z2 Zeiss n/a
Zeiss Zen Blue 2.6 Zeiss n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
  2. Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
  5. Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
  6. Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
  7. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  8. Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
  9. Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
  10. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
  11. Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
  12. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
  13. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  14. Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
  15. van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer's disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
  16. Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
  17. Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
  18. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
  19. Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020).
  21. Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
  22. Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
  23. Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
  24. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).

Tags

Biologie numéro 189

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24th reference was added:

  1. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
Isolement de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes primaires de souris
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P.,… More

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P., Cheng, M., Tawfik, A. Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. J. Vis. Exp. (189), e63543, doi:10.3791/63543 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter