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Biology

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63543
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,3
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine, 3Oral Biology and Diagnostic Sciences, Dental College of Georgia, Augusta University

ERRATUM NOTICE

Summary

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 단계적으로 분리하기위한 단순화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈의 핵 제거 및 해부, RPE 세포의 분리, 파종 및 배양이 포함됩니다.

Abstract

망막 색소 상피 (RPE) 층은 광 수용체 바로 뒤에 있으며 광 수용체의 기능을 유지하는 데 몇 가지 중요한 역할을하는 복잡한 대사 시스템을 보유하고 있습니다. 따라서 RPE 구조와 기능은 정상적인 시력을 유지하는 데 필수적입니다. 이 원고는 1차 마우스 RPE 세포 분리를 위한 확립된 프로토콜을 제시합니다. RPE 분리는 안구 질환의 다양한 마우스 모델에서 RPE 병리의 기초가 되는 분자 메커니즘을 조사하는 훌륭한 도구입니다. 또한 RPE 분리는 야생형 및 유전자 변형 마우스에서 분리된 1차 마우스 RPE 세포를 비교하고 시각 장애 치료제 개발을 가속화할 수 있는 약물을 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다. 원고는 단계별 RPE 격리 프로토콜을 제시합니다. 핵 제거에서 파종까지 전체 절차는 약 4 시간이 걸립니다. 분리 된 세포의 성장을 방해받지 않고 허용 할 수 있도록 파종 후 5-7 일 동안 배지를 변경해서는 안됩니다. 이 과정은 면역형광을 통해 세포의 형태학, 색소 침착 및 특정 마커의 특성화로 이어집니다. 세포는 최대 3 또는 4회 계대배양될 수 있다.

Introduction

망막 색소 상피 (RPE) 세포는 맥락막과 신경 망막 사이에 위치하여 광 수용체 (PR) 세포1 뒤에있는 직육면체 세포의 단순한 단층을 형성합니다. RPE는 주로 활성 산소 종(ROS)의 과도한 축적과 그에 따른 산화적 손상을 줄임으로써 PR 세포의 건강한 환경을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다1. RPE 세포는 레티노이드의 전환 및 저장, 산란광의 흡수, 유체 및 이온 수송, 흘린 PR 외부 분절 막 2,3의 식균 작용과 같은 많은 기능을 감독합니다. RPE (형태 / 기능)의 변화는 망막 병증으로 이어지는 기능을 손상시킬 수 있으며 이는 많은 안구 질환에서 공유하는 공통적 인 특징입니다4. 많은 안구 질환은 색소성 망막염, Leber 선천성 무균증 및 백색증 4,5,6과 같은 일부 유전 질환뿐만 아니라 당뇨병성 망막병증(DR) 및 연령 관련 황반변성(AMD)과 같은 연령 관련 안구 질환을 포함하여 RPE 세포의 형태 및 기능의 변화와 관련이 있습니다.7,8 . 인간 세포가 가장 바람직하므로, RPE 단분자층을 형성하기 위한 1차 인간 RPE 세포에서 RPE 장애를 연구하는 것이 이상적일 것이다. 그러나, 윤리적 문제 및 이들 장애의 대부분이 이환율9을 유도하지만, 반드시 사망률10을 초래한다는 사실로 인한 인간 공여자의 제한된 이용가능성은 일차 인간 RPE 세포의 단리를 방지시킨다. 따라서 비인간 동물 기증자로부터 RPE 세포를 배양하는 것이 선호되는 대안입니다. 설치류, 특히 마우스는 트랜스 제닉 기술이이 종에서 더 광범위하게 확립되기 때문에 다양한 안구 질환을 연구하기위한 훌륭한 모델로 간주됩니다11. 배양된 1차 RPE 세포의 사용은 많은 이점을 제공하지만, 많은 계대 동안 성장하는 세포를 유지하거나 세포를 저장 및 재사용하는 것이 어려웠습니다. 이 프로토콜의 주요 한계는 생쥐의 나이입니다. RPE 분리에 사용되는 마우스는 성체 마우스 11,12,13에서 RPE 세포를 배양하는 것이 어려웠기 때문에 매우 어린 연령(18-21일이 최적임)이어야 합니다. RPE 세포는 모든 연령의 마우스 눈에서 분리 할 수 있지만 최대 4 개의 세포 계대는 어린 마우스 (18-21 일령)에서만 성공적이었습니다. RPE 세포에서 N-메틸-D-아스파르테이트 수용체(NMDAR)가 결실된 C57BL6 마우스와 트랜스제닉 마우스 모두를 사용하여 마우스 망막에서 RPE 분리를 수행하여 상승된 아미노산 호모시스테인이 AMD14의 발달 및 진행에 미치는 영향을 연구했습니다. 또한, 단리된 1차 RPE 세포는 RPE 세포14에서 NMDARs의 억제에 의해 AMD에 대한 치료 표적을 제안하는 것을 도왔다. 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받았으며 현재 AMD14의 잠재적 치료 표적이 될 수 있는 메만틴16과 같은 알츠하이머병(AD)과 관련된 중등도에서 중증의 혼란(치매) 치료에 사용되는 일부 NMDAR 차단제가 있습니다. 또한, 분리된 1차 마우스 RPE 세포는 염증 마커의 검출 및 높은 수준의 호모시스테인을 나타내는 유전자 변형 마우스(CBS)를 사용하여 AMD 및 AD의 호모시스테인 유도 기능에 대한 기본 메커니즘으로서 염증의 유도를 제안하는 데 사용되었습니다16,17.

이 프로토콜은 쉽게 적용 가능하고 신뢰할 수 있는 프로토콜에 도달하기 위해 공개된 다른 분리 프로토콜13,18,19의 단순화된 적응으로 우리 실험실에서 개발된 야생형 C57BL/6 마우스와 형질전환 마우스 모두에서 RPE 세포를 분리하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜에는 성별 선호도가 없습니다. 생쥐 연령이 분리 과정에 중요하지만, 어린 늙은 쥐(18-21일령)와 모든 연령(최대 12개월)의 나이든 쥐를 RPE 분리에 사용했습니다. 그러나 우리는 어린 생쥐에서 분리 된 RPE 세포가 더 오래 살았으며 최대 4 개의 계대를 수행 할 수 있음을 발견했습니다. 오래된 마우스에서 분리 된 RPE 세포는 한두 번 계대 할 수 있으며, 정상적인 속도로 성장을 멈추고 모양이 더 길쭉한 (섬유 아세포 유사 세포) 바뀝니다. 색소 침착의 손실 및 조직 배양 용기에 대한 접착력 감소에 이어 박리가 또한 관찰되었다.

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Protocol

동물은 오클랜드 대학 IACUC 동물 프로토콜 번호 21063의 지침 및 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO 성명서의 지침에 따라 사용되었습니다.

1. 용액 준비

  1. Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 / 영양소 혼합물 F-12 (DMEM / F12)에 25 % 태아 소 혈청 (FBS), 1.5 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 0.02 % 겐타 마이신을 보충하여 완전한 RPE 세포 배양 배지를 준비하십시오.
  2. 741μL의 행크 밸런스드 소금 용액(HBSS)에 127μL의 콜라게나제 원액과 132μL의 히알루로니다제 원액을 보충하여 효소 A를 준비합니다. 이것은 4 개의 눈을 치료할 수있는 1mL의 최종 부피를 만듭니다.
    1. 클로스트리디움 히스토리티쿰으로부터 1mg의 콜라게나제를 41mL의 HBSS(19.5단위/mL)에 용해시켜 콜라게나제 원액을 제조한다.
    2. 소 고환으로부터 1mg의 히알루로니다아제를 18.4mL의 HBSS(38단위/mL)에 용해시켜 히알루로니다아제 원액을 제조한다.
  3. HBSS의 세 부분에 0.25% 트립신-EDTA의 두 부분을 추가하여 효소 B를 준비합니다. 총 부피는 해부 된 눈의 수에 따라 다릅니다. 효소 B 1mL는 네 개의 눈을 치료하는 데 사용할 수 있습니다.

2. 핵 생성

  1. IACUC 표준21에 따라 이산화탄소 (CO2) 흡입을 사용하여 마우스를 윤리적으로 안락사시킨다.
    1. 간단히 말해서, 동물을 CO2 챔버에 놓고CO2로 분당 챔버 부피의 30%-70%의 충전율로 100%CO2를 도입하여 마우스에 대한 고통을 최소화하면서 2 내지 3분 내에 무의식을 달성한다.
    2. 사망 (호흡 부족 및 눈 색깔 퇴색)을 확인한 다음 마우스를 케이지에서 멸균 된 수술 장비가 장착 된 깨끗한 멸균 수술 부위 (알코올로 문질러서)로 옮깁니다.
  2. 마우스를 멸균 언더패드에 놓습니다.
  3. 안와 부위의 5/45 스타일 핀셋을 눌러 안구 시스를 유도 한 다음 핀셋을 눈 뒤쪽으로 움직여 눈을 핵을 제거합니다. 안와강에서 눈을 부드럽게 당겨 시신경이 손상되지 않은 상태에서 눈을 추출하십시오.
  4. 집게를 사용하여 1mL의 5% 포비돈-요오드가 들어 있는 2mL 미세 원심분리 튜브에 눈을 담그십시오. 실온에서 2-3 분 동안 눈을 배양하십시오.
  5. 포비돈 요오드 용액에서 눈을 제거하고 페트리 접시에 넣으십시오. 멸균 이송 피펫을 사용하여 포비돈 요오드의 주황색이 사라질 때까지 HBSS로 눈을 씻으십시오. 이것은 약 두세 번의 세척이 필요합니다.
  6. 눈을 새로운 60mm 페트리 접시에 넣고 1.1단계에서 준비한 차가운(2-8°C) 완전 RPE 세포 배양 배지에 담근다.

3. 해부

  1. 수술 현미경에서 M5S 스타일 핀셋과 Vannas 가위를 사용하여 결합 조직과 외안근을 제거합니다.
    알림: 해부는 완전히 멸균 된 환경에서 조직 후드 아래에서 수행됩니다. 그러나 비디오 목적으로 해부 현미경은 더 높은 품질의 시연/촬영을 달성하기 위해 후드 외부에 배치되었습니다. 눈 아래에 보푸라기가없는 작은 티슈 페이퍼를 놓으면 해부 중 안정성이 향상됩니다. 그런 다음 차가운 RPE 세포 배양 배지에서 눈을 일시적으로(1시간 이상) 유지할 수 있습니다. 그러나 눈을 세정 한 직후 다음 단계로 바로 진행하는 것이 좋습니다.
  2. 눈을 4개의 눈마다 1mL의 효소 A 용액이 들어 있는 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 37°C의 인큐베이터에서 40분 동안 눈을 배양합니다.
  3. 인큐베이터와 마이크로 원심 분리기 튜브에서 눈을 제거하십시오. 그런 다음 네 눈마다 1mL의 효소 B 용액이 들어있는 새로운 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 37°C의 인큐베이터에서 50분 동안 배양합니다.
  4. 10mL의 완전한 RPE 세포 성장 배지가 들어 있는 새로운 60mm 현탁액 배양 접시에 눈을 넣습니다. 그런 다음 눈을 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
  5. 접시를 수술 현미경 아래에 놓고 해부를 시작하십시오.
  6. 눈의 앞쪽 부분(각막, 홍채 및 수정체)을 아이컵의 뒤쪽 부분(후방 망막)에서 제거합니다.
    1. M5S 스타일 집게로 눈을 잡고 #11 칼날이나 주사기 바늘로 오라 세라타 부분(하늘색이 끝나는 망막의 가장 앞쪽 부분)을 절개합니다.
    2. 한 쌍의 집게로 절개 부위의 안쪽 부분을 잡고 다른 한 쌍의 집게로 각막을 잡습니다. 망막에서 각막을 천천히 당기거나 찢기 시작하십시오. 각막을 제거하는 동안 조금씩 찢고 찢어진 부분을 아래로 이동하여 RPE가 대부분 손상되지 않고 더 깨끗한 눈물이 생기도록 하십시오.
      참고: 각막이 완전히 분리되면 홍채와 수정체를 볼 수 있습니다.
    3. 각막과 홍채를 모두 분리하십시오.
  7. 눈의 뒤쪽 절반을 부드럽게 눌러 렌즈를 아이 컵에서 분리하십시오.
  8. RPE 층에서 신경 망막을 제거하려면 한 쌍의 핀셋으로 아이컵의 바깥층을 잡고 두 번째 핀셋 쌍의 팔을 RPE와 신경층 사이에 놓습니다. 거기에서 RPE 층에서 신경 망막을 부드럽게 당기거나 퍼냅니다. 신경 망막을 버립니다.
    참고: 비디오에서는 신경 망막과 수정체가 함께 제거됩니다. 그러나 초보자의 경우 각각을 개별적으로 제거하는 것이 더 쉬울 것입니다. 남은 것은 RPE, 맥락막 및 공막입니다.
  9. 각막, 홍채, 수정체 및 신경 망막을 버립니다. 나머지 아이컵을 이물질이 없는 접시의 새 영역으로 옮깁니다.
  10. 맥락막 및 공막에서 RPE를 분리하려면 5/45 스타일 핀셋으로 아이컵 내부를 부드럽게 긁어 RPE 세포를 분리합니다. RPE 세포는 완전한 RPE 세포 성장 배지에 현탁될 때 흐릿하게 나타납니다.
  11. 3.2mL 멸균 이송 피펫을 사용하여 세포를 흡인하고 완전한 RPE 세포 성장 배지가 들어 있는 새로운 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.

4. 원심분리

  1. 1차 RPE 셀이 들어 있는 15mL 원심분리 튜브를 원심분리기 내부에 넣고 실온에서 10분 동안 300 x g에서 셀을 원심분리합니다.
  2. 상청액을 흡인하고 10mL의 완전한 RPE 성장 배지로 펠릿을 재현탁합니다. 완전한 RPE 성장 배지는 Müller 세포 또는 맥락막 내피 세포와 같은 다른 오염 세포보다 RPE 성장에 더 특이적입니다. Müller 세포는 높은 포도당 배지를 필요로하는 반면, 맥락막 내피 세포는 특정 성장 인자를 필요로합니다. 배지를 변경하고 배양을 계대하면 RPE 세포만 계속 성장합니다.

5. 세포 배양

  1. 재현탁된 1차 RPE 세포를 멸균된 100mm 페트리 접시에 플레이트하고 인큐베이터로 옮깁니다( 그림 1E-N에 표시된 대로 특정 RPE/Müller 세포 마커로 세포를 염색하여 순도를 확인한 후). 세포를 37°C 및 5%CO2에서 인큐베이션한다.
    참고: 사용된 마커는 재료 표에 언급되어 있습니다. 이 단계는 문화권이 설정된 후에 수행됩니다.
  2. 세포를 약 5 일 동안 배양하여 성장시킵니다. 이 시간 동안 배지를 변경하거나 세포를 교란하거나 세포 배양 플레이트를 이동하지 마십시오(이는 프로토콜에서 중요한 단계이며 분리 후 세포를 배양해야 하며 5일 동안 방해받지 않아야 함).
    참고: 세포 수는 분리에 사용되는 눈의 수에 따라 다릅니다. 더 많은 수의 눈이 분리되면 더 많은 수의 세포가 생성됩니다. 두 눈에서 RPE를 분리하면 ~ 440,000-880,000 세포 또는 880 만 개의 세포를 보유 할 수있는 100mm 페트리 접시의 5 % -10 %가 생성됩니다.

6. 패시징

  1. 배지를 흡인하고 2mL의 PBS로 세척합니다. 그런 다음 PBS를 흡인합니다.
  2. 0.25% 트립신-EDTA(1x) 4mL를 추가하거나 접시 바닥을 덮을 만큼 충분히 추가합니다. 실온에서 5-10 분 동안 배양하십시오.
  3. 예열된 RPE 배지 8mL 또는 6.2단계에서 사용된 트립신 양의 두 배를 추가합니다. 그런 다음 세포를 수집하여 15mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
  4. 실온에서 7분 동안 300 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 펠릿을 완전한 RPE 세포 배양 배지 10mL에 재현탁합니다. 멸균 된 100mm 페트리 접시에 전체 현탁액을 도금하십시오.
    참고: 세포는18회까지 4회 또는 5회까지 계대배양할 수 있다. 그러나 가장 일관된 실험 결과는 두세 번의 계대 후에 발견됩니다. 2 내지 4 개의 계대 후, 세포는 ( 그림 1D에 도시된 바와 같이) 더 길어지고, 판의 중간에 축적되고, 성장을 멈추고, 분리되도록 그들의 모양을 변경하였다.
  5. 이전에 발표된 방법 8,14,15,16에 따라 면역형광 프로토콜을 사용하여 RPE 특이성을 염색하고 검증합니다.

7. 면역형광법

참고: 면역형광법은 RPE 특이성을 염색하고 검증하기 위해 이전에 공개된 방법 8,14,15,16,17,18에 따라 수행되었습니다. 1차 RPE 세포의 염색은 전형적으로 계대 P1 및 P2에서 수행되었다. 여기에서는 면역형광 프로토콜에 대한 간략한 개요를 제시합니다.

  1. 세포를 세포 배양실 슬라이드(8-웰 챔버 슬라이드의 경우 웰당 30,000 세포)에 시드한다.
  2. 세포를 37°C 및 5%CO2 에서 24-48시간 동안 완전한 RPE 세포 배양 배지에서 배양한다.
  3. 세포가 80%-90% 합류할 때 배지를 흡인하고 1x PBS로 챔버 슬라이드를 세척합니다.
  4. 슬라이드를 4% 파라포름알데히드로 10-15분 동안 고정합니다.
  5. 4% 파라포름알데히드를 흡입한 다음 블로킹 용액으로 차단합니다( 재료 표 참조).
  6. 블로킹 용액을 흡인하고 1차 항체인 RPE65를 첨가하고 37°C에서 3시간 동안 배양합니다(블로킹 버퍼에서 1:200-1:250 범위의 항체 농도, 부피 150-200μL/슬라이드). 그런 다음 PBS/TX-100으로 3회 세척합니다(각 세척 5-10분).
  7. 1차 항체를 흡인하고 2차 항체를 추가합니다(블로킹 버퍼에 항체 농도 1:1,000, 부피 150-200μL/슬라이드). 37°C에서 1시간 동안 배양한다.
  8. 2 차 항체를 흡인하십시오. PBS/Trtion X-100으로 3회 세척합니다(각 세척 5-10분).
  9. DAPI 장착 매체 한 방울을 추가하여 핵에 레이블을 지정하고 슬라이드 위에 커버슬립을 놓습니다. 커버슬립 아래에 기포가 없는지 확인하십시오.
  10. 그런 다음 고해상도 현미경(HRM) 카메라와 이미지 처리 소프트웨어와 함께 형광 현미경으로 이미지를 촬영합니다( 재료 표 참조).

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Representative Results

분리된 RPE 세포의 특이성, 순도 및 장벽 기능/형성에 대한 검증
분리된 세포를 광학 현미경으로 검사하여 생존력, 형태 및 색소 침착을 확인했습니다. P0 및 P1의 이미지 (그림 1A, B)와 P0 및 P4의 이미지 (그림 1C, D)를 캡처하여 셀의 변화를 보여줍니다. 계대가 제4 계대까지 진행됨에 따라 형태, 크기, 및 색소침착(검은색 화살표는 P4에서 단리된 RPE 세포를 가리킴). RPE65 단백질에 대한 항체를 사용하여 분리된 세포의 신원을 확인하였다. 분리된 세포의 면역형광 염색은 RPE65에 대한 항체로 수행하고, 형광 현미경으로 검사하였다(그림 1E, F: 저배율 및 그림 1G,H: 고배율, 녹색으로 양성으로 염색된 RPE 세포 및 파란색의 핵 마커 DAPI). RPE65는 RPE에서 발현되는 이소메로가수분해효소이다. 그것은 막대 및 원뿔 매개 시력21에 필요한 시각 색소의 재생에 필수적입니다. 격리된 장벽 기능을 검증하기 위해
세포단리된 세포에 대해 세포골격 단백질 F-액틴 및 타이트밀접합 단백질 ZO-1 면역형광염색8 을 모두 사용하였다(도 1I,J: 녹색 ZO-1 및 청색 핵 염색). 및 그림 1K, L : 빨간색 F- 액틴 및 파란색 핵 염색). 그러나 RPE의 전형적인 조약돌 모양은 세포가 완전히 합류 할 때 매우 분명합니다.

음성 대조군은 1차 항체를 첨가하지 않고 RPE 세포에 2차 항체를 첨가한 실험에 사용하였으며, 항체의 특이성 및 결과 색상이 사용된 항체에 특이적인지 확인하였다(도시되지 않음).

뮐러 세포에 의한 분리된 RPE의 순도와 오염을 검증하기 위해, Müller 세포에 대한 특정 세포 마커인 vimentin을 사용한 분리된 세포의 면역형광 염색( 도 1M,N에 표시된 바와 같이 핵 염색을 위한 녹색 및 청색)을 양성 대조군으로 사용했습니다. 분리된 RPE 세포는 비멘틴에 대해 음성 염색을 보였다.

분리된 세포를 광학 현미경으로 검사하여 생존력, 형태 및 색소 침착을 확인했습니다. P0 및 P1의 이미지(그림 1K,L)와 P0 및 P4의 이미지(그림 1M,N)를 캡처하여 계대가 네 번째 계대(검은색 화살표는 P4에서 분리된 RPE 세포를 가리킴)로 진행됨에 따라 세포의 모양, 크기 및 색소 침착의 변화를 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: RPE 분리 검증. (A) RPE 통로 제로(P0)를 위한 광학 현미경. (B) RPE 통로 1 (P1)을위한 광학 현미경. (C) P0에서의 형태학 특성화. (D) P4에서의 형태학 특성화. (E) 저배율에서 RPE65에 대한 면역염색. (F) DAPI를 사용한 핵 염색을 통한 RPE65에 대한 면역 염색. (g) 고배율에서 RPE65에 대한 면역염색. (H) 고배율에서 DAPI를 사용한 핵 염색을 통한 RPE65에 대한 면역염색. (i) RPE 세포에 대한 ZO-1 염색. (G) DAPI로 핵 염색을 한 RPE 세포에 대한 ZO-1 염색. (K) RPE 세포에 대한 F- 액틴 염색. (L) DAPI로 핵 염색을 한 RPE 세포에 대한 F- 액틴 염색. (M) RPE 세포에 대한 비멘틴 염색. (N) DAPI를 사용한 핵 염색을 통해 양성 대조군(RMc-1)으로서 뮐러 세포에 대한 비멘틴 염색. 스케일 바는 각각 300 μm, 20 μm, 300 μm, 300 μm, 50 μm, 10 μm, 50 μm, 50 μm 및 50 μm와 같습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

현재 프로토콜은 마우스 눈에서 RPE 분리를 위해 보고, 수정 및 단순화된 세부 절차입니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈에서 분리된 RPE 세포의 핵 제거, 해부, 수집, 파종, 배양 및 특성 분석이 포함됩니다.

성공적인 RPE 분리를 위해 충족해야 하는 몇 가지 제한 사항과 중요한 단계(예: 마우스 나이, 해부된 눈의 수, 조직 배양 접시 또는 접시의 크기, 파종, 보관 및 계대 배양 후 주의 사항)가 있습니다. 분리된 세포를 최대 3-4회 통과할 수 있으려면, 가장 좋은 마우스 연령은 18-21일 사이이다. 성장하고 증식할 수 있는 합리적인 수의 분리된 세포를 가지려면 단일 분리를 위해 최소 두 개의 눈이 필요합니다. 분리를 초래하는 세포의 수는 해부된 눈의 수에 비례합니다(~220,000개의 세포/눈). 멸균 100mm 페트리 접시/플라스크는 초기 계대(P0)에서 더 많은 수의 세포를 얻기 위해 권장됩니다. 파종 후, 인큐베이터에서 조직 배양 플레이트를 이동하거나 적어도 5 일 동안 배지를 변경하여 세포를 방해해서는 안됩니다. 또한이 기술의 한계 중 하나는 분리 된 세포의 저장 및 계대입니다. 세포는 저장 (동결 및 재처리) 할 수 없으며 3-4 번만 계대 할 수 있습니다. 계대 4 후, 세포는 세포 색소 침착의 현저한 감소와 함께 길쭉한 (스핀들 모양) 크기와 모양이 변하기 시작합니다 (그림 1D).

이 프로토콜은 따르기 쉬운 몇 단계로 단순화된다는 점에서 기본 마우스 RPE 격리1 3,19,20을 위해 다른 중요하고 신뢰할 수 있는 게시된 프로토콜과 다릅니다. RPE 세포는 그의 형태, 색소침착 및 RPE65 4,5,21과 같은 특정 RPE 마커에 의해 식별될 수 있다. 뮐러 세포의 순도와 오염에 대한 검증은 분리된 세포를 뮐러 세포(vimentin)에 대한 특정 세포 마커로 염색하여 달성되었습니다.22. 전자 현미경 (EM) 검사, 단단한 접합 단백질 (TJP) 평가, FITIC 덱스트란 누출 분석 및 단분자층으로서의 RPE의 생리적 기능을 평가하는 경상피 전기 저항 (TER) 측정과 같은 시험관 내 혈액 망막 장벽 (BRB)의 무결성을 평가하기 위해 많은 기술이 사용되었습니다 8,23 . RPE 세포는 외부 BRB를 유지하는 데 중요한 역할을 하며, 이 기능을 검증하기 위해 이전에 발표된바와 같이 Zona ocludin-1(ZO-1)과 같은 긴밀한 접합 단백질(TJP)과 F-액틴과 같은 세포골격 단백질을 평가했습니다. TJP 평가는 EM 평가나 TER과 달리 모든 연구실에서 사용할 수 없는 값비싼 장비가 필요하지 않은 BRB 무결성 및 장벽 기능 평가를 위한 보다 편리한 방법입니다.

1차 RPE 분리는 기본 메커니즘과 병인을 연구하고 다양한 안과 질환에 대한 새로운 치료 응용 프로그램을 제안하는 데 중요한 도구가 될 수 있는 기술입니다. 현재의 기술은 RPE 세포 구조 및 기능의 변화와 연령 관련 황반 변성에서 외부 BRB에 미치는 영향을 연구할 수 있었습니다8. 또한 야생형 C57BL6 마우스와 다른 유전자 변형 마우스에서 분리 된 RPE 세포의 변화를 연구하고 AMD14,16에 대한 치료 표적을 찾는 다양한 약리학 적 화합물을 테스트하는 데 도움이되었습니다.

결론적으로, 사용 가능한 많은 공개 프로토콜은 1차 마우스 RPE 분리를 입증했습니다. 제시된 프로토콜은 마우스 눈에서 1차 RPE 세포를 분리하기 위해 대부분의 연구실에서 사용할 수 있는 재료, 방법 및 장비를 사용하여 일부 기존 프로토콜을 수정한 결과 생성된 단순화된 절차입니다.

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Disclosures

저자는 이 기사의 내용과 관련이 있다고 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 작업은 국립 안과 연구소 (NEI), 국립 안과 연구소 (NEI) 기금 R01 EY029751-04의 지원을 받았습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker : 100mL KIMAX 14000
Collagenase from Clostridium histolyticum  Sigma-Aldrich C7657-25MG For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile 13-711-20
DMEM/F12  gibco  11330 Media to grow RPE cells 
Fetal Bovine Serum (FBS) gibco 26140079 For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution gibco 15750-060 For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Scientific 88284 For working enzymes (A&B) 
Heracell VISO 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Hyaluronidase from bovine testes Sigma-Aldrich H3506-500MG For working enzyme A
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL B-D 309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL Grainger 11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody  Abcam, Cambridge, MA, USA ab78036 For IF staining 
Pen Strep gibco 15140-122 For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45 Dumont 72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm GARANA INDUSTRIES 2595
Sorvall St8 Centrifuge ThermoScientific 75007200
Stemi 305 Microscope Zeiss n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel Bard-Parker 371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style Corning 430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style Corning 353003
Tornado Tubes: 15mL Midsci C15B
Tornado Tubes: 50mL Midsci C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25% gibco 2186962 For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips Dumont 501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL Electron Microscopy Sciences Dumont 50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36" McKesson 4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge FST 15000-08
Zeiss AxioImager Z2 Zeiss n/a
Zeiss Zen Blue 2.6 Zeiss n/a

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References

  1. Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
  2. Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
  5. Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
  6. Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
  7. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  8. Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
  9. Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
  10. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
  11. Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
  12. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
  13. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  14. Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
  15. van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer's disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
  16. Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
  17. Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
  18. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
  19. Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020).
  21. Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
  22. Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
  23. Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
  24. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).

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생물학 189 호

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24th reference was added:

  1. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리
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Tomaszewski, R., Rajpurohit, P.,… More

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P., Cheng, M., Tawfik, A. Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. J. Vis. Exp. (189), e63543, doi:10.3791/63543 (2022).

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