Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolatie van primaire retinale gepigmenteerde epitheelcellen van muizen

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63543
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,3
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine, 3Oral Biology and Diagnostic Sciences, Dental College of Georgia, Augusta University

ERRATUM NOTICE

Summary

Dit manuscript beschrijft een vereenvoudigd protocol voor de isolatie van retinale gepigmenteerde epitheelcellen (RPE) uit muizenogen op een stapsgewijze manier. Het protocol omvat de enucleatie en dissectie van muizenogen, gevolgd door de isolatie, zaaiing en kweek van RPE-cellen.

Abstract

De retinale gepigmenteerde epitheellaag (RPE) ligt direct achter de fotoreceptoren en herbergt een complex metabolisch systeem dat verschillende cruciale rollen speelt bij het handhaven van de functie van de fotoreceptoren. De RPE-structuur en -functie zijn dus essentieel om een normaal gezichtsvermogen te behouden. Dit manuscript presenteert een vastgesteld protocol voor primaire muis RPE-celisolatie. RPE-isolatie is een geweldig hulpmiddel om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan RPE-pathologie in de verschillende muismodellen van oogaandoeningen. Bovendien kan RPE-isolatie helpen bij het vergelijken van primaire RPE-cellen van muizen die zijn geïsoleerd uit wildtype en genetisch gemodificeerde muizen, evenals het testen van geneesmiddelen die de ontwikkeling van therapie voor visuele stoornissen kunnen versnellen. Het manuscript presenteert een stap-voor-stap RPE-isolatieprotocol; de hele procedure, van enucleatie tot zaaien, duurt ongeveer 4 uur. De media mogen niet worden veranderd gedurende 5-7 dagen na het zaaien, om de groei van de geïsoleerde cellen zonder verstoring mogelijk te maken. Dit proces wordt gevolgd door de karakterisering van morfologie, pigmentatie en specifieke markers in de cellen via immunofluorescentie. Cellen kunnen maximaal drie of vier keer worden gepasseerd.

Introduction

Retinaal gepigmenteerde epitheelcellen (RPE) bevinden zich tussen het vaatvlies en het neurale netvlies en vormen een eenvoudige monolaag van kubusvormige cellen die achter de fotoreceptorcellen (PR) ligt1. De RPE speelt een cruciale rol bij het handhaven van een gezonde omgeving voor PR-cellen, voornamelijk door het verminderen van de overmatige accumulatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de daaruit voortvloeiende oxidatieve schade1. RPE-cellen houden toezicht op vele functies, zoals de conversie en opslag van retinoïden, de absorptie van verstrooid licht, vloeistof- en ionentransport en fagocytose van het pr-buitenmembraan 2,3. Veranderingen in de RPE (morfologie/functie) kunnen hun functie aantasten, wat leidt tot retinopathie en dit is een gemeenschappelijk kenmerk dat door veel oogaandoeningen wordt gedeeld4. Veel oogziekten worden geassocieerd met veranderingen in de morfologie en functie van RPE-cellen, waaronder sommige genetische ziekten zoals retinitis pigmentosa, Leber congenitale amaurosis en albinisme 4,5,6, evenals leeftijdsgebonden oculaire aandoeningen zoals diabetische retinopathie (DR) en leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD)7,8 . Menselijke cellen zijn het meest wenselijk, dus het zou ideaal zijn om RPE-stoornissen in primaire menselijke RPE-cellen te bestuderen voor het vormen van RPE-monolagen. Ethische kwesties en de beperkte beschikbaarheid van menselijke donoren vanwege het feit dat de meeste van deze aandoeningen leiden tot morbiditeit9, maar niet noodzakelijkerwijsmortaliteit 10, waardoor de isolatie van primaire menselijke RPE-cellen wordt voorkomen. Dit maakt het kweken van RPE-cellen van niet-menselijke dierlijke donoren een voorkeursalternatief. Knaagdieren, met name muizen, worden beschouwd als een geweldig model voor het bestuderen van verschillende oogziekten, omdat transgene technologie uitgebreider is ingeburgerd in deze soorten11. Hoewel het gebruik van gekweekte primaire RPE-cellen veel voordelen biedt, is het moeilijk geweest om groeiende cellen gedurende vele passages te behouden of om de cellen op te slaan en te hergebruiken. De belangrijkste beperking van dit protocol is de leeftijd van de muizen; muizen die worden gebruikt voor RPE-isolatie moeten van een zeer jonge leeftijd zijn (18-21 dagen oud is optimaal) omdat het moeilijk is geweest om RPE-cellen van volwassen muizen 11,12,13 te kweken. RPE-cellen kunnen op elke leeftijd uit muizenogen worden geïsoleerd, maar tot vier celpassages waren alleen succesvol bij jonge muizen (18-21 dagen oud). RPE-isolatie van het netvlies van muizen, met behulp van zowel C57BL6-muizen als transgene muizen met deletie van de N-methyl-D-aspartaatreceptoren (NMDARs) in de RPE-cellen, werd uitgevoerd om het effect van verhoogd aminozuur homocysteïne op de ontwikkeling en progressie van AMD14 te bestuderen. Bovendien hielpen geïsoleerde primaire RPE-cellen bij het voorstellen van een therapeutisch doelwit voor AMD door remming van de NMDARs bij RPE-cellen14. Er zijn enkele NMDAR-blokkers die zijn goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA) en momenteel worden gebruikt voor de behandeling van matige tot ernstige verwarring (dementie) gerelateerd aan de ziekte van Alzheimer (AD), zoals memantine16, die een potentieel therapeutisch doelwit voor AMD14 zou kunnen zijn. Bovendien werden geïsoleerde primaire muis RPE-cellen gebruikt voor de detectie van ontstekingsmarkers en de voorgestelde inductie van ontsteking als een onderliggend mechanisme voor homocysteïne-geïnduceerde kenmerken van AMD en AD met behulp van een genetisch gemodificeerde muis (CBS), die een hoog niveau van homocysteïne16,17 presenteert.

Dit protocol werd gebruikt om RPE-cellen te isoleren van zowel wild-type C57BL/6-muizen als transgene muizen die in ons laboratorium zijn ontwikkeld als een vereenvoudigde aanpassing van andere gepubliceerde isolatieprotocollen 13,18,19 om een gemakkelijk toepasbaar en betrouwbaar protocol te bereiken. Er is geen geslachtsvoorkeur in dit protocol. Hoewel muizenleeftijden van cruciaal belang zijn voor het isolatieproces, werden jonge, oudere muizen (18-21 dagen oud) en oudere muizen op elke leeftijd (tot 12 maanden) gebruikt voor RPE-isolatie. We merkten echter dat de RPE-cellen geïsoleerd uit de jonge muizen langer leefden en dat er maximaal vier passages konden worden uitgevoerd. De RPE-cellen geïsoleerd van oudere muizen kunnen een of twee keer worden gepasseerd, dan zouden ze stoppen met groeien met een normale snelheid en hun vorm veranderen om meer langwerpig te zijn (fibroblastachtige cellen). Verlies van pigmentatie en verminderde hechting aan de weefselkweekplaat gevolgd door loslating werd ook waargenomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dieren werden gebruikt volgens de richtlijnen van Oakland University IACUC dierprotocol nummer 21063 en de richtlijnen van de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek.

1. Oplossingsvoorbereiding

  1. Bereid de volledige RPE-celkweekmedia voor door Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) aan te vullen met 25% Foetaal Runderserum (FBS), 1,5% penicilline / streptomycine en 0,02% gentamicine.
  2. Bereid Enzym A door 741 μL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) aan te vullen met 127 μL Collagenase stockoplossing en 132 μL Hyaluronidase stockoplossing. Dit maakt een eindvolume van 1 ml, dat vier ogen kan behandelen.
    1. Bereid de Collagenase stockoplossing door 1 mg Collagenase uit Clostridium histolyticum op te lossen in 41 ml HBSS (19,5 eenheden /ml).
    2. Bereid de Hyaluronidase-stamoplossing door 1 mg Hyaluronidase uit rundertestes op te lossen in 18,4 ml HBSS (38 eenheden /ml).
  3. Bereid enzym B voor door twee delen van 0,25% trypsine-EDTA toe te voegen aan drie delen van HBSS. Merk op dat het totale volume afhankelijk is van het aantal ontleedde ogen; 1 ml enzym B kan worden gebruikt om vier ogen te behandelen.

2. Enucleatie

  1. Ethisch euthanaseren van de muis met behulp van kooldioxide (CO2) inademing volgens IACUC-normen21.
    1. Plaats de dieren in het kort in de CO2-kamer om 100% CO2 te introduceren met een vulsnelheid van 30% -70% van het kamervolume per minuut met CO2 om bewusteloosheid te bereiken binnen 2 tot 3 minuten, met minimale nood voor de muizen.
    2. Bevestig de dood (gebrek aan ademhaling en vervaagde oogkleur) en verplaats de muis vervolgens van de kooi naar een schoon gesteriliseerd chirurgisch gebied (geschrobd met alcohol) uitgerust met gesteriliseerde chirurgische apparatuur.
  2. Plaats de muis op een steriel onderpad.
  3. Enucleate de ogen door op een pincet van 5/45-stijl op het orbitale gebied te drukken om proptose te induceren, gevolgd door het pincet naar de achterkant van het oog te verplaatsen. Extraheer de ogen, met de oogzenuw intact, door de ogen voorzichtig uit de orbitale holte te trekken.
  4. Dompel met behulp van een tang de ogen onder in een microcentrifugebuis van 2 ml met 1 ml 5% povidon-jodium. Incubeer de ogen bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten.
  5. Verwijder de ogen van de povidon-jodiumoplossing en plaats ze in een petrischaaltje. Was met behulp van een steriele transferpipet de ogen met HBSS totdat de oranje kleur van het povidon-jodium verdwenen is. Dit duurt ongeveer twee of drie wasbeurten.
  6. Plaats de ogen in een nieuwe petrischaal van 60 mm en dompel ze onder in koude (2-8 °C) volledige RPE-celkweekmedia die in stap 1.1 zijn bereid.

3. Dissectie

  1. Gebruik onder een chirurgische microscoop een pincet in M5S-stijl en een Vannas-schaar om het bindweefsel en de extraoculaire spieren te verwijderen.
    OPMERKING: De dissectie gebeurt onder een weefselkap in een volledig steriele omgeving. Voor videodoeleinden werd de ontleedmicroscoop echter buiten de kap geplaatst om een demonstratie/filming van hogere kwaliteit te bereiken. Het plaatsen van een klein stukje pluisvrij tissuepapier onder het oog verbetert de stabiliteit tijdens de dissectie. De ogen kunnen dan tijdelijk (niet langer dan 1 uur) in de koude RPE-celkweekmedia worden gehouden. Het verdient echter de voorkeur om direct na het reinigen van de ogen direct door te gaan naar de volgende stap.
  2. Breng de ogen over naar een microcentrifugebuis van 2 ml met 1 ml enzym A-oplossing voor elke vier ogen. Incubeer vervolgens de ogen in een incubator bij 37 °C gedurende 40 minuten.
  3. Verwijder de ogen uit de incubator en de microcentrifugebuis. Breng ze vervolgens over naar een nieuwe microcentrifugebuis met 1 ml enzyme B-oplossing voor elke vier ogen. Incubeer de buis in een incubator bij 37 °C gedurende 50 minuten.
  4. Plaats de ogen in een nieuwe 60 mm suspensiecultuurschaal met 10 ml volledige RPE-celgroeimedia. Incubeer vervolgens de ogen bij 4 °C gedurende 30 minuten.
  5. Plaats de schaal onder een chirurgische microscoop en begin met ontleden.
  6. Verwijder het voorste deel van het oog (hoornvlies, iris en lens) van het achterste deel van de oogschelp (achterste netvlies).
    1. Pak het oog vast met een M5S-stijltang en maak een incisie in het ora serrata-gedeelte (het meest voorste deel van het netvlies waar het lichtblauw eindigt) met een # 11-mes of de naald van een spuit.
    2. Pak het binnenste deel van de incisie vast met één tang en grijp het hoornvlies vast met een ander paar tangen. Begin langzaam het hoornvlies van het netvlies te trekken of te scheuren. Zorg ervoor dat u in kleine stappen scheurt en de scheur naar beneden beweegt tijdens het verwijderen van het hoornvlies, om ervoor te zorgen dat de RPE grotendeels intact blijft en resulteert in een schonere scheur.
      OPMERKING: Zodra het hoornvlies volledig is losgemaakt, zijn de iris en de lens te zien.
    3. Scheid zowel het hoornvlies als de iris.
  7. Scheid de lens van de oogschelp met zachte compressie van de achterste helft van het oog.
  8. Om het neurale netvlies uit de RPE-laag te verwijderen, pak je de buitenste laag van de oogschelp vast met één pincet en plaats je de arm van een tweede pincet tussen zowel de RPE als de neurale lagen. Trek of schep vanaf daar voorzichtig het neurale netvlies weg van de RPE-laag. Gooi het neurale netvlies weg.
    OPMERKING: In de video worden het neurale netvlies en de lens samen verwijderd. Voor beginners zal het echter gemakkelijker zijn om ze afzonderlijk te verwijderen. Wat overblijft is de RPE, het vaatvlies en de sclera.
  9. Gooi het hoornvlies, de iris, de lens en het neurale netvlies weg. Verplaats de resterende oogschelp naar een nieuw gebied op de schaal dat vrij is van vuil.
  10. Om de RPE van het vaatvlies en de sclera te scheiden, schraapt u voorzichtig de binnenkant van de oogschelp met een pincet in 5/45-stijl om de scheiding van de RPE-cellen te garanderen. De RPE-cellen zien er troebel uit wanneer ze in het volledige RPE-celgroeimedium worden opgehangen.
  11. Aspirateer de cellen met behulp van een steriele transferpipet van 3,2 ml en breng ze over naar een nieuwe centrifugebuis van 15 ml met volledige RPE-celgroeimedia.

4. Centrifugatie

  1. Plaats de centrifugebuis van 15 ml met primaire RPE-cellen in een centrifuge en centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Aspirateer het supernatant en resuspendeer de pellet met 10 ml volledige RPE-groeimedia. De volledige RPE-groeimedia zijn specifieker voor RPE-groei dan andere verontreinigende cellen, zoals Müller-cellen of choroïdale endotheelcellen. Müller-cellen vereisen hoge glucosemedia, terwijl choroïdale endotheelcellen specifieke groeifactoren vereisen. Door de media te veranderen en de kweek te passeren, zullen alleen de RPE-cellen blijven groeien.

5. Celkweek

  1. Plaats de geresuspendeerde primaire RPE-cellen op een steriel petrischaaltje van 100 mm en breng ze over naar een incubator (na controle van de zuiverheid door cellen te kleuren met specifieke RPE/Müller-celmarkers, zoals aangegeven in figuur 1E-N). Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2.
    OPMERKING: De gebruikte markers worden vermeld in de tabel met materialen. Deze stap wordt uitgevoerd nadat de cultuur is vastgesteld.
  2. Incubeer de cellen gedurende ongeveer 5 dagen om te groeien. Verander gedurende deze tijd de media niet, verstoor de cellen niet en verplaats de celkweekplaat niet (dit is een kritieke stap in het protocol; na isolatie moeten de cellen worden geïncubeerd en gedurende 5 dagen niet worden verstoord).
    OPMERKING: Het aantal cellen is afhankelijk van het aantal ogen dat voor de isolatie wordt gebruikt. Een groter aantal geïsoleerde ogen zal een groter aantal cellen opleveren. RPE-isolatie van twee ogen levert ~ 440.000-880.000 cellen op, of 5% -10% van de petrischaal van 100 mm, die 8,8 miljoen cellen kan bevatten.

6. Passen

  1. Haal de media eruit en was met 2 ml PBS. Adem vervolgens de PBS uit.
  2. Voeg 4 ml 0,25% Trypsin-EDTA (1x) toe, of genoeg om de basis van het gerecht te bedekken. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Voeg 8 ml voorverwarmde RPE-media toe of tweemaal het volume van de hoeveelheid trypsine die in stap 6.2 is gebruikt. Verzamel vervolgens de cellen en plaats ze in een centrifugebuis van 15 ml.
  4. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur. Aspirateer het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml volledige RPE-celkweekmedia. Plaats de hele suspensie in een steriele petrischaal van 100 mm.
    OPMERKING: De cellen kunnen tot vier of vijf keer18 worden doorgegeven. De meest consistente experimentresultaten worden echter gevonden na twee of drie passages. Na twee tot vier passages veranderden de cellen van vorm (zoals weergegeven in figuur 1D) om langer te zijn, zich op te hopen in het midden van de plaat, te stoppen met groeien en los te maken.
  5. Gebruik immunofluorescentieprotocollen, volgens de eerder gepubliceerde methoden 8,14,15,16, om de RPE-specificiteit te kleuren en te valideren.

7. Immunofluorescentie

OPMERKING: Immunofluorescentie werd uitgevoerd volgens de eerder gepubliceerde methoden 8,14,15,16,17,18 om de RPE-specificiteit te kleuren en te valideren. De kleuring van primaire RPE-cellen werd meestal gedaan bij passages P1 en P2. Hier wordt een kort overzicht van het immunofluorescentieprotocol gepresenteerd.

  1. Zaai de cellen op een celkweekkamerschuif (30.000 cellen per put voor de 8-well kamerdia).
  2. Kweek de cellen in volledige RPE-celkweekmedia bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24-48 uur.
  3. Wanneer de cellen 80% -90% samenvloeiend zijn, adem dan de media uit en was de kamerschuif met 1x PBS.
  4. Bevestig de dia met 4% paraformaldehyde gedurende 10-15 minuten.
  5. Zuig de 4% paraformaldehyde uit en blokkeer vervolgens met een blokkerende oplossing (zie Materiaaltabel).
  6. Adem de blokkerende oplossing uit en voeg het primaire antilichaam, RPE65, toe en incubeer gedurende drie uur bij 37 °C (met een antilichaamconcentratie variërend van 1:200-1:250 in blokkerende buffer, bij een volume van 150-200 μL/dia). Was vervolgens drie keer met PBS/TX-100 (5-10 minuten per wasbeurt).
  7. Aspirateer het primaire antilichaam en voeg het secundaire antilichaam toe (met een antilichaamconcentratie van 1:1.000 in blokkerende buffer, bij een volume van 150-200 μL/dia). Incubeer gedurende één uur bij 37 °C.
  8. Aspirateer het secundaire antilichaam. Was drie keer met PBS/Trtion X-100 (5-10 min per wasbeurt).
  9. Voeg een druppel DAPI-montagemedium toe om de kernen te labelen en plaats een afdeksel over de dia. Zorg ervoor dat er geen bubbels onder de coverslip zitten.
  10. Maak vervolgens foto's met een fluorescerende microscoop, vergezeld van een hoge-resolutie microscoop (HRM) camera en beeldverwerkingssoftware (zie Tabel van materialen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validatie van de specificiteit, zuiverheid en barrièrefunctie/vorming van geïsoleerde RPE-cellen
De geïsoleerde cellen werden onderzocht onder een lichtmicroscoop om hun levensvatbaarheid, morfologie en pigmentatie te verifiëren. Beelden van P0 en P1 (figuur 1A,B) en beelden van P0 en P4 werden vastgelegd (figuur 1C,D) om de veranderingen in de cellen weer te geven; vorm, grootte en pigmentatie terwijl de passages doorgingen naar de vierde passage (zwarte pijlen wijzen naar de geïsoleerde RPE-cellen in P4). Een antilichaam voor het RPE65-eiwit werd gebruikt om de identiteit van de geïsoleerde cellen te verifiëren. Immunofluorescentiekleuring van de geïsoleerde cellen werd uitgevoerd met een antilichaam tegen RPE65, gevolgd door onderzoek onder de fluorescerende microscoop (figuur 1E, F: lage vergroting en figuur 1G, H: hoge vergroting, met positief gekleurde RPE-cellen in groen en een nucleaire marker, DAPI, in blauw). RPE65 is een isomerohydrolase dat tot expressie komt in de RPE. Het is essentieel voor de regeneratie van het visuele pigment dat nodig is voor staaf- en kegelgemedieerd zicht21 . Om de barrièrefunctie van de geïsoleerde te valideren
cellen, zowel cytoskeletaal eiwit F-actine als tight junction eiwit ZO-1 immunofluorescentiekleuring8 voor de geïsoleerde cellen werden gebruikt (Figuur 1I,J: groene ZO-1 en blauwe nucleaire kleuring). en Figuur 1K,L: rode F-actine en blauwe nucleaire kleuring). De typische kasseivorm van de RPE is echter zeer duidelijk wanneer cellen volledig samenvloeien.

Negatieve controle werd gebruikt in de experimenten waarbij het secundaire antilichaam werd toegevoegd aan de RPE-cellen zonder het primaire antilichaam toe te voegen, om ervoor te zorgen dat de specificiteit van het antilichaam en de resulterende kleur specifiek is voor de antilichamen die werden gebruikt (niet getoond).

Om de zuiverheid en verontreiniging van de geïsoleerde RPE door Müller-cellen te valideren, werd immunofluorescentiekleuring van de geïsoleerde cellen met een specifieke celmarker voor Müller-cellen, vimentine, gebruikt (groen en blauw voor nucleaire kleuring zoals weergegeven in figuur 1M, N) met Müller-cellen als een positieve controle. Geïsoleerde RPE-cellen vertoonden negatieve kleuring voor vimentine.

De geïsoleerde cellen werden onderzocht onder een lichtmicroscoop om hun levensvatbaarheid, morfologie en pigmentatie te verifiëren. Afbeeldingen van P0 en P1 (figuur 1K, L) en afbeeldingen van P0 en P4 werden vastgelegd (figuur 1M, N) om de veranderingen in de vorm, grootte en pigmentatie van de cellen weer te geven terwijl de passages doorgingen naar de vierde passage (zwarte pijlen wijzen naar de geïsoleerde RPE-cellen in P4).

Figure 1
Figuur 1: RPE-isolatievalidatie. (A) Lichtmicroscoop voor RPE passage nul (P0). (B) Lichtmicroscoop voor RPE passage één (P1). (C) Morfologiekarakterisering op P0. (D) Morfologiekarakterisering op P4. (E) Immunostaining voor RPE65 bij lage vergroting. (F) Immunostaining voor RPE65 met nucleaire kleuring met DAPI. (G) Immunostaining voor RPE65 bij hoge vergroting. (H) Immunostaining voor RPE65 met nucleaire kleuring met DAPI bij hoge vergroting. (I) ZO-1 kleuring voor RPE-cellen. (G) ZO-1 kleuring voor RPE cellen met nucleaire kleuring met DAPI. (K) F-actinekleuring voor RPE-cellen. (L) F-actinekleuring voor RPE-cellen met nucleaire kleuring met DAPI. (M) Vimentinekleuring voor RPE-cellen. (N) Vimentinekleuring voor Müller-cellen als een positieve controle (RMc-1) met nucleaire kleuring met DAPI. Schaalstaven zijn gelijk aan respectievelijk 300 μm, 20 μm, 300 μm, 300 μm, 50 μm, 10 μm, 50 μm, 50 μm en 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het huidige protocol is een gerapporteerde, gewijzigde en vereenvoudigde gedetailleerde procedure voor RPE-isolatie van muizenogen. Het protocol omvat enucleatie, dissectie, verzameling, zaaien, cultuur en karakterisering van RPE-cellen geïsoleerd uit muizenogen.

Er zijn enkele beperkingen en kritieke stappen waaraan moet worden voldaan voor succesvolle RPE-isolatie, zoals de leeftijd van muizen, het aantal ontlede ogen, de grootte van de weefselkweekplaat of -schaal en waarschuwingen na het zaaien, opslaan en passeren. Om de geïsoleerde cellen tot drie of vier keer te kunnen passeren, zijn de beste muizenleeftijden tussen de 18-21 dagen. Om een redelijk aantal geïsoleerde cellen te hebben die in staat zijn om te groeien en zich te vermenigvuldigen, zijn ten minste twee ogen nodig voor enkele isolatie. Het aantal cellen dat resulteert in isolatie is evenredig met het aantal ontleedde ogen (~ 220.000 cellen / oog). Een steriele petrischaal/kolf van 100 mm wordt aanbevolen om een groter aantal cellen in een vroege passage (P0) te verkrijgen. Na het zaaien mogen cellen niet worden verstoord door de weefselkweekplaat van de incubator te verplaatsen of door de media gedurende ten minste 5 dagen te veranderen. Een van de beperkingen van deze techniek is ook de opslag en passaging van de geïsoleerde cellen. Cellen kunnen niet worden opgeslagen (bevroren en opnieuw gezaagd) en kunnen slechts drie of vier keer worden gepasseerd. Na passage 4 beginnen cellen hun grootte en vorm te veranderen om langwerpig te worden (spindelvorm) met een duidelijke afname van celpigmentatie (figuur 1D).

Dit protocol verschilt van andere waardevolle en betrouwbare gepubliceerde protocollen voor primaire muis RPE-isolatie1 3,19,20 doordat het is vereenvoudigd met een paar stappen die gemakkelijk te volgen zijn. RPE-cellen kunnen worden geïdentificeerd aan de hand van hun morfologie, pigmentatie en specifieke RPE-markers zoals RPE65 4,5,21. Validatie van de zuiverheid en verontreiniging van Müller-cellen werd bereikt door geïsoleerde cellen te kleuren met een specifieke celmarker voor Müller-cellen (vimentine)22. Veel technieken zijn gebruikt om de integriteit van de bloed-retinale barrière (BRB) in vitro te evalueren, zoals elektronenmicroscoop (EM) onderzoek, beoordeling van tight junction eiwitten (TJPs), FITIC dextran lekkage assay, en transepitheliale elektrische weerstand (TER) meting die de fysiologische functie van RPE evalueert als een monolaag 8,23 . RPE-cellen spelen een belangrijke rol bij het handhaven van de buitenste BRB, en om deze functie te valideren, evalueerden we tight junction-eiwitten (TJPs) zoals Zona ocludin-1 (ZO-1) en cytoskeletale eiwitten zoals F-actine zoals eerder gepubliceerd8. TJPs-evaluatie is een handigere methode voor de evaluatie van BRB-integriteit en barrièrefunctie waarvoor geen dure apparatuur nodig is die mogelijk niet in alle onderzoekslaboratoria beschikbaar is, in tegenstelling tot EM-evaluatie of TER.

Primaire RPE-isolatie is een techniek die een belangrijk hulpmiddel kan zijn om onderliggende mechanismen en pathogenese te bestuderen en om nieuwe therapeutische toepassingen voor verschillende oogziekten voor te stellen. De huidige techniek maakte het mogelijk om de veranderingen in de structuur en functie van RPE-cellen en hun impact op de buitenste BRB bij leeftijdsgebonden maculaire degeneratie8 te bestuderen. Bovendien hielp het bij het bestuderen van de veranderingen in RPE-cellen geïsoleerd uit wild-type C57BL6-muizen en verschillende genetisch gemodificeerde muizen, evenals het testen van de verschillende farmacologische verbindingen op zoek naar een therapeutisch doelwit voor AMD14,16.

Kortom, veel beschikbare gepubliceerde protocollen toonden primaire muis RPE-isolatie. Het gepresenteerde protocol is een vereenvoudigde procedure die het resultaat is van het wijzigen van enkele bestaande protocollen, met behulp van materiaal, methoden en apparatuur die beschikbaar zijn in de meeste onderzoekslaboratoria om primaire RPE-cellen uit muizenogen te isoleren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren die relevant zijn voor de inhoud van dit artikel.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) fonds R01 EY029751-04

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker : 100mL KIMAX 14000
Collagenase from Clostridium histolyticum  Sigma-Aldrich C7657-25MG For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile 13-711-20
DMEM/F12  gibco  11330 Media to grow RPE cells 
Fetal Bovine Serum (FBS) gibco 26140079 For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution gibco 15750-060 For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Scientific 88284 For working enzymes (A&B) 
Heracell VISO 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Hyaluronidase from bovine testes Sigma-Aldrich H3506-500MG For working enzyme A
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL B-D 309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL Grainger 11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody  Abcam, Cambridge, MA, USA ab78036 For IF staining 
Pen Strep gibco 15140-122 For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45 Dumont 72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm GARANA INDUSTRIES 2595
Sorvall St8 Centrifuge ThermoScientific 75007200
Stemi 305 Microscope Zeiss n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel Bard-Parker 371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style Corning 430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style Corning 353003
Tornado Tubes: 15mL Midsci C15B
Tornado Tubes: 50mL Midsci C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25% gibco 2186962 For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips Dumont 501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL Electron Microscopy Sciences Dumont 50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36" McKesson 4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge FST 15000-08
Zeiss AxioImager Z2 Zeiss n/a
Zeiss Zen Blue 2.6 Zeiss n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
  2. Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
  5. Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
  6. Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
  7. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  8. Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
  9. Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
  10. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
  11. Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
  12. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
  13. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  14. Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
  15. van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer's disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
  16. Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
  17. Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
  18. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
  19. Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020).
  21. Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
  22. Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
  23. Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
  24. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).

Tags

Biologie Nummer 189

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24th reference was added:

  1. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
Isolatie van primaire retinale gepigmenteerde epitheelcellen van muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P.,… More

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P., Cheng, M., Tawfik, A. Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. J. Vis. Exp. (189), e63543, doi:10.3791/63543 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter