Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av primære retinale retinale pigmenterte epitelceller

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63543
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,3
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine, 3Oral Biology and Diagnostic Sciences, Dental College of Georgia, Augusta University

ERRATUM NOTICE

Summary

Dette manuskriptet beskriver en forenklet protokoll for isolering av retinale pigmenterte epitelceller (RPE) fra museøyne på en trinnvis måte. Protokollen inkluderer enukleasjon og disseksjon av museøyne, etterfulgt av isolering, såing og dyrking av RPE-celler.

Abstract

Det retinale pigmenterte epitellaget (RPE) ligger rett bak fotoreceptorene og har et komplekst metabolsk system som spiller flere kritiske roller for å opprettholde fotoreceptorenes funksjon. Dermed er RPE-strukturen og funksjonen avgjørende for å opprettholde normal syn. Dette manuskriptet presenterer en etablert protokoll for primær mus RPE-celleisolasjon. RPE-isolasjon er et flott verktøy for å undersøke de molekylære mekanismene som ligger til grunn for RPE-patologi i de forskjellige musemodellene av okulære lidelser. Videre kan RPE-isolasjon bidra til å sammenligne primære muse-RPE-celler isolert fra villtype og genetisk modifiserte mus, samt teste stoffer som kan akselerere utviklingen av terapi for synsforstyrrelser. Manuskriptet presenterer en trinnvis RPE-isolasjonsprotokoll; Hele prosedyren, fra enukleasjon til såing, tar omtrent 4 timer. Mediene bør ikke endres i 5-7 dager etter såing, for å tillate vekst av de isolerte cellene uten forstyrrelser. Denne prosessen etterfølges av karakterisering av morfologi, pigmentering og spesifikke markører i cellene via immunfluorescens. Celler kan passeres maksimalt tre eller fire ganger.

Introduction

Retinal pigmentert epitel (RPE) celler ligger mellom choroid og nevrale retina, og danner et enkelt monolag av kuboidale celler som ligger bak fotoreceptor (PR) celler1. RPE spiller en kritisk rolle i å opprettholde et sunt miljø for PR-celler, hovedsakelig ved å redusere overdreven akkumulering av reaktive oksygenarter (ROS) og påfølgende oksidativ skade1. RPE-celler overvåker mange funksjoner, for eksempel konvertering og lagring av retinoider, absorpsjon av spredt lys-, væske- og ionetransport og fagocytose av skur PR ytre segmentmembran 2,3. Endringer i RPE (morfologi / funksjon) kan svekke deres funksjon som fører til retinopati, og dette er et vanlig trekk som deles av mange okulære lidelser4. Mange okulære sykdommer er forbundet med endringer i morfologien og funksjonen til RPE-celler, inkludert noen genetiske sykdommer som retinitis pigmentosa, Leber medfødt amaurose og albinisme 4,5,6, samt aldersrelaterte okulære lidelser som diabetisk retinopati (DR) og aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD)7,8 . Menneskelige celler er de mest ønskelige, og det ville derfor være ideelt å studere RPE-lidelser i primære menneskelige RPE-celler for å danne RPE-monolag. Etiske forhold og den begrensede tilgjengeligheten av menneskelige givere skyldes imidlertid at de fleste av disse lidelsene fører til sykelighet9, men ikke nødvendigvis dødelighet10, og forhindrer dermed isolering av primære humane RPE-celler. Dette gjør dyrking av RPE-celler fra ikke-menneskelige dyredonorer til et foretrukket alternativ. Gnagere, spesielt mus, regnes som en flott modell for å studere forskjellige okulære sykdommer siden transgen teknologi er mer omfattende etablert i disse artene11. Selv om bruken av dyrkede primære RPE-celler gir mange fordeler, har det vært vanskelig å opprettholde voksende celler i mange passasjer, eller å lagre og gjenbruke cellene. Hovedbegrensningen i denne protokollen er musens alder; mus som brukes til RPE-isolasjon bør være i svært ung alder (18-21 dager gammel er optimal) da det har vært vanskelig å dyrke RPE-celler fra voksne mus11,12,13. RPE-celler kan isoleres fra museøyne i alle aldre, men opptil fire cellepassasjer var bare vellykket med unge mus (18-21 dager gamle). RPE-isolasjon fra musehinner, ved bruk av både C57BL6-mus og transgene mus med delesjon av N-metyl-D-aspartatreseptorene (NMDARer) ved RPE-cellene, ble utført for å studere effekten av forhøyet aminosyrehomocystein på utvikling og progresjon av AMD14. I tillegg bidro isolerte primære RPE-celler til å foreslå et terapeutisk mål for AMD ved inhibering av NMDARene ved RPE-celler14. Det er noen NMDAR-blokkere som er godkjent av Food and Drug Administration (FDA) og brukes for tiden til å behandle moderat til alvorlig forvirring (demens) relatert til Alzheimers sykdom (AD), for eksempel memantin16, som kan være et potensielt terapeutisk mål for AMD14. Videre ble isolerte primære muse-RPE-celler brukt til påvisning av inflammatoriske markører og den foreslåtte induksjonen av betennelse som en underliggende mekanisme for homocysteininduserte egenskaper av AMD og AD ved hjelp av en genetisk modifisert mus (CBS), som presenterer et høyt nivå av homocystein16,17.

Denne protokollen ble brukt til å isolere RPE-celler fra både villtype C57BL / 6-mus og transgene mus utviklet i vårt laboratorium som en forenklet tilpasning av andre publiserte isolasjonsprotokoller13,18,19 for å nå en lett anvendelig og pålitelig protokoll. Det er ingen kjønnspreferanse i denne protokollen. Mens musealder er kritiske for isolasjonsprosessen, ble unge, eldre mus (18-21 dager gamle) og eldre mus i alle aldre (opptil 12 måneder) brukt til RPE-isolasjon. Vi la imidlertid merke til at RPE-cellene isolert fra de unge musene levde lenger, og opptil fire passasjer kunne utføres. RPE-cellene isolert fra eldre mus kunne passeres en eller to ganger, da ville de slutte å vokse med normal hastighet og endre form for å bli lengre (fibroblastlignende celler). Tap av pigmentering og redusert vedheft til vevskulturplaten etterfulgt av løsrivelse ble også observert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyr ble brukt i henhold til retningslinjene fra Oakland University IACUC dyreprotokoll nummer 21063 og retningslinjene i ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning.

1. Klargjøring av oppløsning

  1. Forbered det komplette RPE-cellekulturmediet ved å supplere Dulbeccos modifiserte Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) med 25% Fetal Bovine Serum (FBS), 1,5% penicillin / streptomycin og 0,02% gentamicin.
  2. Forbered enzym A ved å supplere 741 μL av Hanks balanserte saltløsning (HBSS) med 127 μL kollagenaseoppløsning og 132 μL hyaluronidase-stamløsning. Dette gir et sluttvolum på 1 ml, som kan behandle fire øyne.
    1. Klargjør stamløsningen for kollagenase ved å oppløse 1 mg kollagenase fra Clostridium histolyticum i 41 ml HBSS (19,5 enheter/ml).
    2. Klargjør Hyaluronidase stamløsning ved å oppløse 1 mg Hyaluronidase fra storfe testikler i 18,4 ml HBSS (38 enheter / ml).
  3. Forbered enzym B ved å legge til to deler av 0,25% trypsin-EDTA til tre deler av HBSS. Merk at totalvolumet er avhengig av antall øyne dissekert; 1 ml enzym B kan brukes til å behandle fire øyne.

2. Enukleasjon

  1. Avliv musen etisk ved hjelp av innånding av karbondioksid (CO2) i henhold til IACUC-standarder21.
    1. Kort sagt, plasser dyret (e) i CO 2-kammeret for å introdusere 100% CO 2 med en fyllingshastighet på 30% -70% av kammervolumet per minutt med CO 2 for å oppnå bevisstløshet innen2 til 3 minutter, med minimal nød for musene.
    2. Bekreft døden (mangel på respirasjon og bleknet øyenfarge), flytt deretter musen fra buret til et rent sterilisert kirurgisk område (skrubbet med alkohol) utstyrt med sterilisert kirurgisk utstyr.
  2. Plasser musen på en steril underpad.
  3. Enucleate øynene ved å trykke 5/45 stil pinsett på orbitalområdet for å indusere proptose, etterfulgt av å flytte pinsetten til bakre av øyet. Trekk ut øynene, med optisk nerve intakt, ved å trekke øynene forsiktig fra orbitalhulen.
  4. Bruk tang, senk øynene i et 2 ml mikrosentrifugerør som inneholder 1 ml 5% povidon-jod. Inkuber øynene ved romtemperatur i 2-3 min.
  5. Fjern øynene fra povidon-jodoppløsningen og legg dem i en petriskål. Bruk en steril overføringspipette, vask øynene med HBSS til den oransje fargen på povidon-jodet er borte. Dette tar rundt to eller tre vasker.
  6. Plasser øynene i en ny 60 mm petriskål og senk dem i kalde (2-8 °C) komplette RPE-cellekulturmedier tilberedt i trinn 1.1.

3. Disseksjon

  1. Under et kirurgisk mikroskop, bruk pinsett i M5S-stil og Vannas saks for å fjerne bindevev og ekstraokulære muskler.
    MERK: Disseksjonen gjøres under en vevshette i et helt sterilt miljø. For videoformål ble imidlertid dissekeringsmikroskopet plassert utenfor panseret for å oppnå en demonstrasjon/filming av høyere kvalitet. Plassering av et lite stykke lofritt silkepapir under øyet forbedrer stabiliteten under disseksjon. Øynene kan da holdes midlertidig (ikke i mer enn 1 time) i det kalde RPE-cellekulturmediet. Det er imidlertid å foretrekke å gå videre til neste trinn umiddelbart etter rengjøring av øynene.
  2. Overfør øynene til et 2 ml mikrosentrifugerør som inneholder 1 ml enzym A-løsning for hvert fjerde øye. Inkuber deretter øynene i en inkubator ved 37 ° C i 40 minutter.
  3. Fjern øynene fra inkubatoren og mikrosentrifugerøret. Overfør dem deretter til et nytt mikrosentrifugerør som inneholder 1 ml enzym B-løsning for hvert fjerde øye. Inkuber røret i en inkubator ved 37 °C i 50 minutter.
  4. Plasser øynene i en ny 60 mm suspensjonskulturskål som inneholder 10 ml komplette RPE-cellevekstmedier. Inkuber deretter øynene ved 4 ° C i 30 minutter.
  5. Plasser parabolen under et kirurgisk mikroskop og begynn å dissekere.
  6. Fjern den fremre delen av øyet (hornhinnen, iris og linsen) fra den bakre delen av øyekoppen (bakre netthinne).
    1. Ta tak i øyet med tang i M5S-stil og gjør et snitt i ora serrata-delen (mest fremre del av netthinnen der den lyseblå ender) med et # 11-blad eller nålen på en sprøyte.
    2. Ta tak i den indre delen av snittet med ett par tang, og ta tak i hornhinnen med et annet par tang. Begynn å sakte trekke eller rive hornhinnen fra netthinnen. Sørg for å rive i små trinn og flytte ned tåre mens du fjerner hornhinnen, for å sikre at RPE forblir stort sett intakt og resulterer i en renere tåre.
      MERK: Når hornhinnen er helt løsrevet, kan iris og linse sees.
    3. Skill både hornhinnen og iris.
  7. Skill linsen fra øyeklokken med forsiktig kompresjon av den bakre halvdelen av øyet.
  8. For å fjerne nevrale netthinnen fra RPE-laget, ta tak i det ytre laget av øyeklokken med ett par pinsett og plasser armen til et andre par pinsett mellom både RPE og nevrale lag. Derfra trekker eller øser du forsiktig nevrale netthinnen bort fra RPE-laget. Kast nevrale netthinnen.
    MERK: I videoen fjernes den nevrale netthinnen og linsen sammen. For nybegynnere vil det imidlertid være lettere å fjerne hver for seg. Det som gjenstår er RPE, choroid og sclera.
  9. Kast hornhinnen, iris, linsen og nevrale netthinnen. Flytt den gjenværende øyeklokken til et nytt område på tallerkenen uten rusk.
  10. For å skille RPE fra choroid og sclera, skrap forsiktig innsiden av øyekoppen med 5/45 stil pinsett for å sikre separasjon av RPE-cellene. RPE-cellene virker uklare når de er suspendert i hele RPE-cellevekstmediet.
  11. Aspirer cellene ved hjelp av en 3,2 ml steril overføringspipette og overfør til et nytt 15 ml sentrifugerør som inneholder komplette RPE-cellevekstmedier.

4. Sentrifugering

  1. Plasser 15 ml sentrifugerøret som inneholder primære RPE-celler inne i en sentrifuge og sentrifuger cellene ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
  2. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten med 10 ml komplett RPE vekstmedier. Det komplette RPE-vekstmediet er mer spesifikt for RPE-vekst enn andre forurensende celler, for eksempel Müller-celler eller koroidale endotelceller. Müller-celler krever høye glukosemedier, mens koroidale endotelceller krever spesifikke vekstfaktorer. Ved å endre media og passere kulturen, vil bare RPE-cellene fortsette å vokse.

5. Cellekultur

  1. Plate de resuspenderte primære RPE-cellene på en steril 100 mm petriskål og overfør dem til en inkubator (etter å ha verifisert renheten ved å farge celler med spesifikke RPE / Müller-cellemarkører, som angitt i figur 1E-N). Inkuber cellene ved 37 °C og 5 % CO2.
    MERK: Markørene som brukes er nevnt i materialtabellen. Dette trinnet utføres etter at kulturen er etablert.
  2. Inkuber cellene i ca 5 dager for å vokse. I løpet av denne tiden må du ikke endre media, forstyrre cellene eller flytte cellekulturplaten (dette er et kritisk trinn i protokollen; etter isolasjon skal cellene inkuberes og ikke forstyrres i 5 dager).
    MERK: Antall celler avhenger av antall øyne som brukes til isolasjonen. Et større antall isolerte øyne vil gi et større antall celler. RPE-isolasjon fra to øyne vil gi ~ 440 000-880 000 celler, eller 5% -10% av 100 mm petriskålen, som kan holde 8,8 millioner celler.

6. Bestått

  1. Aspirer ut media og vask med 2 ml PBS. Deretter aspirere ut PBS.
  2. Tilsett 4 ml 0,25% trypsin-EDTA (1x), eller nok til å dekke bunnen av parabolen. Inkuber i 5-10 minutter ved romtemperatur.
  3. Legg til 8 ml forvarmede RPE-medier eller dobbelt så mye som volumet av hvor mye trypsin som ble brukt i trinn 6.2. Samle deretter cellene og legg dem i et 15 ml sentrifugerør.
  4. Sentrifuge ved 300 x g i 7 minutter ved romtemperatur. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 10 ml komplette RPE-cellekulturmedier. Legg hele suspensjonen i en steril 100 mm petriskål.
    MERK: Cellene kan passeres opptil fire eller fem ganger18. Imidlertid er de mest konsistente eksperimentresultatene funnet etter to eller tre passasjer. Etter to til fire passasjer endret cellene form (som vist i figur 1D) for å være lengre, akkumulert midt på platen, sluttet å vokse og løsnet.
  5. Bruk immunfluorescensprotokoller, i henhold til de tidligere publiserte metodene 8,14,15,16, for å flekke og validere RPE-spesifisiteten.

7. Immunfluorescens

MERK: Immunfluorescens ble utført i henhold til de tidligere publiserte metodene 8,14,15,16,17,18 for å flekke og validere RPE-spesifisiteten. Fargingen av primære RPE-celler ble vanligvis gjort ved passasjer P1 og P2. Her presenteres en kort oversikt over immunfluorescerende protokoll.

  1. Frø cellene på et cellekulturkammer lysbilde (30.000 celler per brønn for 8-brønns kammersklie).
  2. Dyrk cellene i komplette RPE-cellekulturmedier ved 37 °C og 5 % CO2 i 24-48 timer.
  3. Når cellene er 80% -90% sammenflytende, aspirer ut media og vask kammeret lysbildet med 1x PBS.
  4. Fest lysbildet med 4% paraformaldehyd i 10-15 min.
  5. Aspirer ut 4% paraformaldehyd og blokker deretter med blokkeringsløsning (se materialfortegnelse).
  6. Aspirer ut blokkeringsløsningen og tilsett det primære antistoffet, RPE65, og inkuber i tre timer ved 37 ° C (med en antistoffkonsentrasjon fra 1: 200-1: 250 i blokkeringsbuffer, ved et volum på 150-200 μL / lysbilde). Vask deretter tre ganger med PBS/TX-100 (5-10 min hver vask).
  7. Aspirer ut det primære antistoffet og legg til det sekundære antistoffet (med en antistoffkonsentrasjon 1: 1000 i blokkeringsbuffer, i et volum på 150-200 μL / lysbilde). Inkuber i en time ved 37 °C.
  8. Aspirer ut det sekundære antistoffet. Vask tre ganger med PBS/Trtion X-100 (5-10 min hver vask).
  9. Legg til en dråpe DAPI-monteringsmedium for å merke kjernene og legg en deksel over lysbildet. Forsikre deg om at det ikke er bobler under dekselet.
  10. Ta deretter bilder med et fluorescerende mikroskop, ledsaget av et høyoppløselig mikroskop (HRM) kamera og bildebehandlingsprogramvare (se materialfortegnelse).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validering av spesifisitet, renhet og barrierefunksjon/dannelse av isolerte RPE-celler
De isolerte cellene ble undersøkt under et lysmikroskop for å verifisere deres levedyktighet, morfologi og pigmentering. Bilder fra P0 og P1 (figur 1A, B) og bilder fra P0 og P4 ble tatt (figur 1C, D) for å vise endringene i cellene; form, størrelse og pigmentering da passasjene gikk videre til fjerde passasje (svarte piler peker på de isolerte RPE-cellene i P4). Et antistoff for RPE65-proteinet ble brukt til å verifisere identiteten til de isolerte cellene. Immunfluorescensfarging av de isolerte cellene ble utført med et antistoff mot RPE65, etterfulgt av undersøkelse under fluorescerende mikroskop (figur 1E, F: lav forstørrelse og figur 1G, H: høy forstørrelse, som viser positivt fargede RPE-celler i grønt og en nukleær markør, DAPI, i blått). RPE65 er en isomerohydrolase uttrykt i RPE. Det er viktig for regenerering av det visuelle pigmentet som kreves for stenger- og keglemediert syn21 . For å validere barrierefunksjonen til den isolerte
celler, ble det brukt både cytoskjelettprotein F-aktin og tett kryssprotein ZO-1 immunfluorescensfarging8 for de isolerte cellene (figur 1I, J: grønn ZO-1 og blå nukleærfarging). og figur 1K,L: rød F-aktin og blå nukleærfarging). Imidlertid er den typiske brosteinsformen til RPE veldig tydelig når cellene er fullt sammenflytende.

Negativ kontroll ble brukt i forsøkene der det sekundære antistoffet ble tilsatt RPE-cellene uten å legge til det primære antistoffet, for å sikre at spesifisiteten til antistoffet og den resulterende fargen er spesifikk for antistoffene som ble brukt (ikke vist).

For å validere renheten og kontamineringen av det isolerte RPE av Müller-celler, ble immunfluorescensfarging av de isolerte cellene med en spesifikk cellemarkør for Müller-celler, vimentin, brukt (grønn og blå for nukleær farging som vist i figur 1M, N) ved bruk av Müller-celler som en positiv kontroll. Isolerte RPE-celler viste negativ farging for vimentin.

De isolerte cellene ble undersøkt under et lysmikroskop for å verifisere deres levedyktighet, morfologi og pigmentering. Bilder fra P0 og P1 (figur 1K, L) og bilder fra P0 og P4 ble tatt (figur 1M, N) for å vise endringene i cellenes form, størrelse og pigmentering når passasjene gikk videre til fjerde passasje (svarte piler peker på de isolerte RPE-cellene i P4).

Figure 1
Figur 1: Validering av RPE-isolasjon. (A) Lysmikroskop for RPE-passasje null (P0). (B) Lysmikroskop for RPE-passasje en (P1). (C) Morfologikarakterisering ved P0. (D) Morfologikarakterisering på P4. (E) Immunostaining for RPE65 ved lav forstørrelse. (F) Immunostaining for RPE65 med nukleær farging med DAPI. (G) Immunostaining for RPE65 ved høy forstørrelse. (H) Immunostaining for RPE65 med kjernefysisk farging med DAPI ved høy forstørrelse. (I) ZO-1-farging for RPE-celler. (G) ZO-1-farging for RPE-celler med nukleær farging med DAPI. (K) F-aktinfarging for RPE-celler. (L) F-aktinfarging for RPE-celler med nukleær farging med DAPI. (M) Vimentinfarging for RPE-celler. (N) Vimentinfarging for Müller-celler som en positiv kontroll (RMc-1) med nukleær farging med DAPI. Skalastenger er henholdsvis 300 μm, 20 μm, 300 μm, 300 μm, 50 μm, 10 μm, 50 μm, 50 μm og 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nåværende protokollen er en rapportert, modifisert og forenklet detaljert prosedyre for RPE-isolasjon fra museøyne. Protokollen inkluderer enukleasjon, disseksjon, innsamling, såing, kultur og karakterisering av RPE-celler isolert fra museøyne.

Det er noen begrensninger og kritiske trinn som må oppfylles for vellykket RPE-isolasjon, for eksempel musealder, antall øyne dissekert, størrelsen på vevskulturplaten eller parabolen, og forsiktighetsregler etter såing, lagring og passering. For å kunne passere de isolerte cellene opptil tre eller fire ganger, er de beste musealderen mellom 18-21 dager. For å ha et rimelig antall isolerte celler som er i stand til å vokse og formere seg, er det nødvendig med minst to øyne for enkelt isolasjon. Antall celler som resulterer i isolasjon er proporsjonalt med antall øyne dissekert (~ 220 000 celler / øye). En steril 100 mm petriskål/kolbe anbefales for å oppnå et større antall celler i en tidlig passasje (P0). Etter såing bør celler ikke forstyrres ved å flytte vevskulturplaten fra inkubatoren eller ved å bytte media i minst 5 dager. En av begrensningene i denne teknikken er også lagring og passering av de isolerte cellene. Celler kan ikke lagres (fryses og tines) og kan bare passeres tre eller fire ganger. Etter passasje 4 begynner cellene å endre størrelse og form for å bli langstrakt (spindelform) med en markert reduksjon i cellepigmentering (figur 1D).

Denne protokollen er forskjellig fra andre verdifulle og pålitelige publiserte protokoller for primær mus RPE-isolasjon1 3,19,20 ved at den er forenklet med noen få trinn som er enkle å følge. RPE-celler kan identifiseres ved deres morfologi, pigmentering og spesifikke RPE-markører som RPE65 4,5,21. Validering av renhet og kontaminering av Müller-celler ble oppnådd ved å fargelegge isolerte celler med en spesifikk cellemarkør for Müller-celler (vimentin)22. Mange teknikker har blitt brukt til å evaluere integriteten til blod-retinal barrieren (BRB) in vitro, for eksempel elektronmikroskop (EM) undersøkelse, vurdering av tette kryssproteiner (TJPs), FITIC dextran lekkasjeanalyse og transepitelial elektrisk motstand (TER) måling som evaluerer den fysiologiske funksjonen til RPE som et monolag 8,23 . RPE-celler spiller en viktig rolle i å opprettholde den ytre BRB, og for å validere denne funksjonen evaluerte vi tette kryssproteiner (TJPs) som Zona ocludin-1 (ZO-1) og cytoskeletale proteiner som F-aktin som tidligere publisert8. TJPs evaluering er en mer praktisk metode for evaluering av BRB-integritet og barrierefunksjon som ikke krever dyrt utstyr som kanskje ikke er tilgjengelig i alle forskningslaboratorier, i motsetning til EM-evaluering eller TER.

Primær RPE-isolasjon er en teknikk som kan være et viktig verktøy for å studere underliggende mekanismer og patogenese, og for å foreslå nye terapeutiske anvendelser for ulike øyesykdommer. Den nåværende teknikken gjorde det mulig å studere endringene i RPE-cellestruktur og funksjon og deres innvirkning på den ytre BRB i aldersrelatert makuladegenerasjon8. Videre hjalp det med å studere endringene i RPE-celler isolert fra villtype C57BL6-mus og forskjellige genetisk modifiserte mus, samt teste de forskjellige farmakologiske forbindelsene som søker et terapeutisk mål for AMD14,16.

Avslutningsvis viste mange tilgjengelige publiserte protokoller primær mus RPE-isolasjon. Den presenterte protokollen er en forenklet prosedyre som følge av å endre noen eksisterende protokoller, ved hjelp av materiale, metoder og utstyr som er tilgjengelig i de fleste forskningslaboratorier for å isolere primære RPE-celler fra museøyne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi som er relevante for innholdet i denne artikkelen.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Eye Institute (NEI), National Eye Institute (NEI) fond R01 EY029751-04

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker : 100mL KIMAX 14000
Collagenase from Clostridium histolyticum  Sigma-Aldrich C7657-25MG For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile 13-711-20
DMEM/F12  gibco  11330 Media to grow RPE cells 
Fetal Bovine Serum (FBS) gibco 26140079 For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution gibco 15750-060 For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Scientific 88284 For working enzymes (A&B) 
Heracell VISO 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Hyaluronidase from bovine testes Sigma-Aldrich H3506-500MG For working enzyme A
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL B-D 309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL Grainger 11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody  Abcam, Cambridge, MA, USA ab78036 For IF staining 
Pen Strep gibco 15140-122 For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45 Dumont 72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm GARANA INDUSTRIES 2595
Sorvall St8 Centrifuge ThermoScientific 75007200
Stemi 305 Microscope Zeiss n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel Bard-Parker 371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style Corning 430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style Corning 353003
Tornado Tubes: 15mL Midsci C15B
Tornado Tubes: 50mL Midsci C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25% gibco 2186962 For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips Dumont 501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL Electron Microscopy Sciences Dumont 50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36" McKesson 4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge FST 15000-08
Zeiss AxioImager Z2 Zeiss n/a
Zeiss Zen Blue 2.6 Zeiss n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
  2. Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
  5. Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
  6. Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
  7. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  8. Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
  9. Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
  10. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
  11. Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
  12. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
  13. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  14. Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
  15. van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer's disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
  16. Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
  17. Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
  18. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
  19. Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020).
  21. Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
  22. Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
  23. Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
  24. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).

Tags

Biologi utgave 189

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24th reference was added:

  1. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
Isolering av primære retinale retinale pigmenterte epitelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P.,… More

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P., Cheng, M., Tawfik, A. Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. J. Vis. Exp. (189), e63543, doi:10.3791/63543 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter