Het protocol beschrijft een beeldvormingsgerichte bioreactor die de selectieve verwijdering van het endogene epitheel uit de rattenluchtpijp en homogene verdeling van exogene cellen op het lumenoppervlak mogelijk maakt, gevolgd door langdurige in vitro kweek van het celweefselconstruct.
Herhaaldelijk letsel aan luchtwegweefsel kan de longfunctie aantasten en chronische longziekte veroorzaken, zoals chronische obstructieve longziekte. Vooruitgang in regeneratieve geneeskunde en bioreactortechnologieën bieden mogelijkheden om in het laboratorium gekweekte functionele weefsel- en orgaanconstructies te produceren die kunnen worden gebruikt om geneesmiddelen te screenen, ziekten te modelleren en weefselvervangingen te manipuleren. Hier wordt een geminiaturiseerde bioreactor in combinatie met een beeldvormingsmodaliteit beschreven die in situ visualisatie van het binnenste lumen van geëxplanteerde rattenluchtpijp mogelijk maakt tijdens in vitro weefselmanipulatie en -kweek. Met behulp van deze bioreactor demonstreert het protocol beeldgeleide selectieve verwijdering van endogene cellulaire componenten met behoud van de intrinsieke biochemische kenmerken en ultrastructuur van de luchtwegweefselmatrix. Verder worden de levering, uniforme verdeling en daaropvolgende langdurige kweek van exogene cellen op het gedecellulariseerde luchtweglumen met optische monitoring in situ getoond. De resultaten benadrukken dat de beeldvormingsgeleide bioreactor mogelijk kan worden gebruikt om de generatie van functionele in vitro luchtwegweefsels te vergemakkelijken.
Het luminale oppervlak van de luchtwegen wordt bekleed door een laag epitheel dat voornamelijk bestaat uit multiciliated, club, goblet en basale stamcellen 1,2. De epitheellaag dient als een primair afweermechanisme van de long en fungeert als een biofysische barrière die het onderliggende luchtwegweefsel beschermt tegen ingeademde pathogenen, deeltjes of chemische gassen. Het beschermt het luchtwegweefsel via meerdere mechanismen, waaronder intercellulaire tight junction-vorming, mucociliaire klaring en antimicrobiële en antioxiderende secretie 3,4. Het defecte luchtwegepitheel wordt geassocieerd met verwoestende aandoeningen van de luchtwegen, zoals chronische obstructieve longziekte (COPD)5, primaire ciliaire dyskinesie (PCD)6 en cystische fibrose (CF)7.
Vooruitgang in lung-on-chip (LOC) -technologie biedt een kans om de ontwikkeling van menselijke longen te bestuderen, verschillende longziekten te modelleren en nieuwe therapeutische materialen te ontwikkelen in strak gereguleerde in vitro omgevingen. Luchtwegepitheel en endotheel kunnen bijvoorbeeld aan weerszijden van een dun, poreus membraan worden gekweekt om het gas na te bootsen dat longweefsel uitwisselt, waardoor getrouwe ziektemodellering en drugstestsmogelijk zijn 8. Evenzo zijn in vitro ziektemodellen gemaakt om luchtwegaandoeningen in vitro te modelleren, zoals COPD9 en cystic fibrosis10. Een grote uitdaging van LOC-apparaten is echter het samenvatten van de complexe driedimensionale (3D) architectuur van het longweefsel en dynamische cel-weefselmatrixinteracties in vitro11.
Onlangs zijn innovatieve tissue engineering-methodologieën ontwikkeld die manipulatie van ex vivo longweefselsmogelijk maken 12. Met behulp van deze methoden kunnen gedenudeerde allogene of xenogene weefseltransplantaten worden bereid door de endogene cellen uit het longweefsel te verwijderen via chemische, fysische en mechanische behandelingen13. Bovendien biedt de bewaarde inheemse weefsel extracellulaire matrix (ECM) in de gedecellulariseerde longsteigers de fysio-mimetische structurele, biochemische en biomechanische signalen voor geïmplanteerde cellen om zich te hechten, te prolifereren en te differentiëren14,15.
Hier wordt een beeldvormingsgestuurd bioreactorsysteem gerapporteerd dat is gemaakt door LOC- en tissue engineering-technologieën te combineren om in vitro weefselmanipulatie en kweek van geëxplanteerde tracheale weefsels van ratten mogelijk te maken. Met behulp van deze luchtwegweefselbioreactor toont het protocol selectieve verwijdering van de endogene epitheelcellen zonder de onderliggende subepitheliale cellulaire en biochemische componenten van het luchtwegweefsel te verstoren. Vervolgens tonen we de homogene verdeling en onmiddellijke afzetting van de nieuw gezaaide exogene cellen, zoals mesenchymale stamcellen (MSC’s), op het ontslankte luchtweglumen door de celbelaste collageen I pre-gel-oplossing in te brengen. Bovendien wordt door gebruik te maken van het micro-optische beeldvormingsapparaat dat in de bioreactor is geïntegreerd, ook de visualisatie van het luchtpijplumen tijdens epitheelverwijdering en endogene celafgifte gedaan. Verder wordt aangetoond dat de luchtpijp en nieuw geïmplanteerde cellen gedurende 4 dagen in de bioreactor kunnen worden gekweekt zonder merkbare celdood en weefselafbraak. We stellen ons voor dat het op beeldvorming gebaseerde bioreactorplatform, de op dunne film gebaseerde de-epithelisatietechniek en de celafgiftemethode die in deze studie wordt gebruikt, nuttig kunnen zijn voor het genereren van luchtwegweefsels voor in vitro ziektemodellering en screening van geneesmiddelen.
De bioreactor bevat een rechthoekige kamer die is aangesloten op een programmeerbare spuitpomp, perfusiepomp en ventilator voor het kweken van geïsoleerde rattenluchtpijp. De bioreactor beschikt over in- en uitgangen die zijn aangesloten op de luchtpijp of de weefselkweekkamer om reagentia (bijv. kweekmedia) afzonderlijk te leveren aan de interne en externe ruimtes van de luchtpijp (figuur 1). Een op maat gemaakt beeldvormingssysteem kan worden gebruikt om het inwendige van de in vitro gekweekte rattentrui op cellulair niveau te visualiseren (figuur 2). Het endogene epitheel van de luchtpijp wordt verwijderd via de instillatie van een op detergenten gebaseerde decellularisatieoplossing gevolgd door trillingsondersteund luchtwegwassen (figuur 3). Hydrogel-oplossing, zoals type I collageen, wordt gebruikt als een leveringsvoertuig voor het zaaien van exogene cellen uniform en onmiddellijk over het ontnuchterde luchtpijplumen (figuur 4). Alle materialen die zijn gebruikt om de bioreactor te bouwen en de experimenten uit te voeren, zijn opgenomen in de tabel met materialen.
In dit werk creëerden we een beeldvormingsgeleide bioreactor die (i) monitoring van het luchtpijplumen in situ mogelijk maakt na de celverwijdering en exogene celafgifte en (ii) langdurige in vitro kweek van het celgezaaide luchtpijpweefsel. Met behulp van deze op maat gemaakte bioreactor demonstreerden we (i) selectieve verwijdering van de endogene epitheelcellen uit het luchtpijplumen met behulp van detergent en trillingsondersteunde luchtwegwas en (ii) uniforme verdeling van exogene cellen op het lu…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek is gedeeltelijk ondersteund door het American Thoracic Society Foundation Research Program, de New Jersey Health Foundation en de National Science Foundation (CAREER Award 2143620) aan J.K.; en de National Institutes of Health (P41 EB027062) aan G.V.N.
1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
Cage cube | Thorlabs | C4W | |
Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 – D | |
Fusion 360 | Autodesk | ||
Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
XY Translator | Thorlabs | CXY1 |