Summary
Protokollet beskriver en bildaktiverad bioreaktor som möjliggör selektivt avlägsnande av det endogena epitelet från råtttraset och homogen fördelning av exogena celler på lumenytan, följt av långvarig in vitro-odling av cellvävnadskonstruktionen.
Abstract
Upprepad skada på luftvägsvävnad kan försämra lungfunktionen och orsaka kronisk lungsjukdom, såsom kronisk obstruktiv lungsjukdom. Framsteg inom regenerativ medicin och bioreaktorteknik erbjuder möjligheter att producera laboratorieodlade funktionella vävnads- och organkonstruktioner som kan användas för att screena droger, modellera sjukdomar och konstruera vävnadsersättningar. Här beskrivs en miniatyriserad bioreaktor i kombination med en avbildningsmodalitet som möjliggör in situ-visualisering av den inre lumen hos utplanterade råtttraströr under in vitro-vävnadsmanipulation och odling. Med hjälp av denna bioreaktor visar protokollet bildstyrd selektiv borttagning av endogena cellulära komponenter samtidigt som de inneboende biokemiska egenskaperna och ultrastrukturen i luftvägsvävnadsmatrisen bevaras. Vidare visas leverans, enhetlig fördelning och efterföljande långvarig odling av exogena celler på decellulariserad luftvägslumen med optisk övervakning in situ. Resultaten belyser att den bildstyrda bioreaktorn potentiellt kan användas för att underlätta generering av funktionella in vitro-luftvägsvävnader.
Introduction
Den luminala ytan i luftvägarna är fodrad av ett lager av epitel som huvudsakligen består av multicilierade, klubb-, bägare- och basalstamceller 1,2. Epitelskiktet fungerar som en primär försvarsmekanism i lungan, som fungerar som en biofysisk barriär som skyddar den underliggande luftvägsvävnaden mot inhalerade patogener, partiklar eller kemiska gaser. Det skyddar luftvägsvävnaden via flera mekanismer, inklusive intercellulär tät korsningsbildning, mukociliär clearance och antimikrobiell och antioxidantsekretion 3,4. Det defekta luftvägsepitelet är förknippat med förödande luftvägssjukdomar, såsom kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL)5, primär ciliär dyskinesi (PCD)6 och cystisk fibros (CF)7.
Framsteg inom lung-on-chip (LOC) -teknik utgör en möjlighet att studera mänsklig lungutveckling, modellera olika lungsjukdomar och utveckla nya terapeutiska material i tätt reglerade in vitro-miljöer . Till exempel kan luftvägsepitele och endotel odlas på motsatta sidor av ett tunt, poröst membran för att efterlikna gasutbytet av lungvävnad, vilket möjliggör trogen sjukdomsmodellering och drogtestning8. På samma sätt har in vitro-sjukdomsmodeller skapats för att modellera luftvägssjukdomar in vitro, såsom KOL9 och cystisk fibros10. En stor utmaning med LOC-enheter är dock att sammanfatta den komplexa tredimensionella (3D) arkitekturen i lungvävnaden och dynamiska cellvävnadsmatrisinteraktioner in vitro11.
Nyligen har innovativa vävnadstekniska metoder utvecklats som möjliggör manipulation av ex vivo lungvävnader12. Med hjälp av dessa metoder kan förnekade allogena eller xenogena vävnadstransplantat framställas genom att avlägsna de endogena cellerna från lungvävnaden via kemiska, fysiska och mekaniska behandlingar13. Dessutom ger den bevarade inhemska vävnadsextracellulära matrisen (ECM) i de decellulariserade lungställningarna de fysio-mimetiska strukturella, biokemiska och biomekaniska signalerna för implanterade celler att fästa, föröka sig och differentiera 14,15.
Här rapporteras ett bildstyrt bioreaktorsystem skapat genom att kombinera LOC- och vävnadsteknik för att möjliggöra in vitro-vävnadsmanipulation och odling av explanterade råtttrakealvävnader. Med hjälp av denna bioreaktor för luftvägsvävnad visar protokollet selektivt avlägsnande av de endogena epitelcellerna utan att störa de underliggande subepitelcellulära och biokemiska komponenterna i luftvägsvävnaden. Vi visar sedan den homogena fördelningen och momentan avsättning av de nyligen sådda exogena cellerna, såsom mesenkymala stamceller (MSC), på den denuderade luftvägslumen genom att införa den cellladdade kollagen I-förgellösningen. Dessutom, genom att använda den mikrooptiska bildanordningen integrerad i bioreaktorn, görs visualiseringen av luftstrupen lumen under epitelavlägsnande och endogen cellleverans också. Vidare visas att luftstrupen och nyplanterade celler kan odlas i bioreaktorn utan märkbar celldöd och vävnadsnedbrytning i 4 dagar. Vi föreställer oss att den bildaktiverade bioreaktorplattformen, den tunnfilmsbaserade de-epitelialiseringstekniken och cellleveransmetoden som används i denna studie kan vara användbara för att generera luftvägsvävnader för in vitro-sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening.
Bioreaktorn innehåller en rektangulär kammare ansluten till en programmerbar sprutpump, perfusionspump och ventilator för odling av isolerade råttluftstrupar. Bioreaktorn har inlopp och utlopp anslutna till luftstrupen eller vävnadsodlingskammaren för att separat leverera reagenser (t.ex. odlingsmedier) till luftstrupens inre och yttre utrymmen (figur 1). Ett specialbyggt bildsystem kan användas för att visualisera det inre av den in vitro-odlade råtttrasen på cellulär nivå (figur 2). Det endogena epitelet i luftstrupen avlägsnas via instillation av en tvättmedelsbaserad decellulariseringslösning följt av vibrationsassisterad luftvägstvätt (figur 3). Hydrogellösning, såsom kollagen av typ I, används som ett leveransfordon för sådd av exogena celler jämnt och omedelbart över denuderade luftstrupen lumen (Figur 4). Alla material som används för att konstruera bioreaktorn och genomföra experimenten finns i materialförteckningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurvävnadsprotokollet nedan har godkänts av riktlinjerna för djurskydd och föreskrifter från Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Stevens Institute of Technology, och det överensstämmer med National Institutes of Health (NIH) riktlinjer för användning av försöksdjur.
1. Design och konstruktion av bildstyrd råtttrakebioreaktor
- Design och tillverkning av bioreaktorer för råtttrakea
- Skapa en CAD-modell (Computer Aided Design) av bioreaktorkammaren med relevant design, såsom inlopp, utlopp och vävnadsodlingskammare, med hjälp av CAD-generatorprogramvara. För denna studie, använd geometrin och dimensionerna som presenteras i figur 1A-C. Handledningen för CAD-generatorprogramvara finns i16,17.
- Exportera den genererade CAD-modellen till en dator numerisk styrning (CNC) styrenhetsprogramvara och skär polytetrafluoretylen (PTFE) plast med en CNC-maskin för att skapa bioreaktorkammaren. Handledningen för CNC-styrenhetsprogramvaran finns i18.
OBS: Förutom PTFE kan andra plastmaterial, såsom polyeten med ultrahög molekylvikt (UHMWPE) och polyeterimid användas för att tillverka odlingskammaren. - Sterilisera alla bioreaktorkomponenter, såsom Luer-adaptrar och skruvar, för att undvika kontaminering av vävnader och celler som odlas i enheten. Montera alla bioreaktorkomponenter till huvudvävnadsodlingskammaren i en ren miljö (figur 1A).
- Konstruktion av linsbaserad bildbehandlingsenhet (GRADIENT INDEX)
- För att skapa in situ-bildenheten , sätt in en rörlins i ett stapelbart linsrör och säkra det med en hållarring. Montera linsrörsenheten på en vetenskaplig CMOS-kamera via en C-mount-adapter.
- Använd programvara, till exempel Micro-Manager, för att använda kameran och skaffa foton och videor. Rikta ett objekt som ligger på långt avstånd (t.ex. 10 m från kameran) och justera avståndet mellan rörlinsen och bildsensorn på kameran tills en fokuserad bild av objektet bildas på datorskärmen av bildprogramvaran som används.
- Montera en filterlins på en dubbelkantig superupplöst dikrospegel och en laser på enheten med hjälp av optiska bursystemkomponenter, inklusive monteringsstång, gängad burplatta och burkub.
- Anslut objektivlinsen (20x) till enheten. Montera en GRIN-lins (diameter = 500 μm) i linsrörets distala ände via XY-översättaren. Justera avståndet mellan GRIN-objektivet och objektivlinsen för att bilda fokuserade mikroskopiska bilder (figur 2A,B).
2. Isolering av råtttraset
- Sanera det kirurgiska området och sterilisera de kirurgiska instrumenten med hjälp av en autoklav vid 121 ° C i 30 minuter före operationen.
- Placera en råtta i induktionskammaren och leverera 2,5% isofluran i 15 minuter med en liten förångare för att bedöva djuret. Bedöm anestesidjupet med pedalreflex. För att göra detta, kläm fast tå och bekräfta att djuret inte svarar på tåklämman.
- Efter anestesi, ta bort isofluranet från kammaren och administrera 1 ml av 1000 enhet / ml heparin genom den laterala svansvenen för att förhindra blodkoagulering i lungkärlen.
- För att avliva djuret, utsätt djuret för 5% isofluran i ytterligare 15-20 minuter. Ta bort djuret från induktionskammaren och placera det på operationskortet i ett uppåtvänt ryggläge.
- Fixa råttan på operationskortet genom att immobilisera benen och svansen med tejp. Därefter sterilisera råttans nacke och bröstregioner med 70% isopropylalkohol (IPA). Öppna bukhålan genom att göra ett snitt på 3-4 cm med sax i huden.
OBS: Var försiktig så att du inte skär huden djupt genom att peka saxens spetsar uppåt. - Transektera den underlägsna vena cava (IVC) med saxen och bekräfta eutanasi genom exsanguination.
- Utför trakeotomi genom att göra ett snitt med sax i mitten av nacken och exponera luftstrupen. Utför thorakotomi i mittlinjen genom att göra ett snitt i bröstväggen och skära mellan revbenen för att nå luftstrupens ände ansluten till lungan. Använd sedan en bicep och sax för att klippa båda ändarna av luftstrupen och isolera luftstrupen.
- Skölj luftstrupen efter isolering med 20 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS). Överför luftstrupen till bioreaktorn med steriliserade biceps. Fäst de två ändarna av luftstrupen på Luer-kontakten med en 4-0 suturgänga.
- Leverera 5 ml odlingsmedium till bioreaktorkammaren med hjälp av den programmerbara sprutpumpen genom slangen ansluten till bioreaktorkammaren med en flödeshastighet på 5 ml / min.
OBS: Odlingsmediet består av Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM), rekombinant humant FGF-basic (0,1 ng / ml), fetalt bovint serum (FBS, 10%) och antibiotika-antimykotiskt (1%). - Stäng bioreaktorlocket ordentligt med akrylplastlocket och skruvarna. Stäng bioreaktorkammarens slanganslutningar med de manliga / kvinnliga Luer-pluggarna för att förhindra flödet av odlingsmediet i slangen.
3. Bildstyrd borttagning av luftstrupens epitel
- För att visualisera luftstrupen lumen antingen i ljusfält eller fluorescerande, placera bioreaktorn på bildstadiet (Figur 3A).
- Förbered karboxifluoresceinsuccinimidylesterlösning (CFSE) (koncentration: 100 μM) i CFSE-cellmärkningssatsen genom att späda CFSE-lösningen med 1x PBS.
OBS: Koncentrationen av den ursprungliga CFSE-lösningen är 10 mM (i dimetylsulfoxid (DMSO)). - Infusera 500 μL av CFSE-lösningen genom luftstrupen via sprutpumpen genom slangen ansluten till luftstrupens kanyl med en flödeshastighet på 5 ml/min. Stoppa pumpen när CFSE-lösningen fyller luftstrupen. Vänta i 10 minuter och tvätta sedan luftstrupens lumen genom infusion av 10 ml 1x PBS med sprutpumpen för att avlägsna det återstående icke-införlivade CFSE-reagenset.
- Sätt in den distala avbildningsänden av GRIN-linsen i luftstrupen via Luer-kontakten som är fäst vid ena änden av luftstrupen. Flytta sedan försiktigt GRIN-linsen inuti luftstrupen tills luftstrupens yta är fokuserad och ta foton och videor i ljusfält eller fluorescens vid 20x förstoring.
- Följ stegen nedan för att ta ljusfältsbilder i Micro-Manager-programvaran.
- Introducera vitt ljus genom burkuben för att belysa luftstrupens lumen. Klicka på Live-ikonen för att visa luftrörets lysande yta i realtid. Använd Imaging Setting > Exposure (ms) för att ändra exponeringstiden till önskat värde. I denna studie var exponeringstiden som användes i intervallet 10 ms och 50 ms.
- Om du vill justera kontrasten och ljusstyrkan för bilder använder du fönstret Histogram- och intensitetsskalning för att flytta svartvita pilar vid slutpunkten för den interaktiva histogramvisningen. Alternativt kan du använda alternativet Auto Stretch som gör att programvaran kan justera ljusstyrkan och kontrasten automatiskt till optimala nivåer.
- Klicka på Snap-ikonen för att frysa bilden. Använd sedan Inställning > Exportera bilder som förskjutna för att spara bilderna i önskat format. Du kan också använda Setting > ImageJ för att direkt exportera bilden till ImageJ-programvaran och spara den.
- För att få foton och videor i fluorescerande läge, belysa luftstrupens lumen med CFSE-specifikt laserljus (CFSE: excitationsvåglängd: 488 nm, emissionsvåglängd: 515 nm) genom burkuben. Följ stegen 3.5.2-3.5.3 för att hämta bilderna. När du har tagit foton och videor, ta försiktigt bort GRIN-linsen från luftstrupen.
- Utför de-epitelialisering enligt beskrivningen nedan.
- Förbered 2% natriumdodecylsulfat (SDS) decellulariseringslösning i destillerat (DI) vatten. För in 50 μL SDS genom luftstrupen med en flödeshastighet på 6,3 ml/min genom att använda sprutpumpen genom luftstrupskanylen för att generera en tunn film av tvättmedelslösningen på luftstrupens lumen.
- Stäng bioreaktorns slanganslutningar med hjälp av manliga / kvinnliga Luer-pluggar och överför bioreaktorn till en inkubator. Låt SDS bo i luftstrupen i 10 minuter vid 37 ° C. Sätt in ytterligare 50 μL SDS-lösning genom luftstrupen och inkubera i 10 minuter.
- Ta bort lyserat epitel och SDS genom att bevattna luftstrupens lumen med 500 μL 1x PBS via sprutpump med en flödeshastighet på 10 ml / min i 3x. Placera bioreaktorn på en shaker och vibrera bioreaktorn mekaniskt vid 20 Hz frekvens och förskjutningsamplitud på cirka 0,3 mm för att fysiskt främja avlägsnande av SDS-behandlade epitelceller från luftstrupens lumen.
OBS: I denna studie specialbyggdes skakaren genom att montera en subwooferhögtalare, en subwooferplattförstärkare och en accelerometer. En sinusformad vågform genererades av en dator och matades in i skakaren via förstärkaren, medan skakarens svar övervakades via accelerometern (figur 3B). Dessutom kan konventionella shakers, såsom elektromagnetiska och tröghetsskakare, användas för att främja avlägsnandet av cellerna. För att göra detta, ställ in frekvensen och accelerationen av skakapparaten till 20 Hz respektive 0,5 g (motsvarande 0,3 mm förskjutningsamplitud). - Sätt in 500 μL 1x PBS två gånger genom luftstrupens lumen för att avlägsna kvarvarande SDS och cellspräp medan luftstrupen vibreras mekaniskt. Efter proceduren för borttagning av epitel, utvärdera clearance av epitelskiktet genom att mäta intensiteten av CFSE med hjälp av GRIN-linsavbildningsanordningen som i steg 3.6 (Figur 3C).
4. Beredning av luftstrupsvävnad för vidare analyser
- För att bekräfta epitelavlägsnandet, utför ytterligare vävnadsanalyser, såsom hematoxylin och eosin (H & E) färgning, trikrom, pentakrom och immunfärgning. För att göra detta, ta bort luftstrupen från bioreaktorn och fixera den i 30 ml 4% neutral buffrad paraformaldehydlösning i 1x PBS (pH = 7,4) vid 4 ° C över natten.
- Dehydrera och bädda in den fasta luftstrupsvävnaden genom att följa stegen nedan.
- Tvätta luftstrupsvävnaden med 10 ml 1x PBS efter fixering, överför luftstrupen till 30 ml 70% alkohol och håll den vid 4 ° C över natten. Skär luftstrupen i små cylindriska sektioner (~ 5 mm) med ett vasst blad och sätt in vävnadssektionerna i vävnadsinbäddningskassetterna (längd x bredd x höjd: 4 cm x 2,5 cm x 0,5 cm). Förvara två luftstrupssektioner i varje kassett.
- Dehydrera sektionerna i en serie isopropylalkohollösningar (IPA) - 85%, 90%, 95%, 100% - i 1 timme i 30 ml av varje lösning. Ta bort den tidigare lösningen innan du lägger till nästa lösning.
- När du är klar sänker du ner kassetterna i 30 ml clearingmedel (t.ex. xylen) i 2 timmar för att helt förskjuta IPA-lösningen från vävnadssektionerna. Utför detta steg i en draghuv med korrekt ventilation.
- Sänk ner kassetterna i paraffin i 2 timmar och bädda sedan in dem i paraffin vid 4 °C över natten. Skär sedan de paraffininbäddade vävnaderna i tunna sektioner (5-8 μm) med hjälp av en mikrotomanordning för H & E, trikrom, pentakrom och immunfärgning.
- För att förbereda vävnaderna för skanningselektronmikroskopi (SEM) -analys, fixera luftstrupen i 30 ml 2,5% glutaraldehydlösning i 1x PBS (pH = 7,4) vid 4 ° C över natten. Torka sedan ut den fasta luftstrupsvävnaden för SEM genom att följa stegen nedan.
- Skölj luftstrupen med 10 ml 1x PBS efter fixering. Skär luftstrupsvävnaden i längdriktningen i små halvcylindriga sektioner (längd: ~ 5 mm) med sax och sätt in vävnadssektionerna i kassetterna.
- Dehydrera sektionerna i en serie IPA-lösningar - 35%, 50%, 70%, 85%, 95% och 100% - i 10 min i 30 ml av varje lösning. Ta bort den tidigare lösningen innan du lägger till nästa lösning.
- Utför hexametyldisilazan (HMDS)-baserad torkningsmetod genom att sänka ner vävnaderna i följande lösningar: 100% IPA: HMDS (2:1; v/v) i 10 min, följt av 100% IPA: HMDS (1:2; v/v) i 10 min och slutligen 100% HMDS för över natten.
OBS: HMDS är giftigt. Arbeta under en draghuva under alla torkningssteg. - Ta bort vävnaderna från HMDS-lösningen och låt dem torka under draghuven i 1 timme. Montera sektionen på aluminiumstiftstubbar med en kolsidig ledande tejp eller silverledande pasta för SEM-avbildning.
5. Homogen fördelning av exogena celler på denuded trakeal lumen
- Förbered en de-epitelialiserad råtttrakea med hjälp av protokollet i steg 3. Tina frysta mesenkymala stamceller (MSC) i 30 s i ett 37 ° C vattenbad.
OBS: I denna studie använde vi mesenkymala stamceller (MSC) som en modellcell för att visa fördelningen av exogena celler på den de-epitelialiserade luftstrupen. Helst kan primära luftvägsepitelceller, basalceller eller inducerade humana pluripotenta celler (iPSC) användas för epitelregenereringsändamål. - Räkna cellerna med en hemocytometer och bereda en celllösning med en koncentration av 5 x 106 celler/ml. Märk cellerna fluorescerande genom att inkubera cellerna med 2 ml CFSE-lösning (koncentration: 100 μM) vid rumstemperatur i 15 min. Skölj cellerna med 5 ml 1x PBS i 3x och resuspendera cellerna i färskt odlingsmedium i en slutlig koncentration av 3 x 107 celler / ml.
- Förbered hydrogel pre-gel lösning som ett fordon för cellleverans. För denna studie, använd kollagen I som ett leveransfordon för MSC-celler och följ tillverkarens instruktioner för att förbereda förgelen. Till exempel, för att erhålla 3,6 mg / ml kollagenförgel, blanda en del av den kylda neutraliseringslösningen med nio delar av råttsvanskollagenet i ett 1,5 ml sterilt rör. Pipet sedan försiktigt blandningen upp och ner för adekvat blandning.
OBS: Andra biokompatibla hydrogeler kan användas istället för kollagen I enligt studien och användarnas behov. - När hydrogellösningen har framställts, tillsätt cellerna snabbt till lösningen med önskad koncentration (t.ex. 5 x 106 celler / ml). För att erhålla en enhetlig cell-hydrogelblandning, blanda cellerna och gellösningen genom att försiktigt pipettera med en mikropipett.
- Fäst ena änden av luftstrupen i bioreaktorn till en programmerbar sprutpump genom en Luer-kontakt. Leverera 5 ml färskt odlingsmedium vid 37 °C till bioreaktorkammaren för att täcka luftrörets yttre yta med sprutpumpen med en flödeshastighet på 5 ml/min.
- Administrera en 10 μL bolus av cell-hydrogelblandningen i den avepitelialiserade luftstrupen i bioreaktorn med sprutpumpen med en flödeshastighet av 5 ml / min för att generera ett cellhydrogelskikt på luftstrupens lumen (Figur 4).
- Efter cellinjektion, placera bioreaktorn i en steril cellodlingsinkubator vid 37 ° C och 5% CO2 för gelering. För kollagen I sker geleringen på 30 min.
- För att visualisera fördelningen av implanterade celler, sterilisera GRIN-linsen genom att torka med 70% IPA eller etanol och placera bioreaktorn på bildstadiet. Ta foton och videor i både ljusfälts- och lysrörslägen efter behov.
- Efter 30 minuters cellsädning, infusera 1 ml odlingsmedium i luftstrupens lumen med hjälp av en sprutpump med en flödeshastighet på 1 ml / min.
- Odla den cellfröade luftstrupen i bioreaktorn i en inkubator vid 37 °C under önskad tid. För långsiktig kultur, uppdatera odlingsmediet i luftstrupen lumen och bioreaktorkammaren var 24: e timme. Under cellodlingen, håll mediet inuti lumen statiskt och byt det var 24: e timme, medan mediet utanför luftstrupen kontinuerligt perfusioneras via ett enkelriktat flöde vid 5 ml / min.
- Efter odling av cellerna under en viss tidsperiod (t.ex. 1 och 4 dagar i denna studie), ta bort luftstrupen från bioreaktorn. Använd sax för att skära luftstrupen i längdriktningen i två halvcylindriga sektioner (dvs. övre och nedre sektioner) på dag 1 och 4 av in vitro-odling för att exponera de inre ytorna för övervakning av celltillväxt och beräkning av celldensitet. Använd ett konventionellt fluorescerande mikroskop för att visualisera cellerna på de inre ytorna.
- Följ steg 3.5 och 3.6 för att hämta bilderna med Micro-Manager-programvaran. Använd ett fluoresceinisotiocyanatfilter (FITC) för att visualisera de CFSE-märkta cellerna i fluorescensläge. Analysera bilderna som tagits av det fluorescerande mikroskopet och beräkna celldensiteter på övre och nedre sektioner med hjälp av ImageJ-programvaran. Följ stegen nedan för att beräkna antalet celler och celldensiteten.
- Öppna en bild i ImageJ-programvaran och konvertera bilden till en binär bild (16-bitars) med Image > Type > 16-bitars. Ange bildskalan med skalningsfältet med Analysera > ange skala.
- Justera bildens tröskel för att markera strukturerna i cellerna som ska räknas. Använd Image > Justera > Threshold. Använd Analysera > Analysera partiklar för att räkna antalet celler. Beräkna cellernas densitet genom att dividera antalet celler med bildens yta.
- För att bedöma livskraften efter cellsådd, använd ett cellviabilitetssats. För denna studie, inkubera luftstrupsvävnaden och cellerna i bioreaktorn vid 37 ° C i 6 timmar och fläcka cellerna med 4 mM kalcein-AM och 2 mM etidiumhomodimer-1 i 1 ml 1x PBS vid rumstemperatur i 15 min.
- Efter sköljning med 1x PBS, visualisera cellerna med ett fluorescerande mikroskop. Räkna levande och döda celler med hjälp av stegen som beskrivs i steg 5.12. Beräkna cellviabilitet som procentandelen levande celler (färgade med kalcein-AM) per totala celler (både levande och döda celler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den GRIN-linsbaserade in situ-avbildningsmodaliteten kan möjliggöra visualisering av trakealens inre lumen in situ (figur 5A). Med hjälp av denna avbildningsmetod kan både ljusfälts- och fluorescerande bilder av de inhemska och de-epitelialiserade luftstruparna erhållas (figur 5B,C). Ingen fluorescerande signal observerades från den ursprungliga luftstrupen före CFSE-märkning (figur 5Bii). Men när trakearepitelet märktes med CFSE-färgämne observerades en enhetlig fluorescerande signal (grön) i hela epitelet (figur 5Ci). Efter de-epitelialisering via SDS och vibrationsassisterad luftvägsbevattning minskade intensiteten hos den fluorescerande signalen signifikant (figur 5Cii), vilket indikerar ablation av epitelet.
H&E-bilderna av de-epitelialiserad luftstrupe visade avlägsnandet av det pseudostratifierade epitelet från luftstrupens lumen och bevarandet av cellerna och ECM-mikrostrukturen i underliggande vävnadsskikt (Figur 6A). Dessutom bekräftade pentakrom (figur 6B) och trikromfärgning (figur 6C) upprätthållandet av luftstrupens vävnadsarkitektur och ECM-komponenterna, såsom kollagen och proteoglykaner. Vidare immunofluorescens av epitelceller (epitelcellsvidhäftningsmolekyl, EpCAM; Figur 6D) och kollagen I (figur 6E) avslöjade fullständigt avlägsnande av epitelet och bevarande av kollagen I i subepitelvävnaden. SEM-avbildning av inhemska luftstrupar visade att den luminala ytan av inhemska råtttrastblad huvudsakligen befolkades med multicilierade celler och bägareceller. Å andra sidan visade SEM-bilder av de-epitelialiserad luftstrupslumen att basalmembranet exponerades vilket indikeras av ett nätnätverk av ECM-fibrer och frånvaron av epitelceller (Figur 6F).
Med hjälp av de-epitelialiserade råtttrakeor och fluorescerande märkta celler undersökte vi om införlivande av en hydrogel som ett cellleveransfordon kunde uppnå homogen cellfördelning på den de-epitelialiserade trakeallumen (Figur 7A, B). I denna studie användes de mesenkymala stamcellerna (MSC) som modellceller för cellleverans- och odlingsstudien. Som beskrivs i protokollet (steg 5) införde vi MSC-laddat kollagen I-förgel i en de-epitelialiserad råtttrake och övervakade fördelningen av cellerna på trakeallumen med hjälp av GRIN-linsavbildningssystemet. Som ett kontrollexperiment suspenderade vi MSC i odlingsmediet, infunderade det cellbelastade odlingsmediet i luftstrupen och inspekterade visuellt fördelningen av cellerna. In situ-avbildningsresultat visade att de fluorescerande märkta cellerna som levererades via hydrogel förblev vidhäftade mer enhetligt över lumen än de som såddes via odlingsmedium (Figur 7B). Vi testade sedan cellens livskraft före och efter cellleverans för att utvärdera potentiell cellskada och död på grund av skjuvningsstress under cellinfusion. Resultatet visade att cellens livskraft inte påverkades signifikant av cellleveransproceduren eftersom över 90% av cellerna förblev livskraftiga (figur 7C).
Dessutom odlade vi de cellfröade luftstruparna i 4 dagar. Cellerna sådda via både kollagen och odlingsmedium (kontroll) prolifererade på den avepitelialiserade luftstrupen lumenytan vilket indikeras av det ökade antalet celler som uttrycker CFSE över tiden i både den övre och nedre halvan av trakeallumen (Figur 7D). I synnerhet i kollagenhydrogelleveransgruppen var skillnaden i cellernas densitet mellan övre och nedre lumen mindre än den i kontrollgruppen, vilket indikerar att cellleverans via hydrogel främjar homogen cellfördelning genom luftstrupen lumen.
Figur 1: Tredimensionell (3D) datorritning av luftstrupens bioreaktor. (A) (i) sidovy, (ii) toppvy. (B) Bioreaktorkammarens dimensioner. (C) Ett genomskinligt akrylplastark skärs och fästs på toppen av huvudkammaren med skruvar. Enhet = mm; R = radie. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Specialbyggd mikrofiberavbildning för in situ-visualisering av råtttrasan. (A) (i) Schematisk över ljusbanans bildinställningskomponenter. Förkortningar: C = kamera, TL = rörlins, F = filter, DM = dikroisk spegel, OL = objektivlins; ii) Fotografi av de komponenter för avbildningsinställning som visar avbildningssonden (GRIN-linsen) sätts in i Bioreaktorns Luer-kontakt. (B) Schematiskt som visar att GRIN-linsen är integrerad med bioreaktorn. (C) Ett fotografi som visar avbildningssonden används för att visualisera luftstrupen inuti bioreaktorn. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Plattformen för de-epitelialisering av råtta luftstrupen. (A) Fotografi som visar den experimentella inställningen för de-epitelialisering och in situ optisk fiberavbildning. (B) Diagram som visar komponenten och sammansättningen av den specialbyggda elektromagnetiska skakaren som används för att underlätta epitelavlägsnandet. ω: frekvens, a: amplitud (C) Schematisk som visar arbetsflödet för råtta trakea de-epitelialiseringsprocedur. PBS = fosfatbuffrad saltlösning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Leverans av exogena celler till de-epitelialiserad råtttrakea med användning av hydrogel. Schematisk visar hydrogellösning som används som ett leveransfordon för att lokalt deponera cellerna på den inre lumen i den de-epiteliserade råtttrasen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: In situ-avbildning av de-epitelialiserad luftstrupe. (A) Fotografi som visar fluorescerande avbildning av luftstrupens lumen medan det CFSE-märkta epitelet exciteras med 488 nm blå laser genom GRIN-linsen. (B) (i) Ljusfälts- och (ii) fluorescensbilder av luftstrupens lumen före epitelmärkning. (C) Fluorescensbilder av (i) infödda och (ii) de-epitelialiserade luftstrupar (De-Epi luftstrupen) medan epitelet är märkt med CFSE fluorescerande färgämne. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Histologi, immunofluorescens och SEM-analyser av inhemska och de-epitelialiserade råttstrupar. (A) H&E-färgning. (B) Pentakromfärgning där lila är cellcytoplasma, blått är cellkärnor, grönt är proteoglykaner (t.ex. mucin) och gult är kollagenfibrer. (C) Trikromfärgning där rosa är cellcytoplasma, mörkblå är cellkärnor och blått är kollagen. Fluorescensbilder av inhemska och de-epitelialiserade luftstrupar. (D) EpCAM och (E) kollagen I. Pilspetsar visar ytan på luftstrupens lumen. F) SEM-mikrografer av luftstrupens lumen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Topisk deponering av de exogena MSC: erna i luftstrupens lumen. (A) (i) Ljust fält och (ii) fluorescensbilder av den avepiteliserade luftstrupen. (B) Fluorescerande bilder av den de-epitelialiserade luftstrupen lumen när den är sådd med (i) PBS och (ii) kollagen I pre-gel. Den homogena fördelningen av cellerna på luftstrupen lumen uppnås när pre-gel kollagen används som ett leveransmedel för celler. (C) (i) Fluorescerande bilder och (ii) kvantifierad viabilitet hos cellerna före och efter 6 timmars leverans med pre-gel kollagen. n: antal prover. Steg 5.1 och 5.17 i protokollet följdes för att bedöma cellernas livskraft. D) Cellsåddensitet uppmätt efter i) 1 dag och ii) 4 dagar efter sådd och odling av celler. Celldensiteten beräknades genom att dividera cellnummer med den undersökta ytan. Alla värden representerar medelvärdet ± standardavvikelsen. Envägsanalys av varians (ANOVA) användes för att bestämma statistiskt signifikanta skillnader mellan grupper, med p < 0,05 som ansågs signifikanta. Förkortningar: CM = odlingsmedium, C = kollagen. *p < 0,05. **p < 0,01. ns: inte signifikant. Ingen signifikant skillnad (ns) mellan övre och nedre ytor innebär enhetlig cellfördelning över luftstrupens omkrets. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete skapade vi en bildstyrd bioreaktor som kan möjliggöra (i) övervakning av luftstrupen lumen in situ efter cellavlägsnande och exogen cellleverans och (ii) långsiktig in vitro-odling av den cellfröade luftstrupsvävnaden. Med hjälp av denna specialbyggda bioreaktor demonstrerade vi (i) selektivt avlägsnande av de endogena epitelcellerna från luftstrupens lumen med hjälp av tvättmedel och vibrationsassisterad luftvägstvätt och (ii) enhetlig fördelning av exogena celler på den luminala ytan av den denuderade luftstrupen med hjälp av cellbelastat kollagen I-förgel. Dessutom bekräftade den GRIN-linsbaserade bildmodaliteten avlägsnandet av epitelet in situ. Vidare bekräftade vi med ytterligare analyser, inklusive H&E, trikrom, pentakrom, immunofluorescensfärgning och SEM, avlägsnandet av epitelet och underhållet av arkitekturen och komponenterna i underliggande vävnadsskikt. Dessutom visade grin-linsbaserad avbildning av nyligen implanterade exogena MSC den enhetliga fördelningen av cellerna när kollagen I-förgel användes som leveransfordon. Slutligen överlevde och förökade sig de implanterade cellerna på de-epitelialiserade luftstrupen, vilket belyser bioreaktorns effektivitet i den långsiktiga odlingen av de cellfröade luftvägsvävnaderna.
Det kritiska steget i de-epitelialiseringsprotokollet är att skapa ett tunt tvättmedelslösningsskikt i luftstrupens lumen. I nuvarande decellulariseringsprotokoll används flera cykler av kemikalier och enzymer under en lång period, vilket minskar antalet kollagenfibrer, glykosaminoglykaner (GAGs), proteoglykaner och kondrocyter, vilket äventyrar de biologiska och biomekaniska egenskaperna hos luftvägsställningen 19,20,21. Å andra sidan tillhandahåller ECM biokemiska och mekaniska signaler och lämpliga fysiska miljöer för överlevnad, spridning och differentiering av implanterade exogena celler22,23. Tunnfilmsdeponeringsmetoden som beskrivs i denna studie använder en liten mängd tvättmedel (mindre än 50 μL) för epitelablation samtidigt som det möjliggör bevarande av det underliggande vävnadsskiktet och subepitelcellulära komponenter. Mekanisk vibration av den tvättmedelsexponerade vävnaden som demonstreras i denna studie är ett viktigt förfarande eftersom det möjliggör lossning och clearance av de lyserade cellerna. Cellskräpet och delvis störda celler till följd av exponering av epitelet för tvättmedlet är utmanande att tvättas endast genom att översvämma luftstrupen med tvättlösningen. Därför ger mekanisk vibrering av luftstrupen under tvätt tillräckliga skjuvkrafter för att rensa cellskrotet från trakeallumen.
I allmänhet kan den pre-gelbaserade cellsädningsmetoden påverkas av leveranshastigheten, viskositeten hos förgelen (som är direkt relaterad till pre-gelkoncentrationen), ytspänning och geleringstid. I synnerhet under pre-gelberedning är det viktigt att bibehålla förgelkoncentrationen tillräckligt låg för att transportera den cellsususpenserade förgelen i slangen och tillräckligt hög för att bibehålla cellerna på luftrörets övre yta. Därför rekommenderas det starkt att hitta den optimala koncentrationen för varje förgel genom att testa olika koncentrationer. Dessutom öva leveranstekniken som leveranshastigheten med mindre värdefulla celler för att säkerställa en framgångsrik leverans av den cellbelastade förgelen. Även om vi använde MSC som en cellmodell för att visa (i) fördelningen av cellerna med pre-gel som ett leveransfordon och (ii) bioreaktorsystemets förmåga att odla de nysådda cellerna på denuded trachea lumen, kan användningen av stamceller (t.ex. basalceller) och primära luftvägsepitelceller i framtida studier göra det möjligt att studera celldifferentiering och funktionell epitelcellsregenerering24, 25. Dessutom kan framtida studier innefatta att lägga till ett luft-vätskegränssnitt (ALI) till den nuvarande plattformen för att generera in vivo-liknande skjuvspänning på sådda celler för generering av funktionellt epitel. För att lägga till ALI till den aktuella enheten kan en liten djurventilator anslutas till luftrörets inlopp för att ventilera luftstrupen. För att uppnå ALI kan dessutom tunnfilmsavsättningsmetoden användas för att införa en odlingsmedium flytande plugg i den cellfröade luftstrupen. Tjockleken på den flytande filmen kan moduleras genom att ändra vätskepluggens hastighet26,27. Pluggen kan initieras efter att de nysåda cellerna fäster och engraft fast på luftstrupens lumen.
Dessutom är in situ GRIN-linsbaserad avbildningsmetod som används i detta protokoll avgörande för att bekräfta effekten av de-epitelialiseringen och bedöma kvaliteten på distributionen av nysådda celler. Till skillnad från konventionella vävnadsanalysmetoder, såsom histologi och immunofluorescens, som kräver dissekering av proverna från luftstrupsvävnaden för analys, möjliggör bildplattformen som utvecklats i vår studie snabb och icke-destruktiv övervakning av luftvägslumen under de-epitelialisering och cellleverans. För att hålla luftstrupen steriliserad under in situ-avbildning , se till att sterilisera GRIN-linsen genom att torka av den med 70% IPA eller etanol innan du introducerar den i luftstrupens lumen. Dessutom, för att avbilda cellerna med grin-linsen, kan cellerna (antingen endogena trakeala epitelceller eller nyimplanterade celler) märkas med olika fluorescerande färgämnen med olika excitations- / emissionsvåglängder. För att göra detta, se till att använda lämplig laserljusgenerator för att excitera de fluorescerande märkta cellerna och integrera rätt filterlinser i den dubbelkantiga superupplösta dikrospegeln.
Trots nyheten och innovativiteten hos de-epitelialisering, cellleverans och in situ-avbildningsmetoder har denna studie flera begränsningar. De de-epitelialiserings- och cellleveransmetoder som beskrivs i denna studie är tillämpliga på små luftvägar (diameter: mindre än 3-4 mm) där ytspänningen är dominerande. Att bilda en flytande plugg och skapa en tunn film av de-epitelialiseringslösningen eller cellbelastad förgelsuspension i större luftvägar, såsom svin och mänsklig luftstrupe eller bronkier, kan vara utmanande eftersom ytspänningen blir försumbar jämfört med andra krafter, tyngdkraften i synnerhet. Dessutom, genom att använda tunnfilmsavsättningsmetoden och modulera tid och koncentration, kunde vi ablatera epitelet med ett starkt tvättmedel (SDS) och bevara det underliggande vävnadsskiktet. I framtida studier kan dock mildare decellulariseringsmedel, såsom 3-[(3-kolamidpropyl)-dimetylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS)28, eller icke-tvättmedelslösning, såsom natriumhydroxid (NaOH)29, testas för bevarande av ECM-komponenter och stöd av nyligen implanterade celler. Vidare minskar fluorescensintensiteten hos CFSE-märkta celler över tiden på grund av cellernas delning. I vår studie visade de fluorescerande bilderna av MSC odlade på de deepitelialiserade luftstruparna i 4 dagar en betydande minskning av deras fluorescensintensitet. För långvarig övervakning och spårning av exogena celler sådda på vävnadsställningarna skulle olika cellmärkningsmetoder som kan möjliggöra långvarig eller permanent fluorescerande märkning av cellerna vara nödvändiga.
Vi ser framför oss att den bildstyrda bioreaktorplattformen och cellborttagnings- och leveransprotokollen som beskrivs i denna rapport kan möjliggöra skapandet av de-epitelialiserade luftvägsvävnadsställningar som kan användas för att generera de bioengineered luftvägsvävnaderna. Sådana in vitro-luftvägar kan erbjuda högkvalitativ in vitro-modellering av mänskliga luftvägssjukdomar och läkemedelsscreening. Till exempel, för att etablera funktionellt luftvägsepitel, kan luftvägsbasala stamceller först implanteras på den de-epitelialiserade luftvägsvävnaden30. Därefter kan luft-vätskegränssnittet (ALI), som är avgörande för differentieringen av basala stamceller i olika epitelceller, genereras i luftstrupen. Dessutom kan in situ-avbildningssystemet modifieras och användas för att fluorescerande visualisera luftvägarna hos patienter med lungluftvägsstörningar. För att användas kliniskt för att utvärdera luftvägsvävnader på plats kan den styva GRIN-linsen ersättas med flexibla optiska fiberavbildningssonder för att navigera i luftvägarna. Dessutom kan förmågan att homogent fördela cellerna inuti luftvägarna med hjälp av hydrogelbaserad cellsädning ge en aldrig tidigare skådad möjlighet att ersätta skadat eller skadat epitel hos patienter. I synnerhet kan den cellersättningsmetod som utvecklats och används i denna studie påskynda cellbaserad behandling för behandling av andningsstörningar, såsom cystisk fibros och primär ciliär dyskinesi, och reparera donatorlungor som vägras för transplantation på grund av allvarligt skadade luftvägsvävnader 31,32,33,34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna forskning har delvis fått stöd av American Thoracic Society Foundation Research Program, New Jersey Health Foundation och National Science Foundation (CAREER Award 2143620) till JK; och National Institutes of Health (P41 EB027062) till G.V.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 - D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
References
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).
- Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
- Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).
- De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).
- Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
- Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
- Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C.
- Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
- Planchard, D. Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , SDC Publications. (2022).
- Coward, C. A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , No Starch Press. (2019).
- Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J.
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
- Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
- Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).
- O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
- Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
- Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).
- O'Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).
- Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).
- Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
- Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).
