Imaging-guided bioreaktor för generering av bioengineered luftvägsvävnad
Summary
Protokollet beskriver en bildaktiverad bioreaktor som möjliggör selektivt avlägsnande av det endogena epitelet från råtttraset och homogen fördelning av exogena celler på lumenytan, följt av långvarig in vitro-odling av cellvävnadskonstruktionen.
Abstract
Upprepad skada på luftvägsvävnad kan försämra lungfunktionen och orsaka kronisk lungsjukdom, såsom kronisk obstruktiv lungsjukdom. Framsteg inom regenerativ medicin och bioreaktorteknik erbjuder möjligheter att producera laboratorieodlade funktionella vävnads- och organkonstruktioner som kan användas för att screena droger, modellera sjukdomar och konstruera vävnadsersättningar. Här beskrivs en miniatyriserad bioreaktor i kombination med en avbildningsmodalitet som möjliggör in situ-visualisering av den inre lumen hos utplanterade råtttraströr under in vitro-vävnadsmanipulation och odling. Med hjälp av denna bioreaktor visar protokollet bildstyrd selektiv borttagning av endogena cellulära komponenter samtidigt som de inneboende biokemiska egenskaperna och ultrastrukturen i luftvägsvävnadsmatrisen bevaras. Vidare visas leverans, enhetlig fördelning och efterföljande långvarig odling av exogena celler på decellulariserad luftvägslumen med optisk övervakning in situ. Resultaten belyser att den bildstyrda bioreaktorn potentiellt kan användas för att underlätta generering av funktionella in vitro-luftvägsvävnader.
Introduction
Den luminala ytan i luftvägarna är fodrad av ett lager av epitel som huvudsakligen består av multicilierade, klubb-, bägare- och basalstamceller 1,2. Epitelskiktet fungerar som en primär försvarsmekanism i lungan, som fungerar som en biofysisk barriär som skyddar den underliggande luftvägsvävnaden mot inhalerade patogener, partiklar eller kemiska gaser. Det skyddar luftvägsvävnaden via flera mekanismer, inklusive intercellulär tät korsningsbildning, mukociliär clearance och antimikrobiell och antioxidantsekretion 3,4. Det defekta luftvägsepitelet är förknippat med förödande luftvägssjukdomar, såsom kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL)5, primär ciliär dyskinesi (PCD)6 och cystisk fibros (CF)7.
Framsteg inom lung-on-chip (LOC) -teknik utgör en möjlighet att studera mänsklig lungutveckling, modellera olika lungsjukdomar och utveckla nya terapeutiska material i tätt reglerade in vitro-miljöer . Till exempel kan luftvägsepitele och endotel odlas på motsatta sidor av ett tunt, poröst membran för att efterlikna gasutbytet av lungvävnad, vilket möjliggör trogen sjukdomsmodellering och drogtestning8. På samma sätt har in vitro-sjukdomsmodeller skapats för att modellera luftvägssjukdomar in vitro, såsom KOL9 och cystisk fibros10. En stor utmaning med LOC-enheter är dock att sammanfatta den komplexa tredimensionella (3D) arkitekturen i lungvävnaden och dynamiska cellvävnadsmatrisinteraktioner in vitro11.
Nyligen har innovativa vävnadstekniska metoder utvecklats som möjliggör manipulation av ex vivo lungvävnader12. Med hjälp av dessa metoder kan förnekade allogena eller xenogena vävnadstransplantat framställas genom att avlägsna de endogena cellerna från lungvävnaden via kemiska, fysiska och mekaniska behandlingar13. Dessutom ger den bevarade inhemska vävnadsextracellulära matrisen (ECM) i de decellulariserade lungställningarna de fysio-mimetiska strukturella, biokemiska och biomekaniska signalerna för implanterade celler att fästa, föröka sig och differentiera 14,15.
Här rapporteras ett bildstyrt bioreaktorsystem skapat genom att kombinera LOC- och vävnadsteknik för att möjliggöra in vitro-vävnadsmanipulation och odling av explanterade råtttrakealvävnader. Med hjälp av denna bioreaktor för luftvägsvävnad visar protokollet selektivt avlägsnande av de endogena epitelcellerna utan att störa de underliggande subepitelcellulära och biokemiska komponenterna i luftvägsvävnaden. Vi visar sedan den homogena fördelningen och momentan avsättning av de nyligen sådda exogena cellerna, såsom mesenkymala stamceller (MSC), på den denuderade luftvägslumen genom att införa den cellladdade kollagen I-förgellösningen. Dessutom, genom att använda den mikrooptiska bildanordningen integrerad i bioreaktorn, görs visualiseringen av luftstrupen lumen under epitelavlägsnande och endogen cellleverans också. Vidare visas att luftstrupen och nyplanterade celler kan odlas i bioreaktorn utan märkbar celldöd och vävnadsnedbrytning i 4 dagar. Vi föreställer oss att den bildaktiverade bioreaktorplattformen, den tunnfilmsbaserade de-epitelialiseringstekniken och cellleveransmetoden som används i denna studie kan vara användbara för att generera luftvägsvävnader för in vitro-sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening.
Bioreaktorn innehåller en rektangulär kammare ansluten till en programmerbar sprutpump, perfusionspump och ventilator för odling av isolerade råttluftstrupar. Bioreaktorn har inlopp och utlopp anslutna till luftstrupen eller vävnadsodlingskammaren för att separat leverera reagenser (t.ex. odlingsmedier) till luftstrupens inre och yttre utrymmen (figur 1). Ett specialbyggt bildsystem kan användas för att visualisera det inre av den in vitro-odlade råtttrasen på cellulär nivå (figur 2). Det endogena epitelet i luftstrupen avlägsnas via instillation av en tvättmedelsbaserad decellulariseringslösning följt av vibrationsassisterad luftvägstvätt (figur 3). Hydrogellösning, såsom kollagen av typ I, används som ett leveransfordon för sådd av exogena celler jämnt och omedelbart över denuderade luftstrupen lumen (Figur 4). Alla material som används för att konstruera bioreaktorn och genomföra experimenten finns i materialförteckningen.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta arbete skapade vi en bildstyrd bioreaktor som kan möjliggöra (i) övervakning av luftstrupen lumen in situ efter cellavlägsnande och exogen cellleverans och (ii) långsiktig in vitro-odling av den cellfröade luftstrupsvävnaden. Med hjälp av denna specialbyggda bioreaktor demonstrerade vi (i) selektivt avlägsnande av de endogena epitelcellerna från luftstrupens lumen med hjälp av tvättmedel och vibrationsassisterad luftvägstvätt och (ii) enhetlig fördelning av exogena celler på den …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning har delvis fått stöd av American Thoracic Society Foundation Research Program, New Jersey Health Foundation och National Science Foundation (CAREER Award 2143620) till JK; och National Institutes of Health (P41 EB027062) till G.V.N.
Materials
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 – D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
References
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).
- Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
- Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).
- De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).
- Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
- Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
- Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
- Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
- Planchard, D. . Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , (2022).
- Coward, C. . A Beginner’s Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , (2019).
- Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. . 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
- Kim, J., O’Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
- Kim, J., O’Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).
- O’Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
- Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
- Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).
- O’Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).
- Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).
- Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
- Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).
