Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

فحص التغذية الغشائية القياسية للكشف عن عدوى المتصورة المنجلية في نواقل البعوض الأنوفيليس

Published: May 12, 2022 doi: 10.3791/63546
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Wits Research Institute for Malaria, School of Pathology, Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, 2Centre for Emerging Zoonotic and Parasitic Diseases, National Institute for Communicable Diseases, National Health Laboratory Service

Summary

يعتبر فحص التغذية الغشائية القياسي (SMFA) المعيار الذهبي لتقييم وتحديد المركبات المحتملة المضادة للملاريا. يستخدم نظام التغذية الاصطناعي هذا لإصابة البعوض لمواصلة تقييم آثار هذه المركبات على شدة وانتشار طفيلي المتصورة المنجلية .

Abstract

ولا تزال الملاريا واحدة من أكثر الأمراض تدميرا في جميع أنحاء العالم، وحتى الآن، لا تزال المنطقة الأفريقية مسؤولة عن 94٪ من جميع الحالات في جميع أنحاء العالم. يتطلب هذا المرض الطفيلي طفيليا أوليا ، وناقلا لبعوض الأنوفيليس ، ومضيف فقاري. يضم جنس Anopheles أكثر من 500 نوع ، منها 60 نوعا تعرف باسم ناقلات الطفيلي. يتكون جنس طفيليات المتصورة من 250 نوعا ، ويشارك 48 منها في انتقال الأمراض. وعلاوة على ذلك، ساهم طفيلي المتصورة المنجلية في تحقيق ما يقدر بنحو 99.7 في المائة من حالات الملاريا في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى في السنوات الأخيرة.

تشكل الخلايا المشيمة جزءا من المرحلة الجنسية للطفيلي ويتم تناولها من قبل أنثى البعوض عند التغذية على مضيف بشري مصاب. يتم تعزيز مزيد من التطوير للطفيلي داخل البعوض من خلال الظروف البيئية المواتية في منتصف الأمعاء من البعوض. هنا ، يحدث اندماج الأمشاج الأنثوية والذكورية ، وتنشأ ookinetes المتحركة. تدخل الأوكينيت إلى ظهارة الأمعاء الوسطى للبعوض ، وتشكل البوكينيت الناضجة البويضات ، والتي بدورها تنتج بوغية متحركة. تهاجر هذه الأبواغ إلى الغدد اللعابية للبعوض ويتم حقنها عندما تأخذ البعوضة وجبة دم.

لأغراض اكتشاف الأدوية ، أصيب البعوض بشكل مصطنع بالدم المصاب بالخلايا المشيمية في فحص التغذية الغشائية القياسية (SMFA). للكشف عن العدوى داخل البعوض و / أو لتقييم فعالية المركبات المضادة للملاريا ، تمت إزالة الأمعاء الوسطى من إناث البعوض بعد العدوى وكانت ملطخة بالزئبق. تم استخدام هذه الطريقة لتعزيز الكشف البصري عن البويضات تحت المجهر لتحديد دقيق لانتشار البويضات وكثافتها.

Introduction

ولا تزال الملاريا، المعروفة بأنها واحدة من أكثر الأمراض تدميرا في جميع أنحاء العالم، تشكل تهديدا كبيرا للعديد من البلدان - وخاصة تلك الموجودة في المنطقة الأفريقية - وتساهم في حوالي 95٪ من الحالات في جميع أنحاء العالم1. يحدث هذا المرض بسبب طفيلي أولي ، ويمكن أن يسبب هؤلاء الجناة ، إلى جانب ناقل البعوض Anopheles ، ضررا كبيرا للمضيف البشري2. وبشكل أكثر تحديدا، فإن الأنواع المنجلية من جنس طفيليات المتصورة مسؤولة عن ما يقدر بنحو 99٪ من حالات الملاريا في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى1. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إلقاء اللوم على العديد من نواقل البعوض الرئيسية في الأنوفيليس (بما في ذلك An. gambiae Giles، وAn. arabiensis Patton، وAn. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n.، وAn. funestus Giles) في أكثر من 95٪ من انتقال الطفيليات على مستوى العالم 3,4,5,6,7,8 . ومن أجل إثبات الرفقة المثالية لنقل الطفيليات، ينبغي أن يكون ناقل البعوض عرضة للطفيلي وأن يكون قادرا على نقله9. علاوة على ذلك ، يجب على كل من الناقل والطفيلي التغلب على الحواجز المادية لتشكيل مزيج معدي مثالي - يجب أن يكون ناقل البعوض قادرا على الحفاظ على تطور الطفيلي ، ويجب أن يكون لدى الطفيلي القدرة على التغلب على آليات الدفاع الخاصة بالمضيف 10,11.

تلعب الخلايا المشيمة ، وهي المرحلة الجنسية لطفيلي P. falciparum ، دورا حاسما في ربط شركاء الناقل والطفيلي12. يحدث التطور الجنسي في الجسم الحي ، ويصف تكوين الخلايا المشيمائية عملية تمايز خلايا الأمشاج الناضجة إلى أمشاج صغيرة ذكورية متحركة وأمشاج كبيرة أنثوية13. عملية أخرى تحدث داخل البعوض هي الجلد - وهي العملية التي تتحول خلالها خلية الأمشاج الذكرية إلى أمشاج وتخرج من خلايا الدم الحمراء التي يتم تناولها أثناء وجبة الدم11. ويقترح كذلك تعزيز عملية الجلد من خلال تغيير إيجابي في بيئة البعوض midgut14. بعد الضرب ، يتم تشكيل zygote عن طريق اندماج الأمشاج الذكور والإناث13. من الزيجوت ، ينشأ أوكينيت متحرك وينتقل من وجبة الدم إلى ظهارة البعوض midgut13. هنا ، ينضج ookinete ، ويتم تشكيل oocyst ، والذي بدوره ينتج sporozoites المتحركة13,15. ثم تهاجر الأبواغ إلى الغدد اللعابية للبعوض ، وعندما يأخذ البعوض وجبة دم من مضيفه ، يتم حقن هذه الأبواغ في مجرى دم المضيف15.

وقد أصبحت تدخلات مكافحة الملاريا، التي تجمع بين استراتيجيات مكافحة النواقل واستخدام الأدوية الفعالة المضادة للملاريا، حاسمة الأهمية في مكافحة هذا المرض15. ومع ارتفاع مقاومة الطفيليات والبعوض، تزداد الحاجة الملحة إلى تحديد مركبات جديدة مضادة للملاريا16. لذلك ، فإن التقييم في الجسم الحي للمركبات المانعة للانتقال مهم16. بعد تطوير مثل هذه الأدوية الفعالة لمنع انتقال العدوى ، تم استخدام SMFA لتقييم ما إذا كانت هذه المركبات تمنع التطور الجنسي للمتصورة المنجلية في بعوضة الأنوفيليس 17،18،19. اكتسب هذا الفحص اعترافا منذ 1970-1980s كمعيار ذهبي لتقييم منع الإرسال20,21. يوفر هذا الفحص بديلا أرخص من الفحوصات الأخرى مثل RT-qPCR ، والتي تتطلب معدات متخصصة. علاوة على ذلك ، ليست هناك حاجة إلى مرضى لتنفيذ التجارب. يتضمن هذا الفحص أيضا توفير الدم الناجم عن الخلايا الأمشاج لإناث البعوض ، والتي يتم تشريحها بعد ذلك لتقييم ما إذا كان تطور البويضة موجودا21. هذا يسمح بتحديد كمية الخلايا المشيمة والكشف عن البويضات المشوهة بسبب المركبات22. لكي يتم تصنيف مركب على أنه فعال ، يجب تقييم معدل الانتشار (نسبة البعوض الذي يؤوي بويضة واحدة على الأقل في الأمعاء الوسطى) وعدد البويضات (الكثافة) في الأمعاء الوسطى للبعوض لتقييم تثبيط العدوى17،21،22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ارجع إلى الشكل 1 للحصول على توضيح للبروتوكول. تم الحصول على تصريح أخلاقي من لجنة أخلاقيات العلوم الصحية بجامعة بريتوريا (506/2018) لسحب واستخدام الدم البشري.

1. ثقافة الخلايا المشيمية

ملاحظة: قبل إنشاء SMFA، تم إعداد ثقافة gametocyte في جامعة بريتوريا (انظر Reader et al.22 للاطلاع على البروتوكول الكامل).

  1. قم بإعداد ثقافة gametocyte التي تتكون من خلايا المشاج من المرحلة V من سلالة طفيلي NF54.
  2. تأكد من أن خلايا الدم الأمشاج في الثقافة تتراوح بين 1.5٪ و 2.5٪ ، مع هيماتوكريت 50٪ في مصل الذكور A + ، والذي تضاف إليه خلايا الدم الحمراء الطازجة.
  3. افصل الثقافة إلى قوارير مختلفة وأضف 2 ميكرومتر من كل مركب لكل علاج على حدة قبل 48 ساعة من إجراء SMFA. اترك المجموعة الضابطة دون علاج.
  4. قم بتقييم ثقافة الخلايا المشيمية قبل وقت قصير من إجراء SMFA لضمان جلد الأمشاج الذكور ، مع وجود نسبة 3: 1 من الإناث إلى الذكور.

2. العدوى الاصطناعية للبعوض من خلال SMFA

ملاحظة: السلامة الأحيائية: ينبغي إيواء البعوض المصاب في مرفق للسلامة الأحيائية من المستوى 2 (BSL2) مع تقييد الوصول.

  1. باستخدام شفاط الفم ، ضع 25 أنثى من البعوض الغامبي غير المتغذى في كوب تغذية سعة 350 مل. افعل الشيء نفسه لكل كوب علاج وقم بتسمية الكؤوس بوضوح وفقا لما إذا كان سيتم استخدامها كمجموعات تحكم أو علاج. اختر عدد الأكواب لكل علاج وفقا لعدد النسخ المتماثلة الفنية المضمنة.
    ملاحظة: يستخدم البعوض المستعمرة الذي يتراوح عمره بين 5 و 7 أيام في تقييم مركب نموذجي لمنع انتقال العدوى. إن تجويع البعوض لمدة 3-4 ساعات أو أكثر قبل تغذية الدم سيسهل امتصاص الدم أثناء SMFA.
  2. قم بتوصيل نظام التغذية الزجاجية بالحمام المائي وحافظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تتكون وحدة التغذية الزجاجية من ذراعين متصلين بأنبوب السيليكون الذي يتصل به الحمام المائي (الشكل 2). يسمح الهيكل المجوف للوحدة المغذية للمياه بالدوران من خلال درجة حرارة الدم والحفاظ عليها.
  3. تحضير أمعاء البقر (أو الغشاء الاصطناعي) عن طريق شطفها في ماء الصنبور وتقطيعها إلى قطع يتم تركيبها لكل وحدة تغذية. قم بتغطية كل وحدة تغذية واربط الغشاء بشريط مرن.
    ملاحظة: لم تكن هناك حاجة إلى تصريح أخلاقي للأمعاء، حيث تم شراؤها من مجزرة محلية، حيث يتم بيعها للجمهور لإعداد الطعام.
  4. ضع أكواب العدوى أسفل المغذيات ، مع وضع الغشاء فوق شبكة الكأس.
  5. أضف 1 مل من الدم المصاب بالخلايا الأمشاج إلى مغذيات أكواب التحكم والدم المصاب بالخلايا المشبعة مع مركب مضاف إلى كل وحدة تغذية مركبة وكوب مقابل.
  6. اترك البعوض يتغذى لمدة 40 دقيقة تقريبا مع كشف المغذيات.
    ملاحظة: تتم التغذية في ظل ظروف حشرية (25 درجة مئوية ، رطوبة نسبية 80٪) في الظلام. يبلغ قطر وحدة التغذية حوالي 13 ملم.
  7. بعد الرضاعة ، قم بإزالة المغذيات من الكؤوس ، وشطف المغذيات ، وعالج الدم الزائد بهيبوكلوريت.
  8. قم بإزالة البعوض غير المغذى من الكأس عن طريق ضرب جميع البعوض على الجليد (لمدة 1-2 دقيقة) وفصل البعوض غير المغذى عن أولئك الذين تناولوا وجبة دم. ابحث عن البطن المتورم والأحمر (الذي يشير إلى الدم) لتمييز البعوض المحتقن بالكامل عن البعوض غير المتغذى (الشكل 3).
  9. ضع أكواب العدوى في غرفة السلامة الأحيائية (الشكل التكميلي S1) وزود كل كوب بوسادة ماء سكر بنسبة 10٪ ، لتحل محل ماء السكر في أيام بديلة لمدة 8-10 أيام.

3. إعداد البعوض المصاب

ملاحظة: يحدث هذا الجزء من البروتوكول داخل غرفة العدوى BSL2. ولا يسمح إلا للموظفين المدربين والمصرح لهم بدخول غرفة العدوى التي يوجد فيها البعوض المصاب. يتم الاحتفاظ بالبعوض في أكواب معدلة تحتوي على نقطة دخول واحدة فقط ، والتي تغلق تلقائيا عند إزالة شفاط الفم. يتم وضع هذه الأكواب داخل حاوية شفافة من اللدائن الحرارية لمنع الهروب. تقع الحاوية في غرفة العدوى خلف نظام الباب المزدوج. يجب أن تكون جميع البروتوكولات اللازمة سارية المفعول للتعرض العرضي للبعوض المصاب (الملف التكميلي S1). والبروتوكولات خاصة بكل بلد وتعتمد على متطلبات المؤسسة.

  1. في الأيام 8-10 بعد التغذية بالعدوى ، اضرب البعوض المصاب عن طريق وضعه على الجليد ونقله إلى أنابيب تحمل علامات تحتوي على 70٪ من الإيثانول (مع إبقاء البعوض لكل مجموعة مراقبة وعلاج منفصلة).
  2. تأكد من أن جميع البعوض ميت قبل مغادرة غرفة العدوى.

4. تشريح البعوض المصاب

ملاحظة: يتم إجراء هذا الجزء من البروتوكول في المختبر.

  1. انقل البعوض إلى أطباق بتري المبطنة بورق الترشيح، مع الحفاظ على مجموعات التحكم والاختبار منفصلة.
  2. ضع قطرة من المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) على شريحة مجهرية (تم تمييزها وفقا لمجموعة التحكم / الاختبار) وانقل بعوضة فردية من ورقة الترشيح إلى PBS.
  3. قم بإزالة القناة الهضمية الوسطى من العينة المصابة المجمدة عن طريق تثبيت صدر البعوضة بإبرة التشريح أثناء سحب الجزءالبطني 7 باستخدام الملقط.
  4. مع تعرض الأمعاء ورؤيتها ، ابحث عن أنابيب Malpighian (الشكل 4A ، B) لتمييز الأمعاء عن المبيضين. قم بإزالته من PBS ، وانقله إلى قطرة من الزئبق بنسبة 0.1٪ على شريحة مجهر جديدة ، واترك الأمعاء لتلطخ لمدة 8-10 دقائق.
  5. بعد التلطيخ ، ضع غطاء على القناة الهضمية الملطخة وشاهد القناة الهضمية تحت إضاءة ساطعة عند تكبير 20x-40x (الشكل 4C ، D).
  6. سجل وجود وعدد البويضات لكل أمعائ متوسطة لكل مجموعة تحكم وعلاج (الملف التكميلي S2).
  7. احسب نشاط حجب الإرسال باستخدام المعادلة (1):
    ٪ TBA Equation 1 (1)
    حيث TBA = نشاط منع انتقال العدوى (الحد من انتشار البويضات) ؛ p = انتشار البويضات; C = السيطرة; و T = العلاج.
  8. احسب نشاط اختزال الإرسال باستخدام المعادلة (2):
    ٪هيئة تنظيم الاتصالات = Equation 2 (2)
    حيث TRA = نشاط الحد من انتقال العدوى (الحد من كثافة البويضات) ؛ I = شدة البويضات; C = السيطرة; و T = العلاج.
    ملاحظة: قد لا يتم تخفيض TBA بشكل كبير، ولكن يمكن ملاحظة اختلاف كبير في هيئة تنظيم الاتصالات والعكس صحيح. هذا يعتمد على المواد الكيميائية التي يتم تقييمها.
  9. قم بإجراء تحليل إحصائي باستخدام اختبار t غير البارامتري (Mann-Whitney).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وبلغ العدد الإجمالي لعينات المكافحة التي تم تشريحها 47 عينة، بمتوسط انتشار يصل إلى 89 في المائة وكثافة قدرها 9.5 بويضة لكل معاء متوسطة (الجدول 1، كما نشر سابقا22). بالنسبة للمركب MMV1581558 ، بلغ حجم العينة ما مجموعه 42 عينة ، مع انتشار البويضات بنسبة 36٪ ومتوسط كثافة 1.5 بويضة. وهذا يدل على انخفاض في معدل انتشار الكيسة البيضاء بنسبة 58٪ و TRA بنسبة 82٪ عبر جميع النسخ البيولوجية الثلاثة (الجدول 1).

وكانت كل من النسبة المئوية لهيئة تنظيم الاتصالات ونسبة TBA ل MMV1581558 أعلى من 50٪. وبالتالي، يمكن اعتبار هذا المركب مرشحا محتملا لمنع الإرسال وتخفيضه. أظهر التحليل الإحصائي لكل من الشدة والانتشار فرقا كبيرا بين المجموعة الضابطة و MMV1581558 (p < 0.0001) (الجدول 1 والشكل 5).

Figure 1
الشكل 1: رسم توضيحي لنظام العدوى الاصطناعي لبعوض الأنوفيليس مع الخلايا المشيمية المتصورة المنجلية . اختصار: SMFA = فحص التغذية الغشائية القياسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نظام التغذية الغشائية مع المياه المتداولة من خلال مغذيات الزجاج وأنابيب السيليكون لتنظيم درجة حرارة ثقافة gametocyte.

Figure 3
الشكل 3: أنثى الأنوفيليس المحتقنة بالكامل بعد تناول وجبة دم.

Figure 4
الشكل 4: الأمعاء الوسطى لأنثى الأنوفيل. (أ) مع أنابيب مالبيغيان. (ب) مع المبيضين. (ج) مع البويضات المتصورة المنجلية؛ و (د) الأمعاء الوسطى غير المصابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: ملخص إحصائي لشدة البويضات بين المجموعة الضابطة (n = 47) والمركب MMV1581558 (n = 42). أشرطة الخطأ, ±SE; تشير العلامات النجمية إلى فرق كبير (ns P > 0.05 ، ****P < 0.0001). اختصار: DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسايد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مركب عدد الممثلين. حجم العينة متوسط الانتشار متوسط الكثافة/الأمعاء ٪ TBA ٪هيئة تنظيم الاتصالات انتشار قيمة P كثافة قيمة P
تحكم 3 47 89% 9.5
MMV1581558 3 42 36% 1.5 58% 82% <0.0001 <0.0001

الجدول 1: مجموعة بيانات مركب مضاد للملاريا، MMV1581558، تم تقييمه خلال ثلاث نسخ بيولوجية من فحص التغذية الغشائية القياسي. لكل مجموعة تحكم واختبار ، يشار إلى حجم العينة (n) ، إلى جانب متوسط انتشار البويضة وكثافتها لكل من منتصف الأمعاء. ويشار إلى نشاط منع الإرسال ونشاط الحد من الإرسال. الاختصارات: TBA = نشاط حجب الإرسال؛ TRA = نشاط الحد من الإرسال.

الشكل التكميلي S1: البعوض المصاب الموجود داخل غرفة في غرفة العدوى للحشرة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي S1: بروتوكول التعرض العرضي للبعوض المصاب. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي S2: ورقة تسجيل لانتشار البويضات وكثافتها. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ولكي يتم تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح، ينبغي إيلاء الاهتمام لكل خطوة، على الرغم من أنها قد تكون عملية شاقة وشاقة. واحدة من أهم الخطوات هي التأكد من أن ثقافة gametocyte ذات نوعية جيدة وأنها تتكون من خلايا الأمشاج الناضجة ، مع نسبة الذكور إلى الإناث الصحيحة ، قبل بدء SMFA23,24. خلال SMFA ، من الأهمية بمكان أيضا الحفاظ على ثقافة الخلايا المشيمية في درجة الحرارة الصحيحة لمنع الأمشاج الذكور من الجلد قبل دخول البعوض. عامل آخر يلعب دورا حاسما في إنشاء عدوى اصطناعية ناجحة هو التأكد من أن إناث البعوض حريصة على تناول وجبة دم لأن سلوك تغذية البعوض يمكن أن يؤثر أيضا بشكل كبير على النتيجة25. لضمان تشريح البعوض الذي يتم تغذيته بالكامل فقط بعد تطور البويضات ، من الأهمية بمكان التركيز على إزالة جميع البعوض غير المغذي من كل كوب ، لأن هذا يمكن أن يؤثر بشكل كبير على النتائج. تشريح الأمعاء الوسطى هو خطوة مهمة أخرى لضمان توفر عينات كافية لمزيد من التحليل. تميل Midguts إلى التمزق ، مما قد يتسبب في نزول محتوى الأمعاء الوسطى. خطوة أخرى مهمة في هذا البروتوكول هي تلطيخ الأمعاء الوسطى ، وهو أمر بالغ الأهمية للكشف عن البويضات وعدها تحت المجهر.

وتشمل بعض القيود المفروضة على هذه الطريقة صغر حجم عينة البعوض، والتي يمكن أن تؤثر على دقة وتباين تقدير هيئة تنظيم الاتصالات20,26. هذا هو في الغالب نتيجة لانخفاض معدل التغذية خلال SMFA. نظرا لأن معظم مستعمرات البعوض يتم الحفاظ عليها على دم الحيوان ، فإن توفير ثقافة دم بشرية مصابة بالخلايا المشيمية في SMFA قد يساهم في معدل التغذية دون المستوى الأمثل. ويلاحظ هذا أيضا مع إضافة بعض المركبات ، والتي قد تكون بمثابة طارد للبعوض. تلطيخ البويضات مع الزئبق له بعض العيوب لأنه يلطخ الهياكل الأخرى داخل منتصف الأمعاء27. هذا يسبب ضعف رؤية البويضات ويجعل عد البويضات أمرا صعبا ، مما يؤثر على النتائج28. تنشأ نتائج متضاربة أيضا عند مقارنة تلك الناتجة عن فحص SFMA بالاختبارات البديلة29,30. علاوة على ذلك ، فإن القيود مثل قيود الوقت والتشريح الكثيف العمالة تحد من المعالجة عالية الإنتاجية عند استخدام هذه الطريقة31. كما وجد أن عدد الخلايا المشبدة التي يتناولها البعوض خلال عملية العدوى الاصطناعية هذه منخفض في بعض الحالات ، مما قد يؤثر على كثافة البويضات32،33،34.

كما تم تطوير طرق بديلة أخرى ، بما في ذلك اختبارات التلألؤ الحيوي ، حيث يتم استخدام خطوط الطفيليات التي تعبر عن لوسيفيراز اليراع36. على الرغم من أن الطريقة الأخيرة تزيد من إنتاجية العينات ، إلا أن لها أيضا قيودها الخاصة ، حيث لا يمكن استخدام خطوط الطفيليات هذه لتقييم انتقال العدوى التي تحدث بشكل طبيعي أو تنطوي على طفيليات من النوع البري37. كما تستخدم الطرق الأخرى التي تنطوي على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على نطاق واسع. على الرغم من أن هذه الطرق تعزز حساسية الكشف عن البويضات ، إلا أنها ليست كلها كمية بالكامل38,39,40. يعد اختبار TaqMan qPCR طريقة واعدة أخرى للكشف عن البويضات المنجلية المتصورة ، وقد وجد أن هذه الطريقة تحدد كميا مستويات أقل بكثير من الطفيليات من الفحص المجهري41,42,43,44. ومع ذلك ، يتطلب هذا الفحص معدات ومجسات باهظة الثمن. علاوة على ذلك ، لا يمكن اكتشاف التغيرات المحتملة في مورفولوجيا البويضات بسبب المركبات بشكل واضح أثناء qPCR. بالمقارنة مع هذه الطرق ، تظل طريقة SFMA أداة قيمة للكشف عن العدوى وتقييم المركبات حيث أن معظم قيود هذه الطريقة يسهل التغلب عليها نسبيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن ينتفهموا بروفيسور . لين ماري بيركهولتز والدكتورة جانيت ريدر من قسم الكيمياء الحيوية وعلم الوراثة وعلم الأحياء الدقيقة ، معهد المكافحة المستدامة للملاريا ، في جامعة بريتوريا ، لزراعة وتزويد ثقافة الخلايا المشيمة. تم الحصول على سلالة الطفيليات من القسم الأخير (وليس جزءا من هذا المنشور). قسم العلوم والابتكار (DSI) والمؤسسة الوطنية للبحوث (NRF) ؛ مبادرة كراسي البحث في جنوب أفريقيا (UID 64763 إلى LK و UID 84627 إلى LMB) ؛ مجتمعات الممارسة NRF (110666 إلى LMB و LK) ؛ كما تم الاعتراف بشراكات الابتكار الصحي الاستراتيجية لمجلس البحوث الطبية في جنوب أفريقيا (SHIP) للحصول على أموال من DSI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine intestine/ Butchery
Compound MMV1581558 MMV Pandemic response box
Dissecting needles WRIM Custom made
falcon tube Lasec
Glass feeders Glastechniek Peter Coelen B.V.
Graphpad Prism (8.3.0) Graphpad
Mercurochrome Merck (Sigma-Aldrich) 129-16-8
Microscope slides Merch (Sigma-Aldrich) S8902
Parafilm Cleansafe
PBS tablets ThermoFisher Scientific BP2944
Perspex biosafety cabinet Wits University Made by the contractors at Wits
Plastic cups (350 mL) Plastic Land

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Malaria Report. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240040496 (2021).
  2. Takken, W., Verhulst, N. O. Host preferences of blood feeding mosquitoes. Annual Review of Entomology. 58, 433-453 (2013).
  3. Gillies, M. T., Coetzee, M. Supplement to the Anophelinae of Africa south of the Sahara Afrotropical region. Publications of the South African Institute for Medical Research. 55, 1 (1987).
  4. Gillies, M. T., De Meillon, B. The Anophelinae of Africa south of the Sahara. Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, (1968).
  5. Antonio-Nkondjio, C., et al. Complexity of the malaria vectorial system in Cameroon: contribution of secondary vectors to malaria transmission. Journal of Medical Entomology. 43, 1215-1221 (2006).
  6. Sinka, M. E., et al. The dominant Anopheles vectors of human malaria in Africa, Europe and the Middle East: occurrence data, distribution maps and bionomic précis. Parasites and Vectors. 3, 117 (2010).
  7. Coetzee, M., Hunt, R. H., Wilkerson, R., Della Torre, A., Coulibaly, M. B., Besansky, N. J. Anopheles coluzzii and Anopheles amharicus, new members of the Anopheles gambiae complex. Zootaxa. 3619, 246-274 (2013).
  8. Kyalo, D., Amratia, P., Mundia, C. W., Mbogo, C. M., Coetzee, M., Snow, R. W. A geo-coded inventory of anophelines in the Afrotropical Region south of the Sahara: 1898-2016. Wellcome Open Research. 2, 57 (2017).
  9. Cohuet, A., Harris, C., Robert, V., Fontenille, D. Evolutionary forces on Anopheles: What makes a malaria vector. Trends in Parasitology. 309, (2009).
  10. Weathersby, A. B. The role of the stomach wall in the exogenous development of Plasmodium gallinaceum as studies by means of haemocoel injections of susceptible and refractory mosquitoes. The Journal of Infectious Diseases. 91, 198-205 (1952).
  11. Ally, A. S. I., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. I. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. The Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
  12. Delves, M. J., et al. Male and female Plasmodium falciparum mature gametocytes show different responses to antimalarial drugs. American Society for Microbiology Journal. , (2013).
  13. Sinden, R. E. Sexual development of malarial parasites in their mosquito vector. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 75, (1981).
  14. Garcia, G. E., Wirtz, R. A., Barr, J. R., Woolfitt, A. Xanthurenic acid induces gametogenesis in Plasmodium, the malaria parasite. Journal of Biological Chemistry. 15, 12003-12005 (1998).
  15. Oaks, S. C. Jr, Mitchell, V. S., Pearson, G. W., et al. Malaria: Obstacles and Opportunities. , National Academic Press. ISBN 0-309-54389-4 (1991).
  16. Le Manach, C., et al. Identification and profiling of a novel Diazaspirol[3.4]octane chemical series active against multiple stages of the human malaria parasite Plasmodium falciparum and optimization efforts. Journal of Medicinal Chemistry. 64, 2291-2309 (2021).
  17. Cibulskis, R. E., et al. Malaria: global progress 2000-2015 and future challenges. Infect Diseases of Poverty. 5, 61 (2016).
  18. Smith, T. A., Chitnis, N., Briet, O. J., Tanner, M. Uses of mosquito-stage transmission-blocking vaccines against Plasmodium falciparum. Trends in Parasitology. 27, 190-196 (2011).
  19. Boyd, M. F. Epidemiology: factors related to the definitive host. Malariology. Boyd, M. F. , W.B. Saunders. Philadelphia. 608-697 (1949).
  20. Ponnudurai, T., van Gemert, G. J., Bensink, T., Lensen, A. H., Meuwissen, J. H. Transmission blockade of Plasmodium falciparum: its variability with gametocyte numbers and concentration of antibody. Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine. 81, 491-493 (1987).
  21. Rutledge, L. C., Ward, R. A., Gould, D. J. Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder. Mosquito News. 24 (4), (1964).
  22. Reader, J., et al. Multistage and transmission-blocking targeted antimalarials discovered from the open-source MMV Pandemic Response Box. Nature Communications. 12, 269 (2021).
  23. Bousema, T., et al. Mosquito feeding assays for natural infections. PLoS One. 7 (8), (2012).
  24. Churcher, T., et al. Measuring the blockade of malaria transmission - An analysis of the standard membrane feeding assay. International Journal for Parasitology. 42, 1037-1044 (2012).
  25. Medley, G. F., et al. Heterogeneity in patterns of malarial oocyst infections in the mosquito vector. Parasitology. 106, 441-449 (1993).
  26. Miura, K., et al. Transmission-blocking activity is determined by transmission reducing activity and number of control oocysts in Plasmodium falciparum standard membrane-feeding assay. Vaccine. 34, 4145-4151 (2016).
  27. Sattabongkot, J., Maneechai, N., Rosenberg, R. Plasmodium vivax: gametocyte infectivity of naturally infected Thai adults. Parasitology. 102 (01), 27-31 (1991).
  28. Vallejo, A. F., Garcia, J., Amado-Garavito, A. B., Arevalo-Herrera, M., Herrera, S. Plasmodium vivax gametocyte infectivity in sub-microscopic infections. Malaria Journal. 15 (1), 48 (2016).
  29. Ponnudurai, T., Lensen, A. H. W., van Gemert, G. J. A., Bolmer, M. G., Meuwissen, J. H. E. Feeding behavior and sporozoite ejection by infected Anopheles stephensi. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 85, 175-180 (1991).
  30. Miura, K., et al. Qualification of standard membrane-feeding assay with Plasmodium falciparum malaria and potential improvements for future assays. PLoS One. 8, 57909 (2013).
  31. Griffin, P., et al. Safety and reproducibility of a clinical trial system using induced blood stage Plasmodium vivax infection and its potential as a model to evaluate malaria transmission. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10, 0005139 (2016).
  32. Delves, M. J., Sinden, R. E. A semi-automated method for counting fluorescent malaria oocysts increases the throughput of transmission blocking studies. Malaria Journal. 9, 35 (2010).
  33. vander Kolk, M., et al. Evaluation of the standard membrane feeding assay (SMFA) for the determination of malaria transmission-reducing activity using empirical data. Parasitology. 130, 13-22 (2005).
  34. van der Kolk, M., de Vlas, S. J., Sauerwein, R. W. Reduction and enhancement of Plasmodium falciparum transmission by endemic human sera. International Journal for Parasitology. 36, 1091-1095 (2006).
  35. Singh, M., et al. Plasmodium's journey through the Anopheles mosquito: A comprehensive review. Biochimie. 181, 176-190 (2021).
  36. Vos, M. W., et al. A semi-automated luminescence based standard membrane feeding assay identifies novel small molecules that inhibit transmission of malaria parasites by mosquitoes. Scientific Reports. 5, 18704 (2015).
  37. Azevedo, R., et al. Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61, (2017).
  38. Okell, L. C., Bousema, T., Griffin, J. T., Ouedraogo, A. L., Ghani, A. C., Drakeley, C. J. Factors determining the occurrence of submicroscopic malaria infections and their relevance for control. Nature Communications. 3, 1237 (2012).
  39. Pasay, C. J., et al. Piperaquine monotherapy of drug-susceptible Plasmodium falciparum infection results in rapid clearance of parasitemia but is followed by the appearance of gametocytemia. The Journal of Infectious Diseases. 214, 105-113 (2016).
  40. Stone, W. J., et al. A scalable assessment of Plasmodium falciparum transmission in the standard membrane-feeding assay, using transgenic parasites expressing green fluorescent protein-luciferase. The Journal of Infectious Diseases. 210, 1456-1463 (2014).
  41. Hasan, A. U., et al. Implementation of a novel PCR based method for detecting malaria parasites from naturally infected mosquitoes in Papua New Guinea. Malaria Journal. 8, 182 (2009).
  42. Stone, W. J., et al. The relevance and applicability of oocyst prevalence as a read-out for mosquito feeding assays. Scientific Reports. 3, 3418 (2013).
  43. Marquart, L., Baker, M., O'Rourke, P., McCarthy, J. S. Evaluating the pharmacodynamic effect of antimalarial drugs in clinical trials by quantitative PCR. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59, 4249-4259 (2015).
  44. McCarthy, J. S., et al. tolerability, pharmacokinetics, and activity of the novel long-acting antimalarial DSM265: a two-part first-in-human phase 1a/1b randomised study. TheLancet Infectious Diseases. 17, 626-635 (2017).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 183 ، فحص التغذية الغشائية القياسية ، تشريح الأمعاء الوسطى ، البويضات ، الملاريا ، فحص التغذية الغشائية القياسية
فحص التغذية الغشائية القياسية للكشف عن عدوى <em>المتصورة المنجلية</em> في نواقل البعوض <em>الأنوفيليس</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Erlank, E., Venter, N., Koekemoer,… More

Erlank, E., Venter, N., Koekemoer, L. L. Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors. J. Vis. Exp. (183), e63546, doi:10.3791/63546 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter