Summary
標準的な膜供給アッセイ(SMFA)は、潜在的な抗マラリア化合物の評価と同定のためのゴールドスタンダードと見なされています。この人工給餌システムは、熱帯 熱 マラリア原虫の強度と有病率に対するそのような化合物の影響をさらに評価するために蚊に感染するために使用されます。
Abstract
マラリアは依然として世界で最も壊滅的な病気の1つであり、今日まで、アフリカ地域は依然として世界の全症例の94%を占めています。この寄生虫症には、原虫寄生虫、 ハマダラカ の蚊媒介動物、および脊椎動物の宿主が必要です。 ハマダラカ 属は500種以上で構成され、そのうち60種は寄生虫のベクターとして知られています。 マラリア 原虫属は250種で構成され、そのうち48種が病気の伝染に関与しています。さらに、熱帯 熱 マラリア原虫は、近年、サハラ以南のアフリカにおけるマラリア症例の推定99.7%に貢献しています。
配偶子細胞は寄生虫の性段階の一部を形成し、感染したヒト宿主に摂食すると雌の蚊によって摂取される。蚊内の寄生虫のさらなる発達は、蚊の中腸内の好ましい環境条件によって促進される。ここでは、女性と男性の配偶子の融合が起こり、運動性のオキネテスが始まります。オキネテスは蚊の中腸上皮に入り、成熟したオキネテスはオーシストを形成し、それが次に運動性スポロゾイトを生成します。これらのスポロゾイトは蚊の唾液腺に移動し、蚊が血の食事をとるときに注射されます。
創薬目的で、蚊は標準的な膜摂食アッセイ(SMFA)で配偶子細胞に感染した血液に人工的に感染しました。蚊の感染を検出するため、および/または抗マラリア化合物の有効性を評価するために、雌の蚊の中腸を感染後に除去し、マーキュロクロムで染色しました。この方法は、オーシストの有病率と強度を正確に決定するために、顕微鏡下でのオーシストの視覚的検出を強化するために使用されました。
Introduction
世界で最も破壊的な病気の1つとして知られているマラリアは、依然としていくつかの国、特にアフリカ地域内の国に大きな脅威をもたらし、世界中の症例の約95%を占めています1。この病気は原虫寄生虫によって引き起こされ、そのハマダラカの蚊媒介動物と一緒に、これらの犯人は人間の宿主に大きな害を及ぼす可能性があります2。より具体的には、熱帯熱マラリア原虫属の熱帯熱マラリア種は、サハラ以南のアフリカのマラリア症例の推定99%を占めています1。これに加えて、いくつかの主要なハマダラカ媒介動物(An. gambiae Giles、An. arabiensis Patton、An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n.、An. funestus Gilesを含む)は、世界の寄生虫伝播の95%以上が原因である可能性があります3,4,5,6,7,8。.理想的な寄生虫とベクターの交際が確立されるためには、蚊のベクターは寄生虫の影響を受けやすく、それを伝達できる必要があります9。さらに、ベクターと寄生虫の両方が物理的な障壁を克服して完全な感染の組み合わせを形成する必要があります-蚊のベクターは寄生虫の発生を維持できる必要があり、寄生虫は宿主の防御メカニズムを克服する能力を持っている必要があります10,11。
熱帯熱マラリア原虫の性段階である配偶子細胞は、ベクターと寄生虫のパートナーをつなぐ上で重要な役割を果たします12。性的発達はin vivoで起こり、配偶子細胞形成は成熟配偶子細胞が運動性の雄性微小配偶子および雌性大配偶子に分化する過程を説明する13。蚊の中で起こる別のプロセスは、鞭打ちです-その間に雄の配偶細胞が配偶子に変化し、血の食事の間に取り込まれた赤血球から出現するプロセス11。この榴散プロセスは、蚊の中腸14の環境の好ましい変化によって増強されることがさらに示唆される。鞭毛後、接合子は男性と女性の配偶子の融合によって形成されます13。接合子から、運動性のオキネテが発生し、血粉から蚊の中腸13の上皮に移動する。ここで、オキネテが成熟し、オーシストが形成され、それが次に運動性スポロゾイトを生成する13,15。その後、スポロゾイトは蚊の唾液腺に移動し、蚊が宿主から血の食事を奪うと、これらのスポロゾイトは宿主の血流に注入されます15。
ベクター制御戦略と効果的な抗マラリア薬の使用を組み合わせたマラリア制御介入は、この病気と戦う上で重要になっています15。寄生虫および蚊の抵抗性の増加に伴い、新規抗マラリア化合物の同定の緊急性が高まっています16。したがって、透過遮断化合物のin vivo評価には重要である16。このような効果的な伝達遮断薬の開発後、SMFAは、これらの化合物がハマダラカの熱帯熱マラリア原虫の性的発達を阻害するかどうかを評価するために使用されてきました17,18,19。このアッセイは、1970〜1980年代から、透過遮断を評価するためのゴールドスタンダードとして認識されています20,21。このアッセイは、特殊な装置を必要とするRT-qPCRなどの他のアッセイよりも安価な代替手段を提供します。さらに、実験を実行するために患者は必要ありません。このアッセイはまた、配偶子細胞誘導血液を雌の蚊に供給することを含み、次いで、オーシスト発生が存在するかどうかを評価するために解剖される21。これにより、配偶子細胞の定量および化合物22のために変形したオーシストの検出が可能になります。化合物が有効であると分類されるためには、感染阻害を評価するために、蚊の中腸における有病率(少なくとも1つのオーシストを保有する蚊の割合)および蚊の中腸におけるオーシストの数(強度)を評価しなければならない17,21,22。
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Protocol
プロトコルの図については、 図 1 を参照してください。倫理的クリアランスは、人間の血液の回収と使用について、プレトリア大学健康科学倫理委員会(506/2018)から取得されました。
1. 配偶子細胞培養
注:SMFAを設立する前に、プレトリア大学で配偶子細胞培養が準備されました(完全なプロトコルについては、Readerら22 を参照してください)。
- NF54寄生虫株のステージV配偶細胞からなる配偶子細胞培養を準備します。
- 培養物の配偶子細胞血症が1.5%から2.5%の間であり、新鮮な赤血球が添加されているA +男性血清に50%のヘマトクリットが含まれていることを確認してください。
- 培養液を異なるフラスコに分離し、SMFAを実施する48時間前に、それぞれの処理ごとに2 μMの各化合物を追加します。対照群は未処理のままにしておきます。
- SMFAを実施する直前に配偶子細胞の培養を評価して、3:1の女性:男性の比率の存在で、男性配偶子の鞭毛を確実にします。
2. SMFAによる蚊の人工感染
注:バイオセーフティ:感染した蚊は、アクセスが制限されたバイオセーフティレベル2(BSL2)施設に収容する必要があります。
- 口内吸引器を使用して、25匹の無給餌の 雌のAn.ガンビアエ 蚊を350mLの給餌カップに入れます。各トリートメントカップについても同じことを行い、コントロールグループとして使用するか、治療グループとして使用するかに応じて、カップに明確にラベルを付けます。含まれるテクニカルレプリケートの数に応じて、治療ごとのカップ数を選択します。
注:5〜7日齢のコロニー蚊は、典型的な感染遮断化合物の評価に使用されます。採血前に3〜4時間以上蚊を飢えさせると、SMFA中の血液の取り込みが促進されます。 - ガラスフィーダーシステムをウォーターバスに接続し、温度を37°Cに維持します。
メモ: ガラスフィーダーは、ウォーターバスが接続されているシリコンチューブに接続された2つのアームで構成されています(図2)。フィーダーの中空構造により、水が循環し、血液の温度が維持されます。 - 牛の腸(または合成膜)を水道水ですすいで準備し、各フィーダーに適合する小片にカットします。各フィーダーを覆い、メンブレンをゴムバンドで固定します。
注:腸は地元の肉屋から購入され、食品調理のために一般に販売されているため、倫理的クリアランスは必要ありませんでした。 - 感染カップをフィーダーの下に置き、膜をカップのネットの上に置きます。
- 配偶子細胞感染血液1 mLをコントロールカップのフィーダーに追加し、配偶子細胞感染血液を追加し、対応する各化合物フィーダーとカップに化合物を追加します。
- フィーダーを覆った状態で約40分間蚊に餌を与えます。
注:給餌は、暗闇の中で昆虫条件(25°C、相対湿度80%)で行われます。フィーダの直径は約13 mmです。 - 給餌後、カップからフィーダーを取り外し、フィーダーをすすぎ、余分な血液を次亜塩素酸塩で処理します。
- すべての蚊を氷の上に(1〜2分間)ノックダウンし、給餌されていない蚊を血の食事をした蚊から分離することにより、カップから給餌されていない蚊を取り除きます。腹部が腫れて赤い(血液を示す)を探して、給餌された完全に充血した蚊と給餌されていない蚊を区別します(図3)。
- 感染カップをバイオセーフティチャンバーに入れ(補足図S1)、各カップに10%砂糖水パッドを提供し、8〜10日間隔日で砂糖水を交換します。
3.感染した蚊の準備
注:プロトコルのこの部分は、BSL2感染ルーム内で行われます。許可された訓練を受けたスタッフのみが、感染した蚊が収容されている感染室に入ることが許可されています。蚊は、口の吸引器が取り外されると自動的に密閉されるエントリポイントを1つだけ含む改造カップに保管されます。これらのカップは、逃げないように透明な熱可塑性容器の中に置かれます。コンテナは、両開きドアシステムの後ろの感染室にあります。感染した蚊への偶発的な曝露に対して必要なすべてのプロトコルが実施されている必要があります(補足ファイルS1)。プロトコルは国固有であり、機関の要件によって異なります。
- 感染給餌後8〜10日目に、感染した蚊を氷の上に置き、70%エタノールでラベル付けされたチューブに移してノックダウンします(各対照群と治療群の蚊を別々に保ちます)。
- 感染室を出る前に、すべての蚊が死んでいることを確認してください。
4.感染した蚊の解剖
注:プロトコルのこの部分は実験室で行われます。
- ろ紙で裏打ちされたラベルの付いたペトリ皿に蚊を移し、対照群と試験群を別々に保ちます。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の液滴を顕微鏡スライド(対照/試験群に従ってマーク)に置き、個々の蚊をろ紙からPBSに移します。
- 鉗子で7番目の 腹部セグメントを引っ張りながら、解剖針で蚊の胸部を固定することにより、固定された感染した標本から中腸を取り除きます。
- 腸が露出して見える状態で、マルピーギ尿細管(図4A、B)を探して、腸と卵巣を区別します。PBSからそれを取り出し、新しい顕微鏡スライド上の0.1%水銀クロムの液滴に移し、腸を8〜10分間染色したままにします。
- 染色後、染色した腸にカバーガラスを置き、20倍〜40倍の倍率で明視野照明下で腸を観察します(図4C、D)。
- 各対照群および治療群について、中腸当たりのオーシストの存在および数を記録します(補足ファイルS2)。
- 式 (1) を使用して送信ブロッキングアクティビティを計算します。
%未定
(1)
ここで、TBA =伝達遮断活性(オーシスト有病率の低下);p =オーシスト有病率;C =コントロール;T =治療。 - 式 (2) を使用して透過率低減活性を計算します。
%TRA =
(2)
ここで、TRA =伝達低減活性(オーシスト強度の低下);I =オーシスト強度;C =コントロール;T =治療。
注:TBAは大幅に減少しない可能性がありますが、TRAで有意差が見られる場合があり、その逆も同様です。これは、評価される化学物質によって異なります。 - ノンパラメトリック t検定(マンホイットニー)を使用して統計分析を実行します。
(1)
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Representative Results
解剖された対照標本の総数は47であり、平均89%の有病率と中腸あたり9.5のオーシストの強度でした(表1、以前に発表された22)。化合物MMV1581558の場合、サンプルサイズは合計42検体に達し、オーシスト有病率は36%、平均強度は1.5オーシストでした。これは、3つの生物学的複製すべてにわたってオーシスト有病率が58%、TRAが82%減少したことを示しています(表1)。
MMV1581558の%TRAと%TBAの両方が50%を超えていました。したがって、この化合物は、伝送遮断および低減の潜在的な候補と見なすことができます。強度と有病率の両方についての統計分析は、対照群とMMV1581558(p < 0.0001)との間に有意差を示した(表1 および 図5)。
図1:熱帯熱マラリア原虫配偶細胞を用いたハマダラカの人工感染システムの図。 略称:SMFA =標準的な膜供給アッセイ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:配偶子細胞培養の温度を調節するためにガラスフィーダーとシリコンチューブを通って水を循環させる膜供給システム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:血の食事後の完全に充血した ハマダラカ の女性。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4: ハマダラカ の雌の中腸 。 (a)マルピーギ尿細管を有する。(B)卵巣を伴う。(c) 熱帯熱マラリア原 虫オーシスト;(D)感染していない中腸。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:対照群(n=47)と化合物MMV1581558(n=42)との間のオーシスト強度の統計的要約。 エラーバー、±SE;アスタリスクは有意差を示します(ns P > 0.05、****P < 0.0001)。略称:DMSO =ジメチルスルホキシド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 化合物 | 担当者数。 | サンプルサイズ | 有病率 | 平均強度/腸 | %未定 | %TRA | p値の有病率 | p値強度 |
| コントロール | 3 | 47 | 89% | 9.5 | ||||
| MMV1581558 | 3 | 42 | 36% | 1.5 | 58% | 82% | <0.0001 | <0.0001 |
表1:標準的な膜摂食アッセイの3回の生物学的反復中に評価された抗マラリア化合物MMV1581558のデータセット。 各対照群および試験群について、サンプルサイズ(n)が、平均オーシスト有病率および中腸あたりの強度とともに示されている。透過遮断活性と伝送低減活性が示されます。略語: TBA = 送信ブロックアクティビティ。TRA = 伝送低減活性。
補足図S1:昆虫の感染室のチャンバー内に含まれる感染した蚊。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイルS1:感染した蚊への偶発的な曝露のためのプロトコル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイルS2:オーシストの有病率と強度の記録シート。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルを正常に実行するには、面倒で面倒なプロセスであっても、各ステップに注意を払う必要があります。最も重要なステップの1つは、SMFA23,24を開始する前に、配偶子細胞培養が良質であり、正しい雄:雌比の成熟配偶細胞で構成されていることを確認することです。SMFAの間、配偶子細胞培養を正しい温度に維持して、雄の配偶子が蚊に入る前に鞭毛するのを防ぐことも重要です。人工感染の成功を確立する上で重要な役割を果たす別の要因は、蚊の摂食行動も結果に大きな影響を与える可能性があるため、雌の蚊が血の食事をとることに熱心であることを確認することです25。オーシストが発達した後、完全に給餌された蚊のみが解剖されるようにするには、結果に大きな影響を与える可能性があるため、各カップからすべての給餌されていない蚊を取り除くことに集中することが重要です。中腸解剖は、さらなる分析に十分な標本が利用できるようにするためのもう1つの重要なステップです。中腸は裂ける傾向があり、中腸の内容物がにじみ出る可能性があります。このプロトコルのもう一つの重要なステップは、顕微鏡下でのオーシストの検出とカウントに不可欠な中腸の染色です。
この方法のいくつかの制限には、蚊のサンプルサイズが小さいことが含まれ、TRA推定の精度と分散に影響を与える可能性があります20,26。これは主に、SMFA中の低い給餌速度の結果です。ほとんどの蚊のコロニーは動物の血液で維持されているため、SMFAに配偶子細胞に感染したヒト血液培養を提供することは、最適ではない摂食速度に寄与する可能性があります。これは、蚊の忌避剤として作用する可能性のある特定の化合物の添加でも観察されます。オーシストをマーキュロクロムで染色することは、中腸27内の他の構造を染色するため、いくつかの欠点があります。これにより、オーシストの視認性が悪くなり、オーシストのカウントが困難になり、結果に影響を与えます28。SFMAアッセイからのものを代替アッセイと比較すると、矛盾する結果も生じる29,30。さらに、時間的制約および労働集約的な解剖などの制限は、この方法31を使用する場合のハイスループット処理を制限する。この人工感染プロセス中に蚊によって摂取された配偶子細胞の数も、場合によっては低く、オーシスト強度に影響を与える可能性があることが判明しました32,33,34。
ホタルルシフェラーゼを発現する寄生虫株が使用される生物発光アッセイを含む他の代替方法も開発されている36。後者の方法はサンプルの処理量を増加させるが、そのような寄生虫系統は、自然に起こるかまたは野生型寄生虫が関与する感染の伝播を評価するために使用できなかったので、それ自身の制限も有する37。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む他の方法も広く使用されている。これらの方法はオーシスト検出の感度を高めるが、すべてが完全に定量的であるわけではない38,39,40。TaqMan qPCRアッセイは、熱帯熱マラリア原虫オーシストを検出するための別の有望な方法であり、この方法は顕微鏡検査よりもはるかに低いレベルの寄生虫血症を定量することが判明しました41,42,43,44。ただし、このアッセイには高価な機器とプローブが必要です。さらに、化合物によるオーシスト形態の変化の可能性は、qPCR中に目に見えて検出することはできません。これらの方法と比較して、SFMA法は、この方法の制限のほとんどを比較的簡単に克服できるため、感染検出と化合物評価のための貴重なツールであり続けています。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
著者は教授に感謝したいと思います。プレトリア大学の持続可能なマラリア対策研究所生化学、遺伝学、微生物学部のリン・マリ・バークホルツとジャネット・リーダー博士が配偶子細胞培養の培養と供給を担当しました。寄生虫株は後者の部門から入手した(この出版物の一部ではない)。科学イノベーション省(DSI)および国立研究財団(NRF)。南アフリカ研究議長イニシアチブ(UID 64763からLKおよびUID 84627からLMB);NRF実践コミュニティ(UID 110666 LMBおよびLK);南アフリカ医学研究評議会の戦略的ヘルスイノベーションパートナーシップ(SHIP)も、DSIからの資金提供で認められています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine intestine/ | Butchery | ||
| Compound MMV1581558 | MMV | Pandemic response box | |
| Dissecting needles | WRIM | Custom made | |
| falcon tube | Lasec | ||
| Glass feeders | Glastechniek Peter Coelen B.V. | ||
| Graphpad Prism (8.3.0) | Graphpad | ||
| Mercurochrome | Merck (Sigma-Aldrich) | 129-16-8 | |
| Microscope slides | Merch (Sigma-Aldrich) | S8902 | |
| Parafilm | Cleansafe | ||
| PBS tablets | ThermoFisher Scientific | BP2944 | |
| Perspex biosafety cabinet | Wits University | Made by the contractors at Wits | |
| Plastic cups (350 mL) | Plastic Land |
References
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