Summary
Standardmembranmatningsanalysen (SMFA) betraktas som guldstandarden för bedömning och identifiering av potentiella malariaföreningar. Detta artificiella utfodringssystem används för att infektera myggor för att ytterligare utvärdera effekterna av sådana föreningar på intensiteten och förekomsten av parasiten Plasmodium falciparum .
Abstract
Malaria är fortfarande en av de mest förödande sjukdomarna i världen och hittills är den afrikanska regionen fortfarande ansvarig för 94% av alla fall i världen. Denna parasitiska sjukdom kräver en protozo parasit, en Anopheles myggvektor och en ryggradsdjursvärd. Anopheles-släktet omfattar mer än 500 arter, varav 60 är kända som vektorer av parasiten. Plasmodium-parasitsläktet består av 250 arter, och 48 av dessa är involverade i sjukdomsöverföring. Dessutom har parasiten Plasmodium falciparum bidragit till uppskattningsvis 99,7% av malariafallen i Afrika söder om Sahara de senaste åren.
Gametocyter utgör en del av parasitens sexuella stadium och intas av den kvinnliga myggan vid utfodring på en infekterad mänsklig värd. Ytterligare utveckling av parasiten inom myggan förbättras av gynnsamma miljöförhållanden i myggans midgut. Här sker fusionen av kvinnliga och manliga könsceller, och de rörliga ookineterna härstammar. Ookineterna kommer in i myggans midgutepitel, och mogna ookineter bildar oocyster, som i sin tur producerar rörliga sporozoiter. Dessa sporozoiter migrerar till myggans spottkörtlar och injiceras som en mygga tar en blodmjöl.
För läkemedelsupptäcktsändamål infekterades myggor artificiellt med gametocytinfekterat blod i standard membranmatningsanalysen (SMFA). För att upptäcka infektion i myggan och/eller för att bedöma effekten av malariaföreningar avlägsnades mygghonornas midguts efter infektion och färgades med merkurokrom. Denna metod användes för att förbättra den visuella detekteringen av oocyster under mikroskopet för noggrann bestämning av oocystprevalens och intensitet.
Introduction
Malaria, känd som en av de mest destruktiva sjukdomarna i världen, utgör fortfarande ett stort hot mot flera länder - särskilt de inom den afrikanska regionen - och bidrar till cirka 95% av fallen över hela världen1. Denna sjukdom orsakas av en protozoparasit och tillsammans med dess Anopheles myggvektor kan dessa synder orsaka stor skada på den mänskliga värden2. Mer specifikt är falciparum-arten av parasitsläktet Plasmodium ansvarig för uppskattningsvis 99% av malariafallen i Afrika söder om Sahara1. Utöver detta kan flera stora Anopheles myggvektorer (inklusive An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. och An. funestus Giles) klandras för mer än 95% av parasitöverföringen globalt 3,4,5,6,7,8 . För att det ideala parasitvektorsällskapet ska kunna fastställas bör myggvektorn vara mottaglig för parasiten och kunna överföra den9. Dessutom bör både vektorn och parasiten övervinna fysiska hinder för att bilda den perfekta infektionskombinationen - myggvektorn bör kunna upprätthålla parasitutveckling, och parasiten bör ha förmågan att övervinna värdens försvarsmekanismer10,11.
Gametocyter, det sexuella stadiet av parasiten P. falciparum, spelar en avgörande roll för att ansluta vektorn och parasitpartnerna12. Sexuell utveckling sker in vivo, och gametocytogenes beskriver processen för differentiering av mogna gametocyter till rörliga manliga mikrogameter och kvinnliga makrogametter13. En annan process som äger rum inom myggan är exflagellation - processen under vilken den manliga gametocyten förvandlas till könsceller och kommer ut ur de röda blodkropparna som tas upp under en blodmåltid11. Exflagellationsprocessen föreslås vidare förbättras genom en gynnsam förändring av miljön i mygganmidgut 14. Efter exflagellation bildas en zygot genom fusion av manliga och kvinnliga gameter13. Från zygoten uppstår en rörlig ookinet och rör sig från blodmjölet till epitelet i myggans midgut13. Här mognar ookinaten och en oocyst bildas, som i sin tur producerar rörliga sporozoiter13,15. Sporozoiterna migrerar sedan till myggens spottkörtlar och när myggan tar en blodmjöl från sin värd injiceras dessa sporozoiter i värdens blodomlopp15.
Malariakontrollinsatser, som kombinerar vektorkontrollstrategier och användning av effektiva läkemedel mot malaria, har blivit avgörande för att bekämpa denna sjukdom15. Med en ökning av parasit- och myggresistens ökar brådskan för identifiering av nya malariaföreningar16. Därför är in vivo-utvärderingen av transmissionsblockerande föreningar viktig16. Efter utvecklingen av sådana effektiva överföringsblockerande läkemedel har SMFA använts för att bedöma om dessa föreningar hämmar den sexuella utvecklingen av P. falciparum i Anopheles-myggan 17,18,19. Denna analys har fått erkännande sedan 1970-1980-talet som guldstandarden för utvärdering av överföringsblockering20,21. Denna analys ger ett billigare alternativ än andra analyser som RT-qPCR, vilket kräver specialutrustning. Dessutom behövs inga patienter för att utföra experimenten. Denna analys innefattar också tillhandahållande av gametocytinducerat blod till kvinnliga myggor, som sedan dissekeras för att utvärdera om oocystutveckling är närvarande21. Detta möjliggör gametocytkvantifiering och detektion av deformerade oocyster på grund av föreningarna22. För att en förening ska klassificeras som effektiv måste prevalensen (andelen myggor som har minst en oocyst i midguten) och antalet oocyster (intensitet) i myggans midgut utvärderas för att bedöma infektionshämning 17,21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se figur 1 för en illustration av protokollet. Etiskt godkännande erhölls från University of Pretoria Health Sciences Ethics Committee (506/2018) för uttag och användning av humant blod.
1. Gametocytkultur
OBS: Innan SMFA inrättades förbereddes en gametocytkultur vid University of Pretoria (se Reader et al.22 för hela protokollet).
- Förbered en gametocytkultur som består av steg V-gametocyter från parasitstammen NF54.
- Se till att kulturens gametocytomi är mellan 1,5% och 2,5%, med en 50% hematokrit i A + manligt serum, till vilket färska röda blodkroppar tillsätts.
- Separera kulturen i olika kolvar och tillsätt 2 μM av varje förening för respektive behandling 48 timmar innan SMFA utförs. Lämna kontrollgruppen obehandlad.
- Bedöm gametocytkulturen strax innan du genomför SMFA för att säkerställa exflagellation av manliga könsceller, med närvaro av ett förhållande 3: 1 mellan kvinnor och män.
2. Konstgjord infektion av myggor genom SMFA
OBS: Biosäkerhet: infekterade myggor bör inrymmas i en biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) anläggning med begränsad åtkomst.
- Använd en munsugare och placera 25 ofeda kvinnliga An. gambiae myggor i en 350 ml matningskopp. Gör samma sak för varje behandlingskopp och märk kopparna tydligt beroende på om de ska användas som kontroll- eller behandlingsgrupper. Välj antalet koppar per behandling enligt antalet tekniska replikat som ingår.
OBS: Kolonimyggor mellan 5 och 7 dagar gamla används i en typisk utvärdering av överföringsblockerande föreningar. Svältande myggor i 3-4 timmar eller längre före blodmatning underlättar upptaget av blod under SMFA. - Anslut glasmatarsystemet till vattenbadet och håll temperaturen vid 37 °C.
OBS: Glasmataren består av två armar, som är anslutna till silikonslangen som vattenbadet är anslutet till (figur 2). Matarens ihåliga struktur gör att vatten kan cirkulera genom och upprätthålla blodets temperatur. - Förbered ko-tarmen (eller syntetiskt membran) genom att skölja den i kranvatten och skär den i bitar som är monterade för varje matare. Täck varje matare och fäst membranet med ett elastiskt band.
OBS: Inget etiskt godkännande behövdes för tarmen, eftersom den köptes från ett lokalt slakteri, där den säljs till allmänheten för matlagning. - Placera infektionskopparna under matare, med membranet som ligger ovanpå koppens nät.
- Tillsätt 1 ml gametocytinfekterat blod till matare av kontrollkopparna och gametocytinfekterat blod med tillsatt förening till varje motsvarande sammansatt matare och kopp.
- Låt myggorna mata i cirka 40 minuter med matare utan lock.
OBS: Matningar sker under insektsförhållanden (25 °C, 80% relativ luftfuktighet) i mörkret. Diametern på en matare är ca 13 mm. - Efter matning, ta bort matare från kopparna, skölj matare och behandla överskott av blod med hypoklorit.
- Ta bort de ofedda myggorna från koppen genom att slå ner alla myggor på is (i 1-2 min) och separera de ofedda myggorna från de som har tagit en blodmåltid. Leta efter svullna och röda bukar (som indikerar blod) för att skilja de matade, helt uppslukade myggorna från de ofedda (Figur 3).
- Placera infektionskopparna i biosäkerhetskammaren (kompletterande figur S1) och förse varje kopp med en 10% sockervattenkudde och byt ut sockervattnet varannan dag i 8-10 dagar.
3. Beredning av infekterade myggor
OBS: Denna del av protokollet äger rum i BSL2-infektionsrummet. Endast auktoriserad, utbildad personal får komma in i infektionsrummet där smittade myggor är inhysta. Myggor förvaras i modifierade koppar som endast innehåller en ingångspunkt, som automatiskt förseglar när munsugen tas bort. Dessa koppar placeras i en transparent, termoplastisk behållare för att förhindra flykt. Behållaren är placerad i infektionsrummet bakom ett dubbeldörrsystem. Alla nödvändiga protokoll måste finnas på plats för oavsiktlig exponering för infekterade myggor (tilläggsfil S1). Protokollen är landsspecifika och beror på institutionens krav.
- På dag 8-10 efter infektionsmatning, slå ner de infekterade myggorna genom att placera dem på is och överföra dem till märkta rör med 70% etanol (håll myggorna i varje kontroll- och behandlingsgrupp åtskilda).
- Se till att alla myggor är döda innan du lämnar infektionsrummet.
4. Dissektioner av infekterade myggor
OBS: Denna del av protokollet utförs i laboratoriet.
- Överför myggorna till märkta petriskålar fodrade med filterpapper, håll kontroll- och testgrupperna åtskilda.
- Placera en droppe fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på ett mikroskopglas (märkt enligt kontroll-/testgruppen) och överför en enskild mygga från filterpapperet till PBS.
- Ta bort midguten från det immobiliserade, infekterade provet genom att fästa myggans bröstkorg med dissekeringsnålen medan du drar det 7: e buksegmentet med pincetten.
- När tarmen är exponerad och synlig, leta efter de malpighiska tubulerna (figur 4A, B) för att skilja tarmen från äggstockarna. Ta bort den från PBS, överför den till en droppe av 0,1% merkurokrom på en ny mikroskopglas och låt tarmen fläcka i 8-10 minuter.
- Efter färgning, placera en täckskiva på den färgade tarmen och visa tarmen under ljusfältbelysning med 20x-40x förstoring (figur 4C,D).
- Registrera förekomst av och antal oocyster per midgut för varje kontroll- och behandlingsgrupp (tilläggsfil S2).
- Beräkna överföringsblockeringsaktiviteten med ekvation (1):
%TBA
(1)
där TBA = överföringsblockerande aktivitet (minskning av oocystprevalensen); p = oocystprevalens; C = kontroll; och T = behandling. - Beräkna den transmissionsreducerande aktiviteten med hjälp av ekvation (2):
%TRA =
(2)
där TRA = överföringsreducerande aktivitet (minskning av oocystintensitet); I = oocystintensitet; C = kontroll; och T = behandling.
TBA kanske inte minskas avsevärt, men en signifikant skillnad kan observeras i TRA och vice versa. Detta beror på vilket kemiskt material som utvärderas. - Utför statistisk analys med hjälp av det icke-parametriska t-testet (Mann-Whitney).
(1)
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det totala antalet dissekerade kontrollprover var 47, med en genomsnittlig prevalens på 89% och en intensitet på 9,5 oocyster per midgut (tabell 1, som publicerats tidigare22). För föreningen MMV1581558 nådde provstorleken totalt 42 prover, med en 36% oocystprevalens och en genomsnittlig intensitet på 1,5 oocyster. Detta visar en minskning av oocystprevalensen med 58% och en TRA på 82% för alla tre biologiska replikat (tabell 1).
Både %TRA och %TBA för MMV1581558 var över 50%; Således kan denna förening betraktas som en potentiell kandidat för överföringsblockering och reduktion. Den statistiska analysen för både intensitet och prevalens visade en signifikant skillnad mellan kontrollgruppen och MMV1581558 (p < 0,0001) (tabell 1 och figur 5).
Figur 1: Illustration av det artificiella infektionssystemet hos Anopheles-myggor med Plasmodium falciparum-gametocyter . Förkortning: SMFA = standardmembranmatningsanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Membranmatningssystem med vatten som cirkulerar genom glasmatare och silikonrör för att reglera temperaturen på gametocytkulturen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Helt uppslukad Anopheles-kvinna efter en blodmåltid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Midgut av Anopheles hona. (A) Med malpighiska tubuler; B) med äggstockar, C) med Plasmodium falciparum oocyst, och (D) oinfekterad midgut. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Statistisk sammanfattning av oocystintensiteten mellan kontrollgruppen (n = 47) och föreningen MMV1581558 (n = 42). Felstaplar, ±SE; asterisker betecknar signifikant skillnad (ns P > 0,05, ****P < 0,0001). Förkortning: DMSO = dimetylsulfoxid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Förening | Antal reps. | Provstorlek | Av. Prevalence | Av. Intensitet/tarm | %TBA | %TRA | P-värde Prevalens | P-värde Intensitet |
| Kontroll | 3 | 47 | 89% | 9.5 | ||||
| MMV1581558 | 3 | 42 | 36% | 1.5 | 58% | 82% | <0.0001 | <0.0001 |
Tabell 1: Dataset för en malariaförening, MMV1581558, utvärderad under tre biologiska replikat av standardmembranmatningsanalysen. För varje kontroll- och testgrupp anges provstorleken (n) tillsammans med den genomsnittliga oocystprevalensen och intensiteten per midgut. Den överföringsblockerande aktiviteten och överföringsreducerande aktiviteten anges. Förkortningar: TBA = överföringsblockerande aktivitet; TRA = överföringsreducerande aktivitet.
Kompletterande figur S1: Infekterade myggor som finns i en kammare i insektsrummet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil S1: Protokoll för oavsiktlig exponering för infekterade myggor. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil S2: Registreringsblad för oocystprevalens och intensitet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att detta protokoll ska kunna utföras framgångsrikt bör uppmärksamhet ägnas åt varje steg, även om det kan vara en tråkig och mödosam process. Ett av de viktigaste stegen är att se till att gametocytkulturen är av god kvalitet och att den består av mogna gametocyter, med rätt förhållande mellan man och kvinna, innan SMFA23,24 startas. Under SMFA är det också viktigt att hålla gametocytkulturen vid rätt temperatur för att förhindra att manliga könsceller flagellerar innan de kommer in i myggan. En annan faktor som spelar en avgörande roll för att etablera en framgångsrik konstgjord infektion är att se till att de kvinnliga myggorna är angelägna om att ta en blodmåltid eftersom myggans utfodringsbeteende också i hög grad kan påverka resultatet25. För att säkerställa att endast fullmatade myggor dissekeras efter att oocysterna har utvecklats är det viktigt att fokusera på att ta bort alla ofedda myggor från varje kopp, eftersom detta i hög grad kan påverka resultaten. Midgutdissektion är ett annat viktigt steg för att säkerställa att tillräckligt med prover finns tillgängliga för vidare analys. Midguts har en tendens att riva, vilket kan få innehållet i midgut att sippra ut. Ett annat viktigt steg i detta protokoll är färgningen av midgutsna, vilket är avgörande för detektering och räkning av oocysterna under mikroskopet.
Några begränsningar av metoden inkluderar myggornas lilla provstorlek, vilket kan påverka noggrannheten och variansen för TRA-uppskattningen20,26. Detta är främst resultatet av en låg matningshastighet under SMFA. Eftersom de flesta myggkolonier upprätthålls på djurblod kan tillhandahållandet av en gametocytinfekterad mänsklig blodkultur i SMFA bidra till den suboptimala utfodringshastigheten. Detta observeras också med tillsats av vissa föreningar, som kan fungera som avstötningsmedel för myggorna. Färgning av oocyster med mercurokrom har vissa nackdelar eftersom det fläckar andra strukturer i midgut27. Detta orsakar dålig synlighet för oocysterna och gör det svårt att räkna oocyster, vilket påverkar resultaten28. Motstridiga resultat uppstår också när man jämför dem från SFMA-analysen med alternativa analyser29,30. Dessutom begränsar begränsningar som tidsbegränsningar och arbetsintensiva dissektioner bearbetning med hög genomströmning när du använder den här metoden31. Antalet gametocyter som intas av myggorna under denna konstgjorda infektionsprocess visade sig också vara lågt i vissa fall, vilket möjligen påverkade oocystintensiteten32,33,34.
Andra alternativa metoder har också utvecklats, inklusive bioluminescensanalyser, där parasitlinjer som uttrycker firefly luciferas används36. Även om den senare metoden ökar provernas genomströmning, har den också sina egna begränsningar, eftersom sådana parasitlinjer inte kunde användas för att bedöma överföringen av infektioner som uppträder naturligt eller involverar parasiter av vild typ37. Andra metoder som involverar polymeraskedjereaktion (PCR) används också i stor utsträckning. Även om dessa metoder ökar känsligheten för oocystdetektering, är inte alla helt kvantitativa38,39,40. TaqMan qPCR-analysen är en annan lovande metod för detektion av P. falciparum oocyster, och denna metod visade sig kvantifiera mycket lägre nivåer av parasitemi än mikroskopi41,42,43,44. Denna analys kräver dock dyr utrustning och sonder. Dessutom kan möjliga förändringar i oocystmorfologi på grund av föreningarna inte detekteras synligt under qPCR. Jämfört med dessa metoder är SFMA-metoden fortfarande ett värdefullt verktyg för infektionsdetektering och föreningsutvärdering eftersom de flesta av begränsningarna med denna metod är relativt lätta att övervinna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Prof. Lyn-Mari Birkholtz och Dr. Janette Reader från Institutionen för biokemi, genetik och mikrobiologi, Institute for Sustainable Malaria Control, vid University of Pretoria, för odling och leverans av gametocytkulturen. Parasitstammen erhölls från den senare avdelningen (ingår inte i denna publikation). Institutionen för vetenskap och innovation (DSI) och National Research Foundation (NRF); South African Research Chairs Initiative (UID 64763 till LK och UID 84627 till LMB); NRF Communities of Practice (UID-110666 till LMB och LK); och South African Medical Research Council Strategic Health Innovation Partnerships (SHIP) erkänns också för medel från DSI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine intestine/ | Butchery | ||
| Compound MMV1581558 | MMV | Pandemic response box | |
| Dissecting needles | WRIM | Custom made | |
| falcon tube | Lasec | ||
| Glass feeders | Glastechniek Peter Coelen B.V. | ||
| Graphpad Prism (8.3.0) | Graphpad | ||
| Mercurochrome | Merck (Sigma-Aldrich) | 129-16-8 | |
| Microscope slides | Merch (Sigma-Aldrich) | S8902 | |
| Parafilm | Cleansafe | ||
| PBS tablets | ThermoFisher Scientific | BP2944 | |
| Perspex biosafety cabinet | Wits University | Made by the contractors at Wits | |
| Plastic cups (350 mL) | Plastic Land |
References
- World Malaria Report. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240040496 (2021).
- Takken, W., Verhulst, N. O. Host preferences of blood feeding mosquitoes. Annual Review of Entomology. 58, 433-453 (2013).
- Gillies, M. T., Coetzee, M. Supplement to the Anophelinae of Africa south of the Sahara Afrotropical region. Publications of the South African Institute for Medical Research. 55, 1 (1987).
- Gillies, M. T., De Meillon, B. The Anophelinae of Africa south of the Sahara. Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, (1968).
- Antonio-Nkondjio, C., et al. Complexity of the malaria vectorial system in Cameroon: contribution of secondary vectors to malaria transmission. Journal of Medical Entomology. 43, 1215-1221 (2006).
- Sinka, M. E., et al. The dominant Anopheles vectors of human malaria in Africa, Europe and the Middle East: occurrence data, distribution maps and bionomic précis. Parasites and Vectors. 3, 117 (2010).
- Coetzee, M., Hunt, R. H., Wilkerson, R., Della Torre, A., Coulibaly, M. B., Besansky, N. J. Anopheles coluzzii and Anopheles amharicus, new members of the Anopheles gambiae complex. Zootaxa. 3619, 246-274 (2013).
- Kyalo, D., Amratia, P., Mundia, C. W., Mbogo, C. M., Coetzee, M., Snow, R. W. A geo-coded inventory of anophelines in the Afrotropical Region south of the Sahara: 1898-2016. Wellcome Open Research. 2, 57 (2017).
- Cohuet, A., Harris, C., Robert, V., Fontenille, D. Evolutionary forces on Anopheles: What makes a malaria vector. Trends in Parasitology. 309, (2009).
- Weathersby, A. B. The role of the stomach wall in the exogenous development of Plasmodium gallinaceum as studies by means of haemocoel injections of susceptible and refractory mosquitoes. The Journal of Infectious Diseases. 91, 198-205 (1952).
- Ally, A. S. I., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. I. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. The Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
- Delves, M. J., et al. Male and female Plasmodium falciparum mature gametocytes show different responses to antimalarial drugs. American Society for Microbiology Journal. , (2013).
- Sinden, R. E. Sexual development of malarial parasites in their mosquito vector. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 75, (1981).
- Garcia, G. E., Wirtz, R. A., Barr, J. R., Woolfitt, A. Xanthurenic acid induces gametogenesis in Plasmodium, the malaria parasite. Journal of Biological Chemistry. 15, 12003-12005 (1998).
- Oaks, S. C. Jr, Mitchell, V. S., Pearson, G. W., et al. Malaria: Obstacles and Opportunities. , National Academic Press. ISBN 0-309-54389-4 (1991).
- Le Manach, C., et al. Identification and profiling of a novel Diazaspirol[3.4]octane chemical series active against multiple stages of the human malaria parasite Plasmodium falciparum and optimization efforts. Journal of Medicinal Chemistry. 64, 2291-2309 (2021).
- Cibulskis, R. E., et al. Malaria: global progress 2000-2015 and future challenges. Infect Diseases of Poverty. 5, 61 (2016).
- Smith, T. A., Chitnis, N., Briet, O. J., Tanner, M. Uses of mosquito-stage transmission-blocking vaccines against Plasmodium falciparum. Trends in Parasitology. 27, 190-196 (2011).
- Boyd, M. F. Epidemiology: factors related to the definitive host. Malariology. Boyd, M. F. , W.B. Saunders. Philadelphia. 608-697 (1949).
- Ponnudurai, T., van Gemert, G. J., Bensink, T., Lensen, A. H., Meuwissen, J. H. Transmission blockade of Plasmodium falciparum: its variability with gametocyte numbers and concentration of antibody. Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine. 81, 491-493 (1987).
- Rutledge, L. C., Ward, R. A., Gould, D. J. Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder. Mosquito News. 24 (4), (1964).
- Reader, J., et al. Multistage and transmission-blocking targeted antimalarials discovered from the open-source MMV Pandemic Response Box. Nature Communications. 12, 269 (2021).
- Bousema, T., et al. Mosquito feeding assays for natural infections. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Churcher, T., et al. Measuring the blockade of malaria transmission - An analysis of the standard membrane feeding assay. International Journal for Parasitology. 42, 1037-1044 (2012).
- Medley, G. F., et al. Heterogeneity in patterns of malarial oocyst infections in the mosquito vector. Parasitology. 106, 441-449 (1993).
- Miura, K., et al. Transmission-blocking activity is determined by transmission reducing activity and number of control oocysts in Plasmodium falciparum standard membrane-feeding assay. Vaccine. 34, 4145-4151 (2016).
- Sattabongkot, J., Maneechai, N., Rosenberg, R. Plasmodium vivax: gametocyte infectivity of naturally infected Thai adults. Parasitology. 102 (01), 27-31 (1991).
- Vallejo, A. F., Garcia, J., Amado-Garavito, A. B., Arevalo-Herrera, M., Herrera, S. Plasmodium vivax gametocyte infectivity in sub-microscopic infections. Malaria Journal. 15 (1), 48 (2016).
- Ponnudurai, T., Lensen, A. H. W., van Gemert, G. J. A., Bolmer, M. G., Meuwissen, J. H. E. Feeding behavior and sporozoite ejection by infected Anopheles stephensi. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 85, 175-180 (1991).
- Miura, K., et al. Qualification of standard membrane-feeding assay with Plasmodium falciparum malaria and potential improvements for future assays. PLoS One. 8, 57909 (2013).
- Griffin, P., et al. Safety and reproducibility of a clinical trial system using induced blood stage Plasmodium vivax infection and its potential as a model to evaluate malaria transmission. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10, 0005139 (2016).
- Delves, M. J., Sinden, R. E. A semi-automated method for counting fluorescent malaria oocysts increases the throughput of transmission blocking studies. Malaria Journal. 9, 35 (2010).
- vander Kolk, M., et al. Evaluation of the standard membrane feeding assay (SMFA) for the determination of malaria transmission-reducing activity using empirical data. Parasitology. 130, 13-22 (2005).
- van der Kolk, M., de Vlas, S. J., Sauerwein, R. W. Reduction and enhancement of Plasmodium falciparum transmission by endemic human sera. International Journal for Parasitology. 36, 1091-1095 (2006).
- Singh, M., et al. Plasmodium's journey through the Anopheles mosquito: A comprehensive review. Biochimie. 181, 176-190 (2021).
- Vos, M. W., et al. A semi-automated luminescence based standard membrane feeding assay identifies novel small molecules that inhibit transmission of malaria parasites by mosquitoes. Scientific Reports. 5, 18704 (2015).
- Azevedo, R., et al. Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61, (2017).
- Okell, L. C., Bousema, T., Griffin, J. T., Ouedraogo, A. L., Ghani, A. C., Drakeley, C. J. Factors determining the occurrence of submicroscopic malaria infections and their relevance for control. Nature Communications. 3, 1237 (2012).
- Pasay, C. J., et al. Piperaquine monotherapy of drug-susceptible Plasmodium falciparum infection results in rapid clearance of parasitemia but is followed by the appearance of gametocytemia. The Journal of Infectious Diseases. 214, 105-113 (2016).
- Stone, W. J., et al. A scalable assessment of Plasmodium falciparum transmission in the standard membrane-feeding assay, using transgenic parasites expressing green fluorescent protein-luciferase. The Journal of Infectious Diseases. 210, 1456-1463 (2014).
- Hasan, A. U., et al. Implementation of a novel PCR based method for detecting malaria parasites from naturally infected mosquitoes in Papua New Guinea. Malaria Journal. 8, 182 (2009).
- Stone, W. J., et al. The relevance and applicability of oocyst prevalence as a read-out for mosquito feeding assays. Scientific Reports. 3, 3418 (2013).
- Marquart, L., Baker, M., O'Rourke, P., McCarthy, J. S. Evaluating the pharmacodynamic effect of antimalarial drugs in clinical trials by quantitative PCR. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59, 4249-4259 (2015).
- McCarthy, J. S., et al. tolerability, pharmacokinetics, and activity of the novel long-acting antimalarial DSM265: a two-part first-in-human phase 1a/1b randomised study. TheLancet Infectious Diseases. 17, 626-635 (2017).
