Summary
Standard membranfôringsanalyse (SMFA) regnes som gullstandarden for vurdering og identifisering av potensielle antimalariaforbindelser. Dette kunstige fôringssystemet brukes til å infisere mygg for ytterligere å evaluere effekten av slike forbindelser på intensiteten og utbredelsen av Plasmodium falciparum-parasitten .
Abstract
Malaria er fortsatt en av de mest ødeleggende sykdommene over hele verden, og til dags dato er den afrikanske regionen fortsatt ansvarlig for 94% av alle tilfeller over hele verden. Denne parasittiske sykdommen krever en protozoparasitt, en Anopheles myggvektor og en vertebratvert. Anopheles-slekten består av mer enn 500 arter, hvorav 60 er kjent som vektorer av parasitten. Plasmodiumparasittslekten består av 250 arter, og 48 av disse er involvert i sykdomsoverføring. Videre har parasitten Plasmodium falciparum bidratt til anslagsvis 99,7% av malariatilfellene i Afrika sør for Sahara de siste årene.
Gametocytter er en del av det seksuelle stadiet av parasitten og inntas av den kvinnelige myggen ved fôring på en infisert menneskelig vert. Videre utvikling av parasitten i mygget forbedres av gunstige miljøforhold i myggens midttarm. Her foregår fusjonen av kvinnelige og mannlige gameter, og de motile ookinetene oppstår. Ookinetene kommer inn i myggens midgutepitel, og modne ookineter danner oocyster, som igjen produserer motile sporozoitter. Disse sporozoittene migrerer til myggens spyttkjertler og injiseres som en mygg tar et blodmåltid.
For narkotikaoppdagelsesformål ble mygg kunstig infisert med gametocyttinfisert blod i standard membranfôringsanalyse (SMFA). For å påvise infeksjon i myggen og/eller for å vurdere effekten av antimalariaforbindelser, ble midttarmen til hunnmyggen fjernet etter infeksjon og farget med kvikksølvokrom. Denne metoden ble brukt til å forbedre den visuelle deteksjonen av oocyster under mikroskopet for nøyaktig bestemmelse av oocystutbredelse og intensitet.
Introduction
Malaria, kjent som en av de mest ødeleggende sykdommene over hele verden, utgjør fortsatt en stor trussel mot flere land - spesielt de i den afrikanske regionen - og bidrar til omtrent 95% av tilfellene over hele verden. Denne sykdommen er forårsaket av en protozoan parasitt, og sammen med sin Anopheles myggvektor kan disse skyldige forårsake stor skade på den menneskelige verten2. Nærmere bestemt er falciparum-artene i Plasmodium-parasitten ansvarlig for anslagsvis 99% av malariatilfellene i Afrika sør for Sahara1. I tillegg til dette kan flere store Anopheles myggvektorer (inkludert An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee &Wilkerson sp.n., og An. funestus Giles) klandres for mer enn 95% av parasittoverføring globalt 3,4,5,6,7,8 . For at det ideelle parasittvektorkammeratet skal etableres, bør myggvektoren være utsatt for parasitten og kunne overføre den9. Videre bør både vektoren og parasitten overvinne fysiske barrierer for å danne den perfekte infeksjonskombinasjonen - myggvektoren skal kunne opprettholde parasittutvikling, og parasitten skal ha evnen til å overvinne vertens forsvarsmekanismer10,11.
Gametocytter, det seksuelle stadiet av P. falciparum-parasitten, spiller en avgjørende rolle i å koble vektor- og parasittpartnerne12. Seksuell utvikling foregår in vivo, og gametocytogenese beskriver prosessen med differensiering av modne gametocytter til motile mannlige mikrogameter og kvinnelige makrogameter13. En annen prosess som foregår i myggen er eksflagellasjon - prosessen der den mannlige gametocytten forvandles til gameter og kommer fra de røde blodcellene som tas opp under et blodmåltid11. Eksflagellasjonsprosessen foreslås videre å bli forbedret av en gunstig endring i myggens miljømidgut 14. Etter eksflagellasjon dannes en zygote ved fusjon av mannlige og kvinnelige gameter13. Fra zygoten oppstår en motil ookinete og beveger seg fra blodmelet til epitelet av mygg midgut13. Her modnes ookinete, og en oocyst dannes, som igjen produserer motile sporozoitter13,15. Sporozoittene migrerer deretter til myggens spyttkjertler, og når myggen tar et blodmåltid fra verten, injiseres disse sporozoittene i vertens blodstrøm15.
Malariakontrollintervensjoner, som kombinerer vektorkontrollstrategier og bruk av effektive antimalariamidler, har blitt avgjørende for å bekjempe denne sykdommen15. Med en økning i parasitt- og myggresistens øker haster for identifisering av nye antimalariale forbindelser16. Derfor er in vivo-evalueringen av transmisjonsblokkerende forbindelser viktig16. Etter utviklingen av slike effektive overføringsblokkerende legemidler har SMFA blitt brukt til å vurdere om disse forbindelsene hemmer den seksuelle utviklingen av P. falciparum i Anopheles-myggen 17,18,19. Denne analysen har fått anerkjennelse siden 1970-1980-tallet som gullstandarden for evaluering av overføringsblokkering20,21. Denne analysen gir et billigere alternativ enn andre analyser som RT-qPCR, som krever spesialutstyr. Videre er det ikke nødvendig med pasienter for å utføre forsøkene. Denne analysen innebærer også tilførsel av gametocytt-indusert blod til kvinnelige mygg, som deretter dissekeres for å vurdere om oocystutvikling er tilstede21. Dette muliggjør kvantifisering av gametocytter og påvisning av deformerte oocytter på grunn av forbindelsene22. For at en forbindelse skal klassifiseres som effektiv, må prevalensen (andelen mygg som har minst en oocyst i midttarmen) og antall oocyster (intensitet) i myggen midttarmen evalueres for å vurdere infeksjonshemming 17,21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se figur 1 for en illustrasjon av protokollen. Etisk klarering ble innhentet fra University of Pretoria Health Sciences Ethics Committee (506/2018) for tilbaketrekking og bruk av humant blod.
1. Gametocytkultur
MERK: Før etableringen av SMFA ble det utarbeidet en gametocytkultur ved Universitetet i Pretoria (se Reader et al.22 for hele protokollen).
- Forbered en gametocytkultur som består av stadium V gametocytter fra NF54 parasittstammen.
- Sørg for at gametocytomien i kulturen er mellom 1,5% og 2,5%, med en 50% hematokrit i A + mannlig serum, som friske røde blodlegemer tilsettes.
- Skill kulturen i forskjellige kolber og tilsett 2 μM av hver forbindelse for hver respektive behandling 48 timer før du utfører SMFA. La kontrollgruppen være ubehandlet.
- Vurder gametocytkulturen kort før du gjennomfører SMFA for å sikre eksflagellasjon av mannlige kjønnsceller, med tilstedeværelse av et 3: 1 kvinnelig: mannlig forhold.
2. Kunstig infeksjon av mygg gjennom SMFA
MERK: Biosikkerhet: infiserte mygg bør plasseres i et biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) anlegg med begrenset tilgang.
- Bruk en munnaspirator til å plassere 25 ufødte hunner An. gambiae mygg i en 350 ml fôringskopp. Gjør det samme for hver behandlingskopp og merk koppene tydelig etter om de skal brukes som kontroll- eller behandlingsgrupper. Velg antall kopper per behandling i henhold til antall tekniske kopier inkludert.
MERK: Kolonimygg mellom 5 og 7 dager gammel brukes i en typisk transmisjonsblokkerende sammensatt evaluering. Sultende mygg i 3-4 timer eller lenger før blodfôring vil lette opptaket av blod under SMFA. - Koble glassmatersystemet til vannbadet og hold temperaturen på 37 °C.
MERK: Glassmateren består av to armer, som er koblet til silikonslangen som vannbadet er koblet til (figur 2). Materens hule struktur gjør at vann kan sirkulere gjennom og opprettholde blodets temperatur. - Forbered kutarmen (eller syntetisk membran) ved å skylle den i vann fra springen og kutt den i stykker som er montert for hver mater. Dekk hver mater og fest membranen med et elastisk bånd.
MERK: Ingen etisk klarering var nødvendig for tarmen, da den ble kjøpt fra et lokalt slakteri, hvor det selges til publikum for matlaging. - Plasser infeksjonskoppene under matere, med membranen liggende på toppen av koppens nett.
- Tilsett 1 ml gametocyttinfisert blod til matere av kontrollkoppene og gametocyttinfisert blod med tilsatt forbindelse til hver tilsvarende sammensatt mater og kopp.
- La myggen mate i ca 40 minutter med matere avdekket.
MERK: Fôring skjer under insektforhold (25 °C, 80 % relativ fuktighet) i mørket. Diameteren på en mater er ca. 13 mm. - Etter fôring, fjern matere fra koppene, skyll matere og behandle overflødig blod med hypokloritt.
- Fjern de ufødte myggene fra koppen ved å slå alle myggene ned på isen (i 1-2 min) og skille de ufødte myggene fra de som har tatt et blodmåltid. Se etter hovne og røde underliv (som indikerer blod) for å skille de matede, fullt oppslukte myggene fra de ufødte (figur 3).
- Plasser infeksjonskoppene i biosikkerhetskammeret (tilleggsfigur S1) og gi hver kopp en 10% sukkervannpute, og erstatt sukkervannet på alternative dager i 8-10 dager.
3. Forberedelse av infiserte mygg
MERK: Denne delen av protokollen foregår i BSL2-infeksjonsrommet. Kun autorisert, opplært personale har lov til å gå inn i smitterommet der infiserte mygg er plassert. Mygg holdes i modifiserte kopper som bare inneholder ett inngangspunkt, som automatisk forsegler når munnsugeren fjernes. Disse koppene er plassert inne i en gjennomsiktig, termoplastisk beholder for å forhindre rømning. Beholderen er plassert i infeksjonsrommet bak et dobbeltdørssystem. Alle nødvendige protokoller må være på plass for utilsiktet eksponering for infiserte mygg (tilleggsfil S1). Protokollene er landsspesifikke og avhenger av institusjonens krav.
- På dagene 8-10 etter infeksjonsfôring, slå de infiserte myggene ned ved å plassere dem på is og overføre dem til merkede rør med 70% etanol (holde myggene til hver kontroll- og behandlingsgruppe atskilt).
- Sørg for at alle myggene er døde før du forlater smitterommet.
4. Disseksjoner av infiserte mygg
MERK: Denne delen av protokollen utføres i laboratoriet.
- Overfør myggene til merkede petriskåler foret med filterpapir, og hold kontroll- og testgruppene atskilt.
- Plasser en dråpe fosfatbufret saltvann (PBS) på et mikroskopglass (merket i henhold til kontroll- / testgruppen) og overfør en individuell mygg fra filterpapiret til PBS.
- Fjern midttarmen fra den immobiliserte, infiserte prøven ved å feste myggens thorax med dissekeringsnålen mens du trekker det 7.buksegmentet med tangen.
- Når tarmen er eksponert og synlig, se etter malpighiske tubuli (figur 4A, B) for å skille tarmen fra eggstokkene. Fjern den fra PBS, overfør den til en dråpe på 0,1% merkurokrom på et nytt mikroskopglass, og la tarmen flekke i 8-10 minutter.
- Etter farging, legg en coverslip på den flekkete tarmen og se tarmen under brightfield-belysning ved 20x-40x forstørrelse (figur 4C, D).
- Registrer tilstedeværelsen av og antall oocytter per midttarm for hver kontroll- og behandlingsgruppe (tilleggsfil S2).
- Beregn overføringsblokkerende aktivitet ved hjelp av ligning (1):
%TBA
(1)
hvor TBA = transmisjonsblokkerende aktivitet (reduksjon i oocystprevalens); p = oocystprevalens; C = kontroll; og T = behandling. - Beregn transmisjonsreduserende aktivitet ved hjelp av ligning (2):
%TRA =
(2)
hvor TRA = transmisjonsreduserende aktivitet (reduksjon i oocystintensitet); I = oocyst intensitet; C = kontroll; og T = behandling.
MERK: TBA kan ikke reduseres betydelig, men en signifikant forskjell kan observeres i TRA og omvendt. Dette er avhengig av det kjemiske materialet som vurderes. - Utfør statistisk analyse ved hjelp av ikke-parametrisk t-test (Mann-Whitney).
(1)
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt antall kontrollerte prøver dissekert var 47, med en gjennomsnittlig til 89 % prevalens og en intensitet på 9,5 oocyster per midttarm (tabell 1, som publisert tidligere22). For MMV1581558 nådde prøvestørrelsen totalt 42 prøver, med en prevalens på 36 % oocyst og en gjennomsnittlig intensitet på 1,5 oocytter. Dette viser en reduksjon i oocystprevalens på 58 % og en TRA på 82 % på tvers av alle tre biologiske replikasjoner (tabell 1).
Både %TRA og %TBA for MMV1581558 var over 50%; Dermed kan denne forbindelsen betraktes som en potensiell kandidat for overføringsblokkering og reduksjon. Den statistiske analysen for både intensitet og prevalens viste en signifikant forskjell mellom kontrollgruppen og MMV1581558 (p < 0,0001) (tabell 1 og figur 5).
Figur 1: Illustrasjon av det kunstige infeksjonssystemet til Anopheles mygg med Plasmodium falciparum gametocytter. Forkortelse: SMFA = standard membranfôringsanalyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Membranfôringssystem med vann som sirkulerer gjennom glassmatere og silikonrør for å regulere temperaturen i gametocytkulturen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fullt engorged Anopheles kvinne etter et blodmåltid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Midgut av Anopheles kvinne. (A) Med malpighiske tubuli; (B) med eggstokkene; (C) med Plasmodium falciparum oocyst; og (D) uinfisert midttarm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Statistisk sammendrag av oocystintensitet mellom kontrollgruppen (n = 47) og forbindelsen MMV1581558 (n = 42). Feilfelt, ±SE; stjerner betegner signifikant forskjell (ns P > 0,05, ****P < 0,0001). Forkortelse: DMSO = dimetylsulfoksid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Sammensatt | Antall representanter. | Størrelse på utvalg | Av. Utbredelse | Av. Intensitet/tarm | %TBA | %TRA | P-verdi Prevalens | P-verdi intensitet |
| Kontroll | 3 | 47 | 89% | 9.5 | ||||
| MMV1581558 | 3 | 42 | 36% | 1.5 | 58% | 82% | <0.0001 | <0.0001 |
Tabell 1: Datasett av en antimalariamiddelforbindelse, MMV1581558, evaluert under tre biologiske replikasjoner av standard membranfôringsanalyse. For hver kontroll- og testgruppe er utvalgsstørrelsen (n) indikert, sammen med gjennomsnittlig oocystprevalens og intensitet per midttarm. Overføringsblokkerende aktivitet og overføringsreduserende aktivitet er indikert. Forkortelser: TBA = overføringsblokkerende aktivitet; TRA = transmisjonsreduserende aktivitet.
Supplerende figur S1: Infiserte mygg inneholdt i et kammer i insektets infeksjonsrom. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil S1: Protokoll for utilsiktet eksponering for infiserte mygg. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil S2: Opptaksark for oocystutbredelse og intensitet. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at denne protokollen skal utføres vellykket, bør det tas hensyn til hvert trinn, selv om det kan være en kjedelig og arbeidskrevende prosess. Et av de viktigste trinnene er å sikre at gametocytkulturen er av god kvalitet og at den består av modne gametocytter, med riktig mann:kvinne-forhold, før man starter SMFA23,24. Under SMFA er det også avgjørende å opprettholde gametocytkulturen ved riktig temperatur for å forhindre at mannlige kjønnsceller eksflagellerer før de går inn i myggen. En annen faktor som spiller en avgjørende rolle i å etablere en vellykket kunstig infeksjon er å sikre at de kvinnelige myggene er opptatt av å ta et blodmåltid, da myggens fôringsadferd også i stor grad kan påvirke utfallet25. For å sikre at bare fullt matet mygg blir dissekert etter at oocystene har utviklet seg, er det viktig å fokusere på å fjerne alle ufødte mygg fra hver kopp, da dette i stor grad kan påvirke resultatene. Midgut disseksjon er et annet viktig skritt for å sikre at nok prøver er tilgjengelige for videre analyse. Midguts har en tendens til å rive, noe som kan føre til at innholdet i midttarmen siver ut. Et annet viktig skritt i denne protokollen er farging av midguts, noe som er avgjørende for påvisning og telling av oocystene under mikroskopet.
Noen begrensninger ved metoden inkluderer myggens lille prøvestørrelse, noe som kan påvirke nøyaktigheten og variansen til TRA-estimering20,26. Dette er for det meste et resultat av en lav fôringshastighet under SMFA. Siden de fleste myggkolonier opprettholdes på dyreblod, kan tilveiebringelse av en gametocyttinfisert human blodkultur i SMFA bidra til den suboptimale fôringshastigheten. Dette observeres også ved tilsetning av visse forbindelser, som kan fungere som repellanter for myggene. Farging av oocyster med merkurokrom har noen ulemper da det flekker andre strukturer i midgut27. Dette fører til dårlig sikt av oocystene og gjør telling av oocyster utfordrende, noe som påvirker resultatene28. Motstridende resultater oppstår også når man sammenligner de fra SFMA-analysen med alternative analyser29,30. Videre begrenser begrensninger som tidsbegrensninger og arbeidsintensive disseksjoner behandling med høy gjennomstrømning ved bruk av denne metoden31. Antall gametocytter inntatt av myggene under denne kunstige infeksjonsprosessen ble også funnet å være lavt i noen tilfeller, muligens påvirker oocystintensiteten32,33,34.
Andre alternative metoder har også blitt utviklet, inkludert bioluminescensanalyser, hvor parasittlinjer som uttrykker firefly luciferase brukes36. Selv om sistnevnte metode øker gjennomstrømningen av prøver, har den også sine egne restriksjoner, siden slike parasittlinjer ikke kunne brukes til å vurdere overføring av infeksjoner som forekommer naturlig eller involverer villtype parasitter37. Andre metoder som involverer polymerasekjedereaksjon (PCR) er også mye brukt. Selv om disse metodene øker følsomheten til oocystdeteksjon, er ikke alle fullt kvantitative38,39,40. TaqMan qPCR-analysen er en annen lovende metode for påvisning av P. falciparum-oocyster, og denne metoden ble funnet å kvantifisere mye lavere nivåer av parasittemi enn mikroskopi41,42,43,44. Denne analysen krever imidlertid dyrt utstyr og sonder. Videre kan mulige endringer i oocystmorfologi på grunn av forbindelsene ikke synlig oppdages under qPCR. Sammenlignet med disse metodene er SFMA-metoden fortsatt et verdifullt verktøy for infeksjonsdeteksjon og sammensatt evaluering, da de fleste begrensningene i denne metoden er relativt enkle å overvinne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenneProf. Lyn-Mari Birkholtz og Dr. Janette Reader fra Institutt for biokjemi, genetikk og mikrobiologi, Institutt for bærekraftig malariakontroll, ved Universitetet i Pretoria, for dyrking og forsyning av gametocytkulturen. Parasittstammen ble hentet fra sistnevnte avdeling (ikke en del av denne publikasjonen). Institutt for naturvitenskap og innovasjon (DSI) og National Research Foundation (NRF); South African Research Chairs Initiative (UID 64763 til LK og UID 84627 til LMB); NRF Communities of Practice (UID 110666 til LMB og LK); og South African Medical Research Council Strategic Health Innovation Partnerships (SHIP) er også anerkjent for midler fra DSI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine intestine/ | Butchery | ||
| Compound MMV1581558 | MMV | Pandemic response box | |
| Dissecting needles | WRIM | Custom made | |
| falcon tube | Lasec | ||
| Glass feeders | Glastechniek Peter Coelen B.V. | ||
| Graphpad Prism (8.3.0) | Graphpad | ||
| Mercurochrome | Merck (Sigma-Aldrich) | 129-16-8 | |
| Microscope slides | Merch (Sigma-Aldrich) | S8902 | |
| Parafilm | Cleansafe | ||
| PBS tablets | ThermoFisher Scientific | BP2944 | |
| Perspex biosafety cabinet | Wits University | Made by the contractors at Wits | |
| Plastic cups (350 mL) | Plastic Land |
References
- World Malaria Report. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240040496 (2021).
- Takken, W., Verhulst, N. O. Host preferences of blood feeding mosquitoes. Annual Review of Entomology. 58, 433-453 (2013).
- Gillies, M. T., Coetzee, M. Supplement to the Anophelinae of Africa south of the Sahara Afrotropical region. Publications of the South African Institute for Medical Research. 55, 1 (1987).
- Gillies, M. T., De Meillon, B. The Anophelinae of Africa south of the Sahara. Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, (1968).
- Antonio-Nkondjio, C., et al. Complexity of the malaria vectorial system in Cameroon: contribution of secondary vectors to malaria transmission. Journal of Medical Entomology. 43, 1215-1221 (2006).
- Sinka, M. E., et al. The dominant Anopheles vectors of human malaria in Africa, Europe and the Middle East: occurrence data, distribution maps and bionomic précis. Parasites and Vectors. 3, 117 (2010).
- Coetzee, M., Hunt, R. H., Wilkerson, R., Della Torre, A., Coulibaly, M. B., Besansky, N. J. Anopheles coluzzii and Anopheles amharicus, new members of the Anopheles gambiae complex. Zootaxa. 3619, 246-274 (2013).
- Kyalo, D., Amratia, P., Mundia, C. W., Mbogo, C. M., Coetzee, M., Snow, R. W. A geo-coded inventory of anophelines in the Afrotropical Region south of the Sahara: 1898-2016. Wellcome Open Research. 2, 57 (2017).
- Cohuet, A., Harris, C., Robert, V., Fontenille, D. Evolutionary forces on Anopheles: What makes a malaria vector. Trends in Parasitology. 309, (2009).
- Weathersby, A. B. The role of the stomach wall in the exogenous development of Plasmodium gallinaceum as studies by means of haemocoel injections of susceptible and refractory mosquitoes. The Journal of Infectious Diseases. 91, 198-205 (1952).
- Ally, A. S. I., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. I. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. The Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
- Delves, M. J., et al. Male and female Plasmodium falciparum mature gametocytes show different responses to antimalarial drugs. American Society for Microbiology Journal. , (2013).
- Sinden, R. E. Sexual development of malarial parasites in their mosquito vector. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 75, (1981).
- Garcia, G. E., Wirtz, R. A., Barr, J. R., Woolfitt, A. Xanthurenic acid induces gametogenesis in Plasmodium, the malaria parasite. Journal of Biological Chemistry. 15, 12003-12005 (1998).
- Oaks, S. C. Jr, Mitchell, V. S., Pearson, G. W., et al. Malaria: Obstacles and Opportunities. , National Academic Press. ISBN 0-309-54389-4 (1991).
- Le Manach, C., et al. Identification and profiling of a novel Diazaspirol[3.4]octane chemical series active against multiple stages of the human malaria parasite Plasmodium falciparum and optimization efforts. Journal of Medicinal Chemistry. 64, 2291-2309 (2021).
- Cibulskis, R. E., et al. Malaria: global progress 2000-2015 and future challenges. Infect Diseases of Poverty. 5, 61 (2016).
- Smith, T. A., Chitnis, N., Briet, O. J., Tanner, M. Uses of mosquito-stage transmission-blocking vaccines against Plasmodium falciparum. Trends in Parasitology. 27, 190-196 (2011).
- Boyd, M. F. Epidemiology: factors related to the definitive host. Malariology. Boyd, M. F. , W.B. Saunders. Philadelphia. 608-697 (1949).
- Ponnudurai, T., van Gemert, G. J., Bensink, T., Lensen, A. H., Meuwissen, J. H. Transmission blockade of Plasmodium falciparum: its variability with gametocyte numbers and concentration of antibody. Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine. 81, 491-493 (1987).
- Rutledge, L. C., Ward, R. A., Gould, D. J. Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder. Mosquito News. 24 (4), (1964).
- Reader, J., et al. Multistage and transmission-blocking targeted antimalarials discovered from the open-source MMV Pandemic Response Box. Nature Communications. 12, 269 (2021).
- Bousema, T., et al. Mosquito feeding assays for natural infections. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Churcher, T., et al. Measuring the blockade of malaria transmission - An analysis of the standard membrane feeding assay. International Journal for Parasitology. 42, 1037-1044 (2012).
- Medley, G. F., et al. Heterogeneity in patterns of malarial oocyst infections in the mosquito vector. Parasitology. 106, 441-449 (1993).
- Miura, K., et al. Transmission-blocking activity is determined by transmission reducing activity and number of control oocysts in Plasmodium falciparum standard membrane-feeding assay. Vaccine. 34, 4145-4151 (2016).
- Sattabongkot, J., Maneechai, N., Rosenberg, R. Plasmodium vivax: gametocyte infectivity of naturally infected Thai adults. Parasitology. 102 (01), 27-31 (1991).
- Vallejo, A. F., Garcia, J., Amado-Garavito, A. B., Arevalo-Herrera, M., Herrera, S. Plasmodium vivax gametocyte infectivity in sub-microscopic infections. Malaria Journal. 15 (1), 48 (2016).
- Ponnudurai, T., Lensen, A. H. W., van Gemert, G. J. A., Bolmer, M. G., Meuwissen, J. H. E. Feeding behavior and sporozoite ejection by infected Anopheles stephensi. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 85, 175-180 (1991).
- Miura, K., et al. Qualification of standard membrane-feeding assay with Plasmodium falciparum malaria and potential improvements for future assays. PLoS One. 8, 57909 (2013).
- Griffin, P., et al. Safety and reproducibility of a clinical trial system using induced blood stage Plasmodium vivax infection and its potential as a model to evaluate malaria transmission. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10, 0005139 (2016).
- Delves, M. J., Sinden, R. E. A semi-automated method for counting fluorescent malaria oocysts increases the throughput of transmission blocking studies. Malaria Journal. 9, 35 (2010).
- vander Kolk, M., et al. Evaluation of the standard membrane feeding assay (SMFA) for the determination of malaria transmission-reducing activity using empirical data. Parasitology. 130, 13-22 (2005).
- van der Kolk, M., de Vlas, S. J., Sauerwein, R. W. Reduction and enhancement of Plasmodium falciparum transmission by endemic human sera. International Journal for Parasitology. 36, 1091-1095 (2006).
- Singh, M., et al. Plasmodium's journey through the Anopheles mosquito: A comprehensive review. Biochimie. 181, 176-190 (2021).
- Vos, M. W., et al. A semi-automated luminescence based standard membrane feeding assay identifies novel small molecules that inhibit transmission of malaria parasites by mosquitoes. Scientific Reports. 5, 18704 (2015).
- Azevedo, R., et al. Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61, (2017).
- Okell, L. C., Bousema, T., Griffin, J. T., Ouedraogo, A. L., Ghani, A. C., Drakeley, C. J. Factors determining the occurrence of submicroscopic malaria infections and their relevance for control. Nature Communications. 3, 1237 (2012).
- Pasay, C. J., et al. Piperaquine monotherapy of drug-susceptible Plasmodium falciparum infection results in rapid clearance of parasitemia but is followed by the appearance of gametocytemia. The Journal of Infectious Diseases. 214, 105-113 (2016).
- Stone, W. J., et al. A scalable assessment of Plasmodium falciparum transmission in the standard membrane-feeding assay, using transgenic parasites expressing green fluorescent protein-luciferase. The Journal of Infectious Diseases. 210, 1456-1463 (2014).
- Hasan, A. U., et al. Implementation of a novel PCR based method for detecting malaria parasites from naturally infected mosquitoes in Papua New Guinea. Malaria Journal. 8, 182 (2009).
- Stone, W. J., et al. The relevance and applicability of oocyst prevalence as a read-out for mosquito feeding assays. Scientific Reports. 3, 3418 (2013).
- Marquart, L., Baker, M., O'Rourke, P., McCarthy, J. S. Evaluating the pharmacodynamic effect of antimalarial drugs in clinical trials by quantitative PCR. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59, 4249-4259 (2015).
- McCarthy, J. S., et al. tolerability, pharmacokinetics, and activity of the novel long-acting antimalarial DSM265: a two-part first-in-human phase 1a/1b randomised study. TheLancet Infectious Diseases. 17, 626-635 (2017).
