Summary
Il test standard di alimentazione a membrana (SMFA) è considerato il gold standard per la valutazione e l'identificazione di potenziali composti antimalarici. Questo sistema di alimentazione artificiale viene utilizzato per infettare le zanzare per valutare ulteriormente gli effetti di tali composti sull'intensità e la prevalenza del parassita Plasmodium falciparum .
Abstract
La malaria rimane una delle malattie più devastanti in tutto il mondo e, ad oggi, la regione africana è ancora responsabile del 94% di tutti i casi in tutto il mondo. Questa malattia parassitaria richiede un parassita protozoo, un vettore di zanzara Anopheles e un ospite vertebrato. Il genere Anopheles comprende più di 500 specie, di cui 60 sono conosciute come vettori del parassita. Il genere Plasmodium parasite comprende 250 specie e 48 di queste sono coinvolte nella trasmissione della malattia. Inoltre, il parassita Plasmodium falciparum ha contribuito a circa il 99,7% dei casi di malaria nell'Africa sub-sahariana negli ultimi anni.
I gametociti fanno parte dello stadio sessuale del parassita e vengono ingeriti dalla zanzara femmina dopo essersi nutriti di un ospite umano infetto. L'ulteriore sviluppo del parassita all'interno della zanzara è migliorato da condizioni ambientali favorevoli nel midgut della zanzara. Qui avviene la fusione dei gameti femminili e maschili e hanno origine gli oocineti mobili. Gli oocineti entrano nell'epitelio intestinale medio della zanzara e gli oocinesiti maturi formano oocisti, che a loro volta producono sporozoiti mobili. Questi sporozoiti migrano verso le ghiandole salivari della zanzara e vengono iniettati come una zanzara prende un pasto di sangue.
Ai fini della scoperta di farmaci, le zanzare sono state infettate artificialmente con sangue infetto da gametociti nel test standard di alimentazione a membrana (SMFA). Per rilevare l'infezione all'interno della zanzara e / o per valutare l'efficacia dei composti antimalarici, le viscere intermedie delle zanzare femmine sono state rimosse dopo l'infezione e sono state colorate con mercurocromo. Questo metodo è stato utilizzato per migliorare la rilevazione visiva delle oocisti al microscopio per la determinazione accurata della prevalenza e dell'intensità delle oocisti.
Introduction
La malaria, conosciuta come una delle malattie più distruttive in tutto il mondo, rappresenta ancora una grande minaccia per diversi paesi, specialmente quelli all'interno della regione africana, e contribuisce a circa il 95% dei casi in tutto il mondo1. Questa malattia è causata da un parassita protozoo e, insieme al suo vettore di zanzara Anopheles, questi colpevoli possono causare gravi danni all'ospite umano2. Più specificamente, la specie falciparum del genere parassita Plasmodium è responsabile di circa il 99% dei casi di malaria nell'Africa sub-sahariana1. Oltre a questo, diversi importanti vettori di zanzare Anopheles (tra cui An. gambiae Giles, An. arabiensis Patton, An. coluzzii Coetzee & Wilkerson sp.n. e An. funestus Giles) potrebbero essere accusati di oltre il 95% della trasmissione dei parassiti a livello globale 3,4,5,6,7,8 . Affinché sia stabilita la compagnia ideale parassita-vettore, il vettore di zanzara dovrebbe essere suscettibile al parassita ed essere in grado di trasmetterlo9. Inoltre, sia il vettore che il parassita dovrebbero superare le barriere fisiche per formare la perfetta combinazione infettiva: il vettore di zanzara dovrebbe essere in grado di sostenere lo sviluppo del parassita e il parassita dovrebbe avere la capacità di superare i meccanismi di difesa dell'ospite10,11.
I gametociti, lo stadio sessuale del parassita P. falciparum, svolgono un ruolo cruciale nel collegare il vettore e i partner del parassita12. Lo sviluppo sessuale avviene in vivo e la gametocitogenesi descrive il processo di differenziazione dei gametociti maturi in microgameti maschili mobili e macrogameti femminili13. Un altro processo che avviene all'interno della zanzara è l'esflagellazione, il processo durante il quale il gametocita maschile si trasforma in gameti ed emerge dai globuli rossi assorbiti durante un pasto di sangue11. Il processo di esflagellazione è ulteriormente suggerito per essere migliorato da un cambiamento favorevole nell'ambiente della zanzara midgut14. Dopo l'esflagellazione, uno zigote è formato dalla fusione dei gameti maschili e femminili13. Dallo zigote, un ookinete mobile sorge e si sposta dal pasto di sangue all'epitelio della zanzara midgut13. Qui matura l'ookinete e si forma una oocisti che, a sua volta, produce sporozoiti mobili13,15. Gli sporozoiti migrano quindi verso le ghiandole salivari della zanzara e, mentre la zanzara prende un pasto di sangue dal suo ospite, questi sporozoiti vengono iniettati nel flusso sanguigno dell'ospite15.
Gli interventi di controllo della malaria, che combinano strategie di controllo dei vettori e l'uso di farmaci antimalarici efficaci, sono diventati cruciali nella lotta contro questa malattia15. Con l'aumento della resistenza ai parassiti e alle zanzare, l'urgenza per l'identificazione di nuovi composti antimalarici sta aumentando16. Pertanto, la valutazione in vivo dei composti che bloccano la trasmissione è importante16. Dopo lo sviluppo di tali efficaci farmaci che bloccano la trasmissione, l'SMFA è stato utilizzato per valutare se questi composti inibiscono lo sviluppo sessuale di P. falciparum nella zanzara Anopheles 17,18,19. Questo test ha ottenuto il riconoscimento dal 1970-1980 come il gold standard per valutare il blocco della trasmissione20,21. Questo test fornisce un'alternativa più economica rispetto ad altri test come RT-qPCR, che richiede attrezzature specializzate. Inoltre, non sono necessari pazienti per eseguire gli esperimenti. Questo test prevede anche la fornitura di sangue indotto da gametociti alle zanzare femmine, che vengono poi sezionate per valutare se lo sviluppo di oocisti è presente21. Ciò consente la quantificazione dei gametociti e l'individuazione di oocisti deformate a causa dei composti22. Affinché un composto sia classificato come efficace, la prevalenza (la proporzione di zanzare che ospitano almeno una oocisti nel midgut) e il numero di oocisti (intensità) nel midgut della zanzara devono essere valutati per valutare l'inibizione dell'infezione 17,21,22.
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Protocol
Fare riferimento alla Figura 1 per un'illustrazione del protocollo. L'autorizzazione etica è stata ottenuta dal Comitato etico delle scienze della salute dell'Università di Pretoria (506/2018) per il ritiro e l'uso del sangue umano.
1. Cultura dei gametociti
NOTA: Prima di impostare l'SMFA, è stata preparata una coltura di gametociti presso l'Università di Pretoria (vedi Reader et al.22 per il protocollo completo).
- Preparare una coltura di gametociti costituita da gametociti allo stadio V del ceppo parassita NF54.
- Assicurarsi che la gametocitemia della coltura sia compresa tra l'1,5% e il 2,5%, con un ematocrito del 50% nel siero maschile A +, a cui vengono aggiunti globuli rossi freschi.
- Separare la coltura in diversi palloni e aggiungere 2 μM di ciascun composto per ciascun rispettivo trattamento 48 ore prima di condurre l'SMFA. Lasciare il gruppo di controllo non trattato.
- Valutare la coltura dei gametociti poco prima di condurre la SMFA per garantire l'esflagellazione dei gameti maschili, con la presenza di un rapporto femmina:maschio di 3:1.
2. Infezione artificiale delle zanzare attraverso la SMFA
NOTA: Biosicurezza: le zanzare infette devono essere ospitate in una struttura di livello di biosicurezza 2 (BSL2) con accesso limitato.
- Utilizzando un aspiratore a bocca, posizionare 25 zanzare An. gambiae femmine non alimentate in una tazza da 350 ml. Fare lo stesso per ogni tazza di trattamento ed etichettare chiaramente le coppette a seconda che debbano essere utilizzate come gruppi di controllo o di trattamento. Scegli il numero di tazze per trattamento in base al numero di repliche tecniche incluse.
NOTA: Le zanzare colonia tra 5 e 7 giorni sono utilizzate in una tipica valutazione dei composti che bloccano la trasmissione. Zanzare affamate per 3-4 ore o più prima dell'alimentazione del sangue faciliterà l'assorbimento di sangue durante SMFA. - Collegare il sistema di alimentazione del vetro al bagno d'acqua e mantenere la temperatura a 37 °C.
NOTA: L'alimentatore di vetro è costituito da due bracci, che sono collegati al tubo di silicone a cui è collegato il bagno d'acqua (Figura 2). La struttura cava dell'alimentatore consente all'acqua di circolare attraverso e mantenere la temperatura del sangue. - Preparare l'intestino di mucca (o membrana sintetica) sciacquandolo con acqua di rubinetto e tagliarlo in pezzi che sono montati per ogni alimentatore. Coprire ogni alimentatore e fissare la membrana con un elastico.
NOTA: Non è stata necessaria alcuna autorizzazione etica per l'intestino, poiché è stato acquistato da una macelleria locale, dove viene venduto al pubblico per la preparazione del cibo. - Posizionare le coppette di infezione sotto gli alimentatori, con la membrana che si trova sopra la rete della tazza.
- Aggiungere 1 ml di sangue infetto da gametociti agli alimentatori delle coppette di controllo e sangue infetto da gametociti con composto aggiunto a ciascun alimentatore e tazza composti corrispondenti.
- Lasciare le zanzare a nutrirsi per circa 40 minuti con gli alimentatori scoperti.
NOTA: Le poppate avvengono in condizioni insettarie (25 °C, 80% di umidità relativa) al buio. Il diametro di un alimentatore è di circa 13 mm. - Dopo l'alimentazione, rimuovere gli alimentatori dalle tazze, sciacquare gli alimentatori e trattare il sangue in eccesso con ipoclorito.
- Rimuovere le zanzare non alimentate dalla tazza abbattendo tutte le zanzare sul ghiaccio (per 1-2 minuti) e separando le zanzare non alimentate da quelle che hanno preso un pasto di sangue. Cerca addomi gonfi e rossi (che indicano sangue) per distinguere le zanzare nutrite e completamente ingorgate da quelle non nutrite (Figura 3).
- Posizionare le coppette di infezione nella camera di biosicurezza (Figura supplementare S1) e fornire a ciascuna tazza un tampone di acqua zuccherata al 10%, sostituendo l'acqua zuccherata a giorni alterni per 8-10 giorni.
3. Preparazione di zanzare infette
NOTA: Questa parte del protocollo si svolge all'interno della stanza di infezione BSL2. Solo il personale autorizzato e addestrato è autorizzato ad entrare nella stanza delle infezioni dove sono ospitate le zanzare infette. Le zanzare sono conservate in tazze modificate che contengono un solo punto di ingresso, che sigilla automaticamente quando l'aspiratore della bocca viene rimosso. Queste tazze sono collocate all'interno di un contenitore termoplastico trasparente per impedire la fuga. Il contenitore si trova nella stanza delle infezioni dietro un sistema a doppia porta. Devono essere predisposti tutti i protocolli necessari per l'esposizione accidentale alle zanzare infette (file supplementare S1). I protocolli sono specifici per paese e dipendono dai requisiti dell'istituzione.
- Nei giorni 8-10 dopo l'alimentazione dell'infezione, abbattere le zanzare infette mettendole sul ghiaccio e trasferendole in tubi etichettati con etanolo al 70% (mantenendo separate le zanzare di ciascun gruppo di controllo e trattamento).
- Assicurarsi che tutte le zanzare siano morte prima di lasciare la stanza delle infezioni.
4. Dissezioni di zanzare infette
NOTA: Questa parte del protocollo è condotta in laboratorio.
- Trasferire le zanzare in piastre di Petri etichettate rivestite con carta da filtro, mantenendo separati i gruppi di controllo e di test.
- Posizionare una goccia di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) su un vetrino da microscopio (contrassegnato in base al gruppo di controllo / test) e trasferire una singola zanzara dalla carta da filtro al PBS.
- Rimuovere l'intestino intermedio dal campione immobilizzato e infetto bloccando il torace della zanzara con l'ago da dissezione mentre si tira il 7° segmento addominale con la pinza.
- Con l'intestino esposto e visibile, cercare i tubuli malpighiani (Figura 4A, B) per distinguere l'intestino dalle ovaie. Rimuoverlo dal PBS, trasferirlo in una goccia di mercurocromo allo 0,1% su un nuovo vetrino da microscopio e lasciare macchiare l'intestino per 8-10 minuti.
- Dopo la colorazione, posizionare un coprivetro sull'intestino colorato e visualizzare l'intestino sotto l'illuminazione a campo chiaro con ingrandimento 20x-40x (Figura 4C, D).
- Registrare la presenza e il numero di oocisti per intestino medio per ciascun gruppo di controllo e trattamento (file supplementare S2).
- Calcolare l'attività di blocco della trasmissione utilizzando l'equazione (1):
%TBA
(1)
dove TBA = attività di blocco della trasmissione (riduzione della prevalenza di oocisti); p = prevalenza di oocisti; C = controllo; e T = trattamento. - Calcolare l'attività di riduzione della trasmissione utilizzando l'equazione (2):
%TRA =
(2)
dove TRA = attività di riduzione della trasmissione (riduzione dell'intensità dell'oocisti); I = intensità dell'oocisti; C = controllo; e T = trattamento.
NOTA: il TBA potrebbe non essere significativamente ridotto, ma una differenza significativa potrebbe essere osservata nel TRA e viceversa. Questo dipende dal materiale chimico da valutare. - Eseguire analisi statistiche utilizzando il t-test non parametrico ( Mann-Whitney).
(1)
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Representative Results
Il numero totale di campioni di controllo sezionati era di 47, con una prevalenza media dell'89% e un'intensità di 9,5 oocisti per intestino medio (Tabella 1, pubblicata in precedenza22). Per il composto MMV1581558, la dimensione del campione ha raggiunto un totale di 42 campioni, con una prevalenza di oocisti del 36% e un'intensità media di 1,5 oocisti. Ciò mostra una riduzione della prevalenza di oocisti del 58% e una TRA dell'82% in tutte e tre le repliche biologiche (Tabella 1).
Sia %TRA che %TBA per MMV1581558 erano superiori al 50%; Pertanto, questo composto potrebbe essere considerato un potenziale candidato per il blocco e la riduzione della trasmissione. L'analisi statistica sia per l'intensità che per la prevalenza ha mostrato una differenza significativa tra il gruppo di controllo e MMV1581558 (p < 0,0001) (Tabella 1 e Figura 5).
Figura 1: Illustrazione del sistema di infezione artificiale delle zanzare Anopheles con gametociti Plasmodium falciparum . Abbreviazione: SMFA = test standard di alimentazione a membrana. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Sistema di alimentazione a membrana con acqua che circola attraverso gli alimentatori di vetro e i tubi di silicone per regolare la temperatura della coltura dei gametociti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Femmina di Anopheles completamente ingorgata dopo un pasto di sangue. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Midgut della femmina di Anopheles . (A) con tubuli malpighiani; (B) con ovaie; (C) con oocisti di Plasmodium falciparum ; e (D) midgut non infetto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Riepilogo statistico dell'intensità dell'oocisti tra il gruppo di controllo (n = 47) e il composto MMV1581558 (n = 42). Barre di errore, ±SE; gli asterischi indicano una differenza significativa (ns P > 0,05, ****P < 0,0001). Abbreviazione: DMSO = dimetil solfossido. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Composto | Numero di ripetizioni. | Dimensione del campione | Prevalenza media | Media Intensità/intestino | %TBA | %TRA | Prevalenza del valore P | Intensità del valore P |
| Controllo | 3 | 47 | 89% | 9.5 | ||||
| MMV1581558 | 3 | 42 | 36% | 1.5 | 58% | 82% | <0,0001 | <0,0001 |
Tabella 1: Set di dati di un composto antimalarico, MMV1581558, valutato durante tre repliche biologiche del saggio standard di alimentazione a membrana. Per ciascun gruppo di controllo e test, viene indicata la dimensione del campione (n), insieme alla prevalenza e all'intensità medie di oocisti per intestino medio. Sono indicate l'attività di blocco della trasmissione e l'attività di riduzione della trasmissione. Abbreviazioni: TBA = attività di blocco della trasmissione; TRA = attività di riduzione della trasmissione.
Figura supplementare S1: Zanzare infette contenute all'interno di una camera nella stanza di infezione dell'insettario. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare S1: Protocollo per l'esposizione accidentale a zanzare infette. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare S2: Foglio di registrazione per la prevalenza e l'intensità dell'oocisti. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Affinché questo protocollo venga eseguito correttamente, è necessario prestare attenzione a ogni passaggio, anche se potrebbe essere un processo noioso e laborioso. Uno dei passi più importanti è assicurarsi che la coltura dei gametociti sia di buona qualità e che sia costituita da gametociti maturi, con il corretto rapporto maschio/femmina, prima di iniziare l'SMFA23,24. Durante la SMFA, è anche fondamentale mantenere la coltura dei gametociti alla temperatura corretta per evitare che i gameti maschili si esflagellino prima di entrare nella zanzara. Un altro fattore che svolge un ruolo cruciale nello stabilire un'infezione artificiale di successo è quello di garantire che le zanzare femmine siano desiderose di prendere un pasto di sangue poiché anche il comportamento alimentare delle zanzare può influenzare notevolmente l'esito25. Per garantire che solo le zanzare completamente nutrite vengano sezionate dopo che le oocisti si sono sviluppate, è fondamentale concentrarsi sulla rimozione di tutte le zanzare non alimentate da ogni tazza, poiché ciò potrebbe influenzare notevolmente i risultati. La dissezione dell'intestino medio è un altro passo importante per garantire che siano disponibili campioni sufficienti per ulteriori analisi. Le viscere intermedie hanno la tendenza a strappare, il che può causare la fuoriuscita del contenuto dell'intestino medio. Un altro passo importante in questo protocollo è la colorazione delle viscere, che è cruciale per il rilevamento e il conteggio delle oocisti al microscopio.
Alcune limitazioni del metodo includono la piccola dimensione del campione delle zanzare, che può influenzare l'accuratezza e la varianza della stima TRA20,26. Questo è principalmente il risultato di un basso tasso di alimentazione durante l'SMFA. Poiché la maggior parte delle colonie di zanzare sono mantenute su sangue animale, la fornitura di una coltura di sangue umano infetto da gametociti nella SMFA potrebbe contribuire al tasso di alimentazione non ottimale. Ciò si osserva anche con l'aggiunta di alcuni composti, che possono fungere da repellenti per le zanzare. La colorazione delle oocisti con mercurocromo presenta alcuni inconvenienti in quanto colora altre strutture all'interno del midgut27. Ciò causa una scarsa visibilità delle oocisti e rende difficile il conteggio delle oocisti, influenzando i risultati28. Risultati contrastanti emergono anche quando si confrontano quelli del test SFMA con saggi alternativi29,30. Inoltre, limitazioni come vincoli di tempo e dissezioni ad alta intensità di manodopera limitano l'elaborazione ad alta produttività quando si utilizza questo metodo31. Anche il numero di gametociti ingeriti dalle zanzare durante questo processo di infezione artificiale è risultato basso in alcuni casi, probabilmente influenzando l'intensità dell'oocisti32,33,34.
Sono stati sviluppati anche altri metodi alternativi, tra cui saggi di bioluminescenza, in cui vengono utilizzate linee parassitarie che esprimono la luciferasi della lucciola36. Sebbene quest'ultimo metodo aumenti la produttività dei campioni, ha anche le sue restrizioni, poiché tali linee parassitarie non potrebbero essere utilizzate per valutare la trasmissione di infezioni che si verificano naturalmente o coinvolgono parassiti di tipo selvatico37. Altri metodi che coinvolgono la reazione a catena della polimerasi (PCR) sono anche ampiamente utilizzati. Sebbene questi metodi migliorino la sensibilità del rilevamento delle oocisti, non tutti sono completamente quantitativi38,39,40. Il test TaqMan qPCR è un altro metodo promettente per la rilevazione di oocisti di P. falciparum, e questo metodo è stato trovato per quantificare livelli molto più bassi di parassitemia rispetto alla microscopia41,42,43,44. Questo test, tuttavia, richiede attrezzature e sonde costose. Inoltre, eventuali cambiamenti nella morfologia delle oocisti dovuti ai composti non possono essere rilevati visibilmente durante la qPCR. Rispetto a questi metodi, il metodo SFMA rimane uno strumento prezioso per il rilevamento delle infezioni e la valutazione dei composti poiché la maggior parte dei limiti di questo metodo sono relativamente facili da superare.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Prof. Lyn-Mari Birkholtz e la dottoressa Janette Reader del Dipartimento di Biochimica, Genetica e Microbiologia, Istituto per il controllo sostenibile della malaria, presso l'Università di Pretoria, per la coltura e la fornitura della coltura dei gametociti. Il ceppo parassita è stato ottenuto da quest'ultimo dipartimento (non parte di questa pubblicazione). Il Dipartimento di Scienza e Innovazione (DSI) e la Fondazione Nazionale della Ricerca (NRF); South African Research Chairs Initiative (UID 64763 a LK e UID 84627 a LMB); le NRF Communities of Practice (UID 110666 a LMB e LK); e il South African Medical Research Council Strategic Health Innovation Partnerships (SHIP) sono anche riconosciuti per i fondi del DSI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine intestine/ | Butchery | ||
| Compound MMV1581558 | MMV | Pandemic response box | |
| Dissecting needles | WRIM | Custom made | |
| falcon tube | Lasec | ||
| Glass feeders | Glastechniek Peter Coelen B.V. | ||
| Graphpad Prism (8.3.0) | Graphpad | ||
| Mercurochrome | Merck (Sigma-Aldrich) | 129-16-8 | |
| Microscope slides | Merch (Sigma-Aldrich) | S8902 | |
| Parafilm | Cleansafe | ||
| PBS tablets | ThermoFisher Scientific | BP2944 | |
| Perspex biosafety cabinet | Wits University | Made by the contractors at Wits | |
| Plastic cups (350 mL) | Plastic Land |
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