Summary
Den nuværende protokol beskriver den svinefascio-kutane klapmodel og dens potentielle anvendelse i vaskulariseret sammensat vævsforskning.
Abstract
Vaskulariserede sammensatte allografts (VCA) såsom hånd-, ansigts- eller penistransplantation repræsenterer den banebrydende behandling for ødelæggende huddefekter, mislykkedes ved de første trin i den rekonstruktive stige. På trods af lovende æstetiske og funktionelle resultater er den vigtigste begrænsende faktor fortsat behovet for en drastisk anvendt livslang immunsuppression og dens velkendte medicinske risici, der forhindrer bredere indikationer. Derfor er det vigtigt at løfte immunbarrieren i VCA for at tippe den etiske skala og forbedre patienternes livskvalitet ved hjælp af de mest avancerede kirurgiske teknikker. De novo skabelse af et patientspecifikt transplantat er det kommende gennembrud inden for rekonstruktiv transplantation. Ved hjælp af vævstekniske teknikker kan VCA'er frigøres fra donorceller og tilpasses modtageren gennem perfusion-decellularisering-recellularisering. For at udvikle disse nye teknologier er en storstilet dyr VCA-model nødvendig. Derfor repræsenterer svinefascio-kutane klapper, der består af hud, fedt, fascia og kar, en ideel model til indledende undersøgelser i VCA. Ikke desto mindre omfatter de fleste VCA-modeller, der er beskrevet i litteraturen, muskler og knogler. Dette arbejde rapporterer en pålidelig og reproducerbar teknik til saphenous fascio-kutan klaphøst hos svin, et praktisk værktøj til forskellige forskningsområder, især vaskulariseret kompositvævsteknik.
Introduction
Vaskulariserede sammensatte allografter (VCA) har revolutioneret behandlingen af svære at reparere tab af kropsdele, såsom hænder, ansigt og penis 1,2,3. Desværre har de første langsigtede resultater4 vist, at livslang administration af højdosis immunsuppressive midler kan føre til alvorlige sikkerhedsmedicinske tilstande, herunder diabetes, infektioner, neoplasi og reno-vaskulær dysfunktion5. På det seneste har ekspert VCA-hold været nødt til at styre risikoen for kronisk afvisning, der fører til transplantattab og udføre de første tilfælde af ansigtstransplantation 6,7. Forskellige strategier er blevet beskrevet for at overvinde begrænsningerne ved immunsuppression i VCA. Den første er afhængig af at etablere langsigtet grafttolerance ved at inducere en immunblandet kimærismetilstand i allograftmodtageren 8,9. Den anden involverer de novo oprettelse af et patientspecifikt transplantat via vævsteknik.
For nylig har perfusionsdecellularisering af biologiske væv genereret native ekstracellulære matrix (ECM) stilladser, hvilket gør det muligt at bevare det vaskulære netværk og vævsarkitekturen i hele organer10. Derfor ville recellulariseringen af disse ECM med modtagerspecifikke celler skabe et tilpasset transplantat fri for immunbegrænsninger. I forskning om VCA bioengineering har flere hold decellulariseret og opnået en sådan ECM, der bevarer hele arkitekturen11,12,13. Recellulariseringsprocessen er dog stadig udfordrende og har ikke været vellykket i store dyremodeller14,15. Udvikling af disse banebrydende teknologier skaber et behov for pålidelige og reproducerbare modeller for kompositvæv til store dyr. Svinemodeller repræsenterer det største valg i bioengineeringsudviklingspipelinen, da svinehud præsenterer de nærmeste anatomiske og fysiologiske egenskaber til menneskelig hud16. Brugen af fascio-kutane klapper (FCF) er ideel under de første skridt mod skabelsen af 'skræddersyede' vaskulariserede sammensatte vævstransplantater. Faktisk er FCF en elementær VCA-model, der indeholder hud, fedt, fascia og endotelceller. En beskrivelse af svin myokutane klapper17 og osteomyokutane klapper18 findes i litteraturen. Ikke desto mindre mangler der fokus på fascio-kutane klapper høstteknikker.
Derfor har denne undersøgelse til formål at give forskere en detaljeret beskrivelse af en svinesaphenøs FCF-indkøbsteknik og skildre alle klappens egenskaber til brug på mange forskningsområder, især inden for vaskulariseret kompositvævsteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr modtog menneskelig pleje efter National Institute of Health Guide til pleje og brug af forsøgsdyr. Institutional Animal Care and Use Committee godkendte forsøgsprotokollen (IACUC-protokol #2020N000015). Syv kvindelige Yorkshire grise (20-25 kg) blev brugt til alle forsøg.
1. Præoperativ pleje
- Hurtigt dyret til fast føde 12 timer før operationen.
- Bedøve dyret med 4,4 mg/kg Telazol, 2,2 mg/kg Xylazin og 0,04 mg/kg (IM) atropinsulfat (se materialetabel).
- Placer et 18 G perifert intravenøst kateter i en ørevene.
- Intuber svinet med et passende endotrachealrør (6-15 mm kan bruges til 10-200 kg svin) og tilslut røret til en ventilator. Præoperativ analgesi administreres med buprenorphin (0,05 mg/kg, IM) (se materialetabel).
2. Intraoperativ overvågning
- Oprethold anæstesi med en inhalationsblanding på 1,5% -3% isofluran med 1,5 l / min iltstrøm.
- Overvåg kontinuerligt puls, pulsoximetri og endetids CO2. Vurder blodtryk og kropstemperatur hvert 5. minut.
BEMÆRK: Målområdet for pulsen er mellem 90-100 slag / min, iltmætningen skal være højere end 93%, og CO2-intervallet i slutningen af tidevandet er mellem 5% -6% af CO2. - Administrer 5-10 ml / kg i timen 0,9% saltvand under hele proceduren for at regulere det gennemsnitlige arterielle tryk mellem 60 mmHg og 90 mmHg.
3. Bilaterale saphenous FCF-indkøb
- Placer dyret i liggende stilling. Barber og skrub både lysker og bagben, omfatter hele bagbenene på operationsstedet og draperer på en steril måde.
- Palper pulsen i den saphenøse arterie ~ 3 fingerbredder medial fra patellaen og tag den.
- Identificer og tegn grænserne for klappen.
BEMÆRK: Den overlegne grænse er en akse parallelt med lyskefolden 3 cm under den. Den laterale grænse er en akse fra den forreste overlegne iliac rygsøjle til den mediale del af patellaen. - Der tegnes en ovallignende klap med en diameter på 10 cm centreret på den saphenøse pedicle og indeholdt i de tidligere beskrevne klapgrænser (trin 3.3).
- Lav et 1,5 cm hudsnit med hensyn til den distale del af pediklen på klappens vartegn.
- Åbn fascia og stump dissekering for at afsløre den saphenøse arterie og dens to venae comitantes. Udfør en dobbelt ligatur og adskil i et bundt.
- Skær den resterende hud på klappen med et blad.
- Brug cautery til at åbne det subkutane væv og den omgivende fascia. Udfør grundig hæmostase ved hjælp af bipolar tang (se Materialetabel).
- Fastgør hudkomponenten i klappen til den underliggende fascia med 3-0 ikke-absorberbare suturer for at undgå utilsigtet trækkraft og forstyrrelse af perforerende kar.
- Frigør klappen fra gracilis ved at dissekere fasciaen væk fra musklen.
BEMÆRK: Den distale del af den saphenøse pedicle løber i et plan mellem gracilis-musklen og fasciaen. Passende spænding og forsigtig bipolar hæmostase af sidegrene er afgørende elementer for at lette pedikeldissektionen. - Brug en skalpel til at lave et snit på 12 cm i lyskefolden. Udfør et vinkelret snit, der forbinder den inguinale fold til den proksimale del af klappen. Løft den forbindende hud væk og åbn det subkutane lag ved hjælp af cautery.
- Fortsæt pedikeldissektionen ved at følge de saphenøse kar ned mod lårbenskarrene.
BEMÆRK: Den proksimale del af den saphenøse pedicle kan enten løbe gennem den intermuskulære septum eller dykke ind i gracilis-musklen. - Skeletoniser lårbenskarrene og ligér dem distalt til den saphenøse gren i to separate bundter. Fortsæt dissektionen af lårbenskarrene fra distal til proximal, indtil du når niveauet af det inguinale ledbånd. Brug bipolar tang til at cauterize eller vaskulære klip og 2-0 silkebånd til at ligere de dybe lårbenskar, og skær derefter.
BEMÆRK: Vaskulære klip kan også bruges, før karrene skæres. - Gentag trin 3.2-3.13 på den kontralaterale bagben for at høste den anden saphenøse klap.
- Heparinize dyret med en intravenøs (IV) heparininjektion (100 IE/kg) 5 minutter før trin 3.16.
- Læg lårbenet pedicle (arterie og vene) så proximal til lyskebåndet som muligt og adskil klappen fra donorgrisen.
- Lårbenskarret udskilles og indsæt et 20 G angiokateter i både arterie og vene. Brug 3-0 silkebånd til at fastgøre kateteret til karrene.
- Skyl langsomt den fascio-kutane klaparterie med 10 ml heparinsaltvand (100 IE / ml), indtil der observeres en klar venøs udstrømning (figur 1).
Figur 1: Indfødt og decellulariseret saphenøs fascio-kutan klap. (A) Isoleret hudklap med et 20 G angiokateter indsat i lårbensarterien, hvilket gør det muligt at vaske klappen fra blodet og fortsætte med forskellige eksperimenter (angiografi, perfusionsdecellularisering). (B) Decellulariseret hudklap. Perfusion decellularisering giver hvide, acellulære stilladser efter 10 dages vaskemiddelperfusion. H&E-farvede tværsnit i fuld tykkelse af (C) indfødt hudklap og (D) decellulariseret hudklap. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Aflive dyret med en IV-injektion af natriumphenobarbital (100 mg/kg). Bekræft døden ved fravær af hjerteslag og åndedrætsbevægelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette arbejde med levende dyr blev forudgået ved at bestemme det saphenøse perforasom på tre kadaverprøver (figur 2). En farvet påfyldningsopløsning blev injiceret i den saphenøse arterie for at opacificere det specifikke vaskulære netværk, der kommer fra arterien. Opløsningen består af 10 ml blåfarvet glycerinmiddel blandet med 10 ml fortyndingsmiddel (se Materialetabel). Dette genererede et farvet kort over huden vaskulariseret af den saphenøse arterie og tillod at tegne grænserne for den saphenøse FCF.
Figur 2: Perforasome bestemmelse. En farvet arkiveringsopløsning blev injiceret i Saphenous-arterien af kadaverprøver for præcist at bestemme grænserne for huden, der perfunderes af Saphenous pedicle Klik her for at se en større version af denne figur.
I alt 14 saphenøse fasciokutane klapper blev høstet i denne undersøgelse (tabel 1). Den gennemsnitlige flap indkøbstid var 47 (41; 62) min. De gennemsnitlige arterie- og venediametre var henholdsvis 2,25 mm (2; 2,5) og 3,56 mm (2,7; 3,9). Endelig var den gennemsnitlige pedikellængde 10,8 cm (10,4; 12,6).
| Dyrs vægt (kg) | FCF høst varighed (min) | Pedicle længde (cm) | Arterie diameter (mm) | Venøs diameter (mm) |
| Gennemsnit (min;max) | Gennemsnit (min;max) | Gennemsnit (min. maks.) | Gennemsnit (min. maks.) | Gennemsnit (min. maks.) |
| 23 (20; 25) | 47 (41; 62) | 10,8 (10,4; 12,6) | 2.25 (2; 2.5) | 3.56 (2.7; 3.9) |
Tabel 1: Saphenous flaps egenskaber baseret på 14 flap høst.
En FCF-angiografi (figur 3) blev udført efter hver klaphøst gennem intraarteriel injektion af 10 ml kontrastprodukt umiddelbart efter heparinsaltvandsskylningen. Således gjorde dette trin det muligt at vurdere vaskulariseringen af hudpadlen. Alle angiografibilleder viste et tæt og velfordelt vaskulært netværk på klappen.
Figur 3: Saphenous fascio-kutan flap angiografi. Et kontrastprodukt blev injiceret gennem lårbensarterien, der viste et tæt saphenøs vaskulært netværk. Skala i centimeter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Klapperne blev derefter underlagt den brugerdefinerede decellulariseringsprotokol11. Klapperne blev perfunderet ved hjælp af trykstyret maskinperfusion, hvilket leverede et kontinuerligt flow ved hjælp af denne protokol. Med et måltryk på 80 mmHg var strømmen af PBS, SDS og Triton X begrænset til en maksimal hastighed på 3,1 ml/min. Der blev ikke noteret noget iltforbrug, da perfusionssystemet var dedikeret til klapcelledetersionen. Denne protokol resulterede i effektiv decellularisering af alle væv (figur 1), som bekræftet af fraværet af DNA i alle vævsprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel beskriver en pålidelig og reproducerbar fasciocutaneous flap høstet på svin bagben. Efter denne trinvise kirurgiske protokol vil det være muligt at indkøbe to klapper på kun et dyr på mindre end 2 timer. Det mest kritiske trin i operationen er skeletiseringen af den vaskulære pedicle i gracilis muskelfibre, hvilket kræver en grundig dissektion af en dygtig kirurg. Fastgørelse af huden til fascia ved hjælp af kutane suturer er et afgørende tip for at undgå en skæreeffekt, der forstyrrer perforatorens kar og en efterfølgende huddevaskularisering af klappen. Egenskaberne ved den saphenøse FCF (lang vaskulær pedikel, anstændige kalibre af skibe) og dens pålidelighed gør den til en ideel model for mange forskningsområder.
Flere hold har vist interesse for denne model i en hudbioengineeringsprotokol ved decellularisering og recellularisering11. Fraværet af muskler var et centralt punkt i implementeringen af en bioengineeringsprotokol. Derfor søgte vi efter fasciocutane klapper placeret enten på forbenet, midback, lår eller lyske, hvor panniculus carnosus (tyndt muskulært lag, der deler de overfladiske og dybe fedtlag i svin) mangler19. I indledende forsøg blev abdominale hudflapper baseret på den dybe overlegne epigastriske arterie høstet efter tidligere offentliggjorte protokoller20,21,22. Fartøjernes lille diameter, den vanskeligere høstteknik og tilstedeværelsen af panniculus carnosus repræsenterede imidlertid betydelige ulemper. Den eksperimentelle protokol ved perfusionsdecellularisering afslørede uoverensstemmelser i hudperfusionen gennem perforatorerne, der syntes for små og / eller skadede under operationen.
Denne klap er også blevet brugt til at studere de mekanistiske veje, der er involveret i immunafstødning af vaskulariserede hudtransplantater, idet huden er den mest immunogene komponent i VCA 8,23. Ved hjælp af denne model er virkningen af hudkomponenten i transplantationstolerancen blevet nøjagtigt evalueret.
Desuden kan denne detaljerede procedure også tjene som en præklinisk model inden for andre forskningsområder. Saphenous FCF kunne evaluere iskæmi-reperfusionsskader på en stor dyrehudmodel tættere på et menneske. Endelig kan det også være nyttigt til ex-vivo VCA-maskinperfusionskonservering og hjælpe med at bestemme de bedste perfusionsparametre for at opretholde hudens levedygtighed inden transplantation24.
Afslutningsvis vil jeg sige, at denne nøjagtige beskrivelse af en pålidelig og reproducerbar flap-indkøbsteknik er et værdifuldt værktøj til VCA-bioteknologiske undersøgelser af svin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Shriners Hospitals for Children-tilskud #85127 (BEU og CLC) og #84702 (AA). Forfatterne vil gerne takke fonden "Gueules Cassées" for lønstøtten til de stipendiater, der er involveret i dette projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G angiocatheter | BD Insyte Autoguard | 381409 | |
| 20 G angiocatheter | BD Insyte Autoguard | 381411 | |
| Adson Tissue Forceps, 11 cm, 1 x 2 Teeth with Tying Platform | ASSI | ASSI.ATK26426 | |
| Atropine Sulfate | AdvaCare | 212-868 | |
| Bipolar cords | ASSI | 228000C | |
| Buprenorphine HCl | Pharmaceutical, Inc | 42023-179-01 | |
| Dilating Forceps | Fine science tools (FST) | 18131-12 | |
| Endotrachel tube | Jorgensen Labs | JO615X | size from 6 to 15mm depending on the pig weight |
| Ethilon 3-0 16 mm 3/8 | Ethicon | MPVCP683H | |
| Euthasol | Virbac AH | 200-071 | |
| Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 units/mL | BD PosiFlush | 306424 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-704-06 | |
| Jewelers Bipolar Forceps Non Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter | ASSI | ASSI.BPNS11223 | |
| Metzenbaum scissors 180 mm | B Braun | BC606R | |
| Microfil blue | Flow tech | LMV-120 | |
| Microfil dilution | Flow tech | LMV-112 | colored filing solution |
| Monopolar knife | ASSI | 221230C | |
| N°15 scalpel blade | Swann Morton | NS11 | |
| Omnipaque | General Electric | 4080358 | contrast product |
| Perma-Hand Silk 3-0 | Ethicon | A184H | |
| Small Ligaclip | Ethicon | MCM20 | |
| Stevens scissors 115 mm | B Braun | BC008R | |
| Telazol | Zoetis | 106-111 | |
| Xylamed (xylazine) | Bimeda | 200-529 |
References
- Dubernard, J. M., et al. Human hand allograft: Report on first 6 months. The Lancet. 353 (9161), 1315-1320 (1999).
- Meningaud, J. P., et al. Procurement of total human face graft for allotransplantation: A preclinical study and the first clinical case. Plastic and Reconstructive Surgery. 126 (4), 1181-1190 (2010).
- Cetrulo, C. L., et al. Penis transplantation: First US experience. Annals of Surgery. 267 (5), 983-988 (2018).
- Lantieri, L., et al. Face transplant: Long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388 (10052), London, England. 1398-1407 (2016).
- Derek, E., Dhanireddy, K.
- Lantieri, L., et al. First human facial retransplantation: 30-month follow-up. Lancet. 396 (10264), London, England. 1758-1765 (2020).
- Kauke, M., et al. Full facial retransplantation in a female patient-Technical, immunologic, and clinical considerations. American Journal of Transplantation. 21 (10), 3472-3480 (2021).
- Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. American Journal of Transplantation. 14 (2), 343-355 (2014).
- Kawai, T., et al. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. The New England Journal of Medicine. 368 (19), 1850-1852 (2013).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Lupon, E., et al. Engineering Vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 9 (2), 66-76 (2001).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475 (2013).
- Rosh, E. H., Vistnes, L. M., Ksander, G. A. The panniculus carnosus in the domestic pic. Plastic and Reconstructive Surgery. 59 (1), 94-97 (1977).
- Alessa, M. A., et al. Porcine as a training module for head and neck microvascular reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (139), e58104 (2018).
- Minqiang, X., Jie, L., Dali, M., Lanhua, M. Transmidline abdominal skin flap model in pig: Refinements and advancements. Journal of Reconstructive Microsurgery. 28 (02), 111-118 (2012).
- Bodin, F., et al. Porcine model for free-flap breast reconstruction training. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 68 (10), 1402-1409 (2015).
- Kadono, K., Gruszynski, M., Azari, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Vascularized composite allotransplantation versus solid organ transplantation: Innate-adaptive immune interphase. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (6), 714-720 (2019).
- Kruit, A. S., et al. Rectus Abdominis flap replantation after 18 h hypothermic extracorporeal perfusion-A Porcine Model. Journal of Clinical Medicine. 10 (17), 3858 (2021).
