Summary
Het huidige protocol beschrijft het porcine fascio-cutane flap model en het potentiële gebruik ervan in gevasculariseerd samengesteld weefselonderzoek.
Abstract
Vascularized Composite Allografts (VCA) zoals hand-, gezichts- of penistransplantatie vertegenwoordigen de geavanceerde behandeling voor verwoestende huiddefecten, mislukt door de eerste stappen van de reconstructieve ladder. Ondanks veelbelovende esthetische en functionele resultaten, blijft de belangrijkste beperkende factor de noodzaak van een drastisch toegepaste levenslange immunosuppressie en de bekende medische risico's ervan, waardoor bredere indicaties worden voorkomen. Daarom is het opheffen van de immuunbarrière in VCA essentieel om de ethische schaal te kantelen en de kwaliteit van leven van patiënten te verbeteren met behulp van de meest geavanceerde chirurgische technieken. De novo creatie van een patiëntspecifiek transplantaat is de aanstaande doorbraak in reconstructieve transplantatie. Met behulp van tissue engineering-technieken kunnen VCA's worden bevrijd van donorcellen en worden aangepast voor de ontvanger door perfusie-decellularisatie-recellularisatie. Om deze nieuwe technologieën te ontwikkelen is een grootschalig dierlijk VCA-model nodig. Vandaar dat varkens fascio-cutane flappen, samengesteld uit huid, vet, fascia en bloedvaten, een ideaal model vormen voor voorbereidende studies in VCA. Niettemin omvatten de meeste VCA-modellen die in de literatuur worden beschreven spieren en botten. Dit werk rapporteert een betrouwbare en reproduceerbare techniek voor saphenous fascio-cutane flap harvest bij varkens, een praktisch hulpmiddel voor verschillende onderzoeksgebieden, met name gevasculariseerde composiet weefseltechnologie.
Introduction
Gevasculariseerde composiet allografts (VCA) hebben een revolutie teweeggebracht in de behandeling van moeilijk te repareren lichaamsdelenverliezen, zoals handen, gezicht en penis 1,2,3. Helaas hebben de eerste langetermijnresultaten4 aangetoond dat levenslange toediening van hooggedoseerde immunosuppressiva kan leiden tot ernstige bijkomende medische aandoeningen, waaronder diabetes, infecties, neoplasie en reno-vasculaire disfunctie5. De laatste tijd hebben deskundige VCA-teams het risico op chronische afstoting die leidt tot transplantaatverlies moeten beheersen en de eerste gezichtshertransplantatiegevallen moeten uitvoeren 6,7. Er zijn verschillende strategieën beschreven om de beperkingen van immunosuppressie bij VCA te overwinnen. De eerste is gebaseerd op het vaststellen van langetermijntransplantaattolerantie door een immuun gemengd chimerisme te induceren bij de allograft-ontvanger 8,9. De tweede betreft de novo creatie van een patiëntspecifiek transplantaat via tissue engineering.
Onlangs heeft perfusie-decellularisatie van biologische weefsels inheemse extracellulaire matrix (ECM) scaffolds gegenereerd, waardoor het behoud van het vasculaire netwerk en de weefselarchitectuur van hele organenmogelijk is 10. Vandaar dat de recellularisatie van deze ECM met ontvangerspecifieke cellen een aangepast transplantaat zou creëren dat vrij is van immuunbeperkingen. In onderzoek naar VCA-bio-engineering hebben meerdere teams dergelijke ECM gedecellulariseerd en verkregen met behoud van de gehele architectuur 11,12,13. Het hercellulisatieproces blijft echter uitdagend en is niet succesvol geweest in grote diermodellen14,15. De ontwikkeling van deze baanbrekende technologieën creëert een behoefte aan betrouwbare en reproduceerbare grote dierlijke samengestelde weefselmodellen. Varkensmodellen vertegenwoordigen de grootste keuze in de ontwikkelingspijplijn van bio-engineering, omdat varkenshuid de anatomische en fysiologische kenmerken vertoont die het dichtst bij de menselijke huidliggen 16. Het gebruik van fascio-cutane flaps (FCF) is ideaal tijdens de eerste stappen naar het creëren van 'op maat gemaakte' gevasculariseerde composiet weefseltransplantaten. FCF is inderdaad een elementair VCA-model dat huid-, vet-, fascia- en endotheelcellen bevat. Een beschrijving van varkens myocutane flappen17 en osteomyocutane flappen18 is te vinden in de literatuur. Toch is er een gebrek aan focus op fascio-cutane flaps oogsttechnieken.
Daarom is deze studie bedoeld om onderzoekers een gedetailleerde beschrijving te geven van een varkenssabophenous FCF-verkrijgingstechniek en alle kenmerken van de flap weer te geven voor gebruik in vele onderzoeksgebieden, vooral in gevasculariseerde composiet weefseltechnologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren kregen menselijke zorg volgens de National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Het Institutional Animal Care and Use Committee keurde het experimentele protocol (IACUC-protocol #2020N000015) goed. Zeven vrouwelijke Yorkshire-varkens (20-25 kg) werden gebruikt voor alle experimenten.
1. Preoperatieve zorg
- Vast het dier voor vast voedsel 12 uur voorafgaand aan de operatie.
- Verdoof het dier met 4,4 mg/kg Telazol, 2,2 mg/kg Xylazine en 0,04 mg/kg (IM) Atropinesulfaat (zie Materiaaltabel).
- Plaats een perifere intraveneuze katheter van 18 G in een oorader.
- Intubeer de varkens met een geschikte endotracheale buis (6-15 mm kan worden gebruikt voor varkens van 10-200 kg) en sluit de buis aan op een ventilator. Dien preoperatieve analgesie toe met buprenorfine (0,05 mg/kg, IM) (zie materiaaltabel).
2. Intraoperatieve monitoring
- Onderhoud anesthesie met een inhalatiemengsel van 1,5% -3% isofluraan met een zuurstofstroom van 1,5 l/min.
- Controleer continu de hartslag, pulsoximetrie enco-2 van het eindgetijden. Beoordeel de bloeddruk en lichaamstemperatuur elke 5 min.
OPMERKING: Het doelbereik voor de hartslag ligt tussen 90-100 slagen / min, de zuurstofverzadiging moet hoger zijn dan 93% en het CO2-bereik van de eindgetijden ligt tussen 5% -6% van CO2. - Dien 5-10 ml / kg per uur 0,9% zoutoplossing toe gedurende de hele procedure om de gemiddelde arteriële druk tussen 60 mmHg en 90 mmHg te regelen.
3. Bilaterale aanbestedingen van de FCF
- Plaats het dier in rugligging. Scheer en schrob zowel de liezen als de achterpoten, neem de hele achterpoten op de operatieplaats op en drapeer op een steriele manier.
- Palpeer de puls van de sapheneuze slagader ~ 3 vingerbreedtes mediaal van de patella en label deze.
- Identificeer en teken de grenzen van de flap.
OPMERKING: De bovengrens is een as evenwijdig aan de inguinale plooi 3 cm eronder. De laterale limiet is een as van de voorste superieure iliacale wervelkolom naar het mediale deel van de patella. - Teken een ovaalachtige flap met een diameter van 10 cm, gecentreerd op de sapheneuze pedikel en opgenomen in de eerder beschreven flaplimieten (stap 3.3).
- Maak een huidincisie van 1,5 cm met betrekking tot het distale deel van de pedikel op het flappunt.
- Open de fascia en stompe dissectie om de sapheneuze slagader en de twee venae comitantes bloot te leggen. Voer een dubbele ligatuur uit en scheid in één bundel.
- Snijd de resterende huid van de flap in met een mesje.
- Gebruik cautery om het onderhuidse weefsel en de omliggende fascia te openen. Voer grondige hemostase uit met behulp van een bipolaire tang (zie materiaaltabel).
- Bevestig de huidcomponent van de flap aan de onderliggende fascia met 3-0 niet-absorbeerbare hechtingen om onbedoelde tractie en verstoring van perforerende vaten te voorkomen.
- Bevrijd de flap van de gracilis door de fascia weg te snijden van de spier.
OPMERKING: Het distale deel van de sapheneuze pedikel loopt in een vlak tussen de gracilispier en de fascia. Passende spanning en voorzichtige bipolaire hemostase van zijtakken zijn cruciale elementen om de pedisectie te vergemakkelijken. - Gebruik een scalpel om een incisie van 12 cm in de liesplooi te maken. Voer een loodrechte incisie uit die de inguinale plooi verbindt met het proximale deel van de flap. Til de verbindende huid weg en open de onderhuidse laag met behulp van cautery.
- Ga verder met de pedisectie door de saphenous vaten naar beneden te volgen in de richting van de femorale vaten.
OPMERKING: Het proximale deel van de sapheneuze pedikel kan door het intermusculaire septum lopen of in de gracilispier duiken. - Skeletiseer de femorale vaten en liteer ze distaal naar de saphenous tak in twee afzonderlijke bundels. Ga door met de dissectie van de femorale vaten van distale naar proximale totdat het niveau van het liesband is bereikt. Gebruik een bipolaire tang om te cauteriseren of vasculaire clips en 2-0 zijden banden om de diepe femorale vaten te ligateeren en vervolgens te snijden.
OPMERKING: Vasculaire clips kunnen ook worden gebruikt voordat de vaten worden gesneden. - Herhaal stap 3.2-3.13 op de contralaterale achterklep om de tweede sapheneuze flap te oogsten.
- Hepariniseer het dier met een intraveneuze (IV) heparine-injectie (100 IE/kg) 5 min vóór stap 3.16.
- Lirk de femorale pedikel (slagader en ader) zo proximaal mogelijk aan het liesband en scheid de flap van het donorvarken.
- Verwijd de uiteinden van het femorale vat en plaats een 20 G angiocatheter in zowel slagader als ader. Gebruik 3-0 zijden banden om de katheter aan de vaten te bevestigen.
- Spoel de fascio-cutane flapslagader langzaam door met 10 ml heparinezoutoplossing (100 IE/ml) totdat een duidelijke veneuze uitstroom wordt waargenomen (figuur 1).
Figuur 1: Inheemse en gedecelluliseerde saphenous fascio-cutane flap. (A) Geïsoleerde huidflap met een 20 G angiocatheter ingebracht in de dijbeenslagader, waardoor de flap uit het bloed kan worden gewassen en verschillende experimenten kunnen worden uitgevoerd (angiografie, perfusiedecellularisatie). (B) Gedecellulariseerde huidflap. Perfusie decellularisatie die witte, acellulaire steigers oplevert na 10 dagen detergentperfusie. H&E-gekleurde doorsneden van volledige dikte van (C) inheemse huidflap en (D) gedecellulariseerde huidflap. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Euthanaseer het dier met een IV-injectie van natriumfenobarbital (100 mg/kg). Bevestig de dood door de afwezigheid van hartslag en ademhalingsbewegingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit werk aan levende dieren werd voorafgegaan door het bepalen van het saphenous perforasome op drie cadaverische exemplaren (figuur 2). Een gekleurde vuloplossing werd geïnjecteerd in de sapheneuze slagader om het specifieke vasculaire netwerk afkomstig van de slagader te vertroebelen. De oplossing bestaat uit 10 ml blauwgekleurd glycerinemiddel gemengd met 10 ml verdunningsmiddel (zie materiaaltabel). Dit genereerde een gekleurde kaart van de huid gevasculariseerd door de sapheneuze slagader en maakte het mogelijk om de grenzen van de saphenous FCF te trekken.
Figuur 2: Perforasoombepaling. Een gekleurde vijloplossing werd geïnjecteerd in de Saphenous-slagader van cadaverische specimens om precies de grenzen van de huid te bepalen die door de Saphenous pedicle wordt doordrenkt Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In dit onderzoek werden in totaal 14 saphenous fasciocutane flaps geoogst (tabel 1). De gemiddelde flap-inkooptijd was 47 (41; 62) min. De gemiddelde slagader- en aderdiameters waren respectievelijk 2,25 mm (2; 2,5) en 3,56 mm (2,7; 3,9). Ten slotte was de gemiddelde pedikellengte 10,8 cm (10,4; 12,6).
| Gewicht van het dier (kg) | FCF oogstduur (min) | Pedikel lengte (cm) | Diameter van de slagader (mm) | Veneuze diameter (mm) |
| Gemiddelde (min;max) | Gemiddelde (min;max) | Gemiddelde (min; max) | Gemiddelde (min; max) | Gemiddelde (min; max) |
| 23 (20; 25) | 47 (41; 62) | 10,8 (10,4; 12,6) | 2,25 (2; 2,5) | 3,56 (2,7; 3,9) |
Tabel 1: Kenmerken van saphenous flaps op basis van 14 flapoogsten.
Een FCF-angiografie (figuur 3) werd uitgevoerd na elke flapoogst door intraarteriële injectie van 10 ml contrastproduct onmiddellijk na de heparine zoutoplossing flush. Deze stap maakte het dus mogelijk om de vascularisatie van de huidpeddel te beoordelen. Alle angiografiebeelden toonden een dicht en goed verdeeld vasculair netwerk op de flap.
Figuur 3: Saphenous fascio-cutane flap angiografie. Een contrastproduct werd geïnjecteerd door de dijbeenslagader, met een dicht sapheneus vasculair netwerk. Schaal in centimeters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De flappen werden vervolgens onderworpen aan het aangepaste decellularisatieprotocol11. De flappen werden doordrenkt met behulp van drukgestuurde machineperfusie, waardoor een continue stroom werd geleverd met behulp van dit protocol. Met een doeldruk van 80 mmHg was de stroom van PBS, SDS en Triton X beperkt tot een maximale snelheid van 3,1 ml/min. Er werd geen zuurstofverbruik genoteerd omdat het perfusiesysteem was gewijd aan de afschrikking van de flapcellen. Dit protocol resulteerde in effectieve decellularisatie van alle weefsels (figuur 1), zoals bevestigd door de afwezigheid van DNA in alle weefselmonsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft een betrouwbare en reproduceerbare fasciocutane flap geoogst op varkensachterpoten. Het volgen van dit stapsgewijze chirurgische protocol maakt het mogelijk om in minder dan 2 uur twee flappen op slechts één dier te verkrijgen. De meest kritieke stap van de operatie is de skeletisatie van de vasculaire pedikel in de gracilis-spiervezels, die een grondige dissectie door een bekwame chirurg vereist. Het vastzetten van de huid aan de fascia met behulp van cutane hechtingen is een cruciale tip om te voorkomen dat een afschuivingseffect de bloedvaten van de perforator verstoort en een daaropvolgende huiddevascularisatie van de flap. De kenmerken van de saphenous FCF (lange vasculaire pedikel, fatsoenlijk kalibers van vaten) en de betrouwbaarheid maken het een ideaal model voor vele onderzoeksgebieden.
Verschillende teams hebben interesse getoond in dit model in een huidbio-engineeringprotocol door decellularisatie en recellularisatie11. De afwezigheid van spieren was een scharnierpunt bij het implementeren van een bio-engineeringprotocol. Daarom zochten we naar fasciocutane flappen op de voorpoot, midback, dij of lies waar de panniculus carnosus (dunne spierlaag die de oppervlakkige en diepe vetlagen bij varkens deelt)ontbreekt 19. In voorlopige experimenten werden buikhuidflappen op basis van de diepe superieure epigastrische slagader geoogst volgens eerder gepubliceerde protocollen 20,21,22. De kleine diameter van de vaten, de moeilijkere oogsttechniek en de aanwezigheid van de panniculus carnosus vormden echter aanzienlijke nadelen. Het experimentele protocol door perfusie-decellularisatie onthulde inconsistenties in de huidperfusie via de perforatoren die tijdens de operatie te klein en/ of gewond leken.
Deze flap is ook gebruikt om de mechanistische routes te bestuderen die betrokken zijn bij de immuunafstoting van gevasculariseerde huidtransplantaties, waarbij de huid de meest immunogene component is in VCA 8,23. Met behulp van dit model is de impact van de huidcomponent in de transplantatietolerantie nauwkeurig geëvalueerd.
Bovendien kan deze gedetailleerde procedure ook dienen als een preklinisch model in andere onderzoeksgebieden. Saphenous FCF zou ischemie-reperfusieletsels kunnen evalueren op een groot dierlijk huidmodel dat dichter bij een mens staat. Ten slotte kan het ook nuttig zijn voor ex-vivo VCA-machineperfusiebehoud en helpen bij het bepalen van de beste perfusieparameters om de levensvatbaarheid van de huid vóór transplantatie te behouden24.
Tot slot biedt deze nauwkeurige beschrijving van een betrouwbare en reproduceerbare flap-verkrijgingstechniek een waardevol hulpmiddel voor VCA-bio-engineeringstudies bij varkens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door Shriners Hospitals for Children subsidies # 85127 (BEU en CLC) en # 84702 (AA). De auteurs willen de stichting "Gueules Cassées" bedanken voor de salarisondersteuning aan de fellows die bij dat project betrokken zijn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G angiocatheter | BD Insyte Autoguard | 381409 | |
| 20 G angiocatheter | BD Insyte Autoguard | 381411 | |
| Adson Tissue Forceps, 11 cm, 1 x 2 Teeth with Tying Platform | ASSI | ASSI.ATK26426 | |
| Atropine Sulfate | AdvaCare | 212-868 | |
| Bipolar cords | ASSI | 228000C | |
| Buprenorphine HCl | Pharmaceutical, Inc | 42023-179-01 | |
| Dilating Forceps | Fine science tools (FST) | 18131-12 | |
| Endotrachel tube | Jorgensen Labs | JO615X | size from 6 to 15mm depending on the pig weight |
| Ethilon 3-0 16 mm 3/8 | Ethicon | MPVCP683H | |
| Euthasol | Virbac AH | 200-071 | |
| Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 units/mL | BD PosiFlush | 306424 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-704-06 | |
| Jewelers Bipolar Forceps Non Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter | ASSI | ASSI.BPNS11223 | |
| Metzenbaum scissors 180 mm | B Braun | BC606R | |
| Microfil blue | Flow tech | LMV-120 | |
| Microfil dilution | Flow tech | LMV-112 | colored filing solution |
| Monopolar knife | ASSI | 221230C | |
| N°15 scalpel blade | Swann Morton | NS11 | |
| Omnipaque | General Electric | 4080358 | contrast product |
| Perma-Hand Silk 3-0 | Ethicon | A184H | |
| Small Ligaclip | Ethicon | MCM20 | |
| Stevens scissors 115 mm | B Braun | BC008R | |
| Telazol | Zoetis | 106-111 | |
| Xylamed (xylazine) | Bimeda | 200-529 |
References
- Dubernard, J. M., et al. Human hand allograft: Report on first 6 months. The Lancet. 353 (9161), 1315-1320 (1999).
- Meningaud, J. P., et al. Procurement of total human face graft for allotransplantation: A preclinical study and the first clinical case. Plastic and Reconstructive Surgery. 126 (4), 1181-1190 (2010).
- Cetrulo, C. L., et al. Penis transplantation: First US experience. Annals of Surgery. 267 (5), 983-988 (2018).
- Lantieri, L., et al. Face transplant: Long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388 (10052), London, England. 1398-1407 (2016).
- Derek, E., Dhanireddy, K.
- Lantieri, L., et al. First human facial retransplantation: 30-month follow-up. Lancet. 396 (10264), London, England. 1758-1765 (2020).
- Kauke, M., et al. Full facial retransplantation in a female patient-Technical, immunologic, and clinical considerations. American Journal of Transplantation. 21 (10), 3472-3480 (2021).
- Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. American Journal of Transplantation. 14 (2), 343-355 (2014).
- Kawai, T., et al. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. The New England Journal of Medicine. 368 (19), 1850-1852 (2013).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Lupon, E., et al. Engineering Vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 9 (2), 66-76 (2001).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475 (2013).
- Rosh, E. H., Vistnes, L. M., Ksander, G. A. The panniculus carnosus in the domestic pic. Plastic and Reconstructive Surgery. 59 (1), 94-97 (1977).
- Alessa, M. A., et al. Porcine as a training module for head and neck microvascular reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (139), e58104 (2018).
- Minqiang, X., Jie, L., Dali, M., Lanhua, M. Transmidline abdominal skin flap model in pig: Refinements and advancements. Journal of Reconstructive Microsurgery. 28 (02), 111-118 (2012).
- Bodin, F., et al. Porcine model for free-flap breast reconstruction training. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 68 (10), 1402-1409 (2015).
- Kadono, K., Gruszynski, M., Azari, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Vascularized composite allotransplantation versus solid organ transplantation: Innate-adaptive immune interphase. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (6), 714-720 (2019).
- Kruit, A. S., et al. Rectus Abdominis flap replantation after 18 h hypothermic extracorporeal perfusion-A Porcine Model. Journal of Clinical Medicine. 10 (17), 3858 (2021).
