Summary
Denne protokollen beskriver den svin fascio-kutane klaffmodellen og dens potensielle bruk i vaskularisert komposittvevsforskning.
Abstract
Vascularized Composite Allografts (VCA) som hånd-, ansikts- eller penistransplantasjon representerer den banebrytende behandlingen for ødeleggende huddefekter, mislyktes av de første trinnene i den rekonstruktive stigen. Til tross for lovende estetiske og funksjonelle resultater, er den viktigste begrensende faktoren fortsatt behovet for en drastisk anvendt livslang immunsuppresjon og dens velkjente medisinske risikoer, som forhindrer bredere indikasjoner. Derfor er det viktig å løfte immunbarrieren i VCA for å tippe den etiske skalaen og forbedre pasientens livskvalitet ved hjelp av de mest avanserte kirurgiske teknikkene. De novo opprettelse av et pasientspesifikt transplantat er det kommende gjennombruddet i rekonstruktiv transplantasjon. Ved hjelp av vevstekniske teknikker kan VCAer frigjøres fra donorceller og tilpasses mottakeren gjennom perfusjon-decellularisering-recellularisering. For å utvikle disse nye teknologiene er det nødvendig med en storskala VCA-modell for dyr. Derfor er svin fascio-kutane klaffer, sammensatt av hud, fett, fascia og kar, en ideell modell for foreløpige studier i VCA. Likevel inkluderer de fleste VCA-modeller beskrevet i litteraturen muskler og bein. Dette arbeidet rapporterer en pålitelig og reproduserbar teknikk for saphenous fascio-kutan klaffhøsting i svin, et praktisk verktøy for ulike forskningsfelt, spesielt vaskularisert komposittvevsteknikk.
Introduction
Vaskulariserte sammensatte allotransplantater (VCA) har revolusjonert behandlingen av vanskelig å reparere kroppsdeltap, for eksempel hender, ansikt og penis 1,2,3. Dessverre har de første langsiktige resultatene4 vist at livslang administrering av høydose immunosuppressive midler kan føre til alvorlige sikkerhetsmedisinske tilstander, inkludert diabetes, infeksjoner, neoplasi og reno-vaskulær dysfunksjon5. I det siste har ekspert VCA-team måttet håndtere risikoen for kronisk avstøtning som fører til tap av transplantat og utføre de første ansiktstransplantasjonstilfellene 6,7. Ulike strategier er beskrevet for å overvinne begrensningene ved immunsuppresjon i VCA. Den første er avhengig av å etablere langsiktig grafttoleranse ved å indusere en immunblandet kimærismetilstand hos allograftmottakeren 8,9. Den andre innebærer de novo opprettelse av et pasientspesifikt transplantat via vevsteknikk.
Nylig har perfusjonsdecellularisering av biologisk vev generert innfødte ekstracellulære matriks (ECM) stillaser, noe som gjør det mulig å bevare det vaskulære nettverket og vevsarkitekturen til hele organer10. Derfor vil recellulariseringen av disse ECM med mottakerspesifikke celler skape et tilpasset transplantat uten immunbegrensninger. I forskning på VCA bioengineering har flere lag decellularisert og oppnådd slik ECM som bevarer hele arkitekturen11,12,13. Recellulariseringsprosessen er imidlertid fortsatt utfordrende og har ikke vært vellykket i store dyremodeller14,15. Utvikling av disse banebrytende teknologiene skaper et behov for pålitelige og reproduserbare store dyrekomposittvevsmodeller. Svinemodeller representerer det største valget i bioengineering utviklingsrørledningen, da svinehud presenterer de nærmeste anatomiske og fysiologiske egenskapene til menneskelig hud16. Bruken av fascio-kutane klaffer (FCF) er ideell i de første trinnene mot etableringen av "skreddersydde" vaskulariserte sammensatte vevstransplantater. Faktisk er FCF en elementær VCA-modell som inneholder hud-, fett-, fascia- og endotelceller. En beskrivelse av svin myokutane klaffer17 og osteomyokutane klaffer18 finnes i litteraturen. Likevel er det mangel på fokus på fascio-kutane klaffhøstingsteknikker.
Derfor har denne studien som mål å gi forskere en detaljert beskrivelse av en svin saphenous FCF anskaffelsesteknikk og skildre alle klaffens egenskaper for bruk i mange forskningsfelt, spesielt i vaskularisert komposittvevsteknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr fikk menneskelig omsorg etter National Institute of Health Guide for omsorg og bruk av laboratoriedyr. Institutional Animal Care and Use Committee godkjente den eksperimentelle protokollen (IACUC-protokollen #2020N000015). Syv kvinnelige Yorkshire griser (20-25 kg) ble brukt til alle forsøk.
1. Preoperativ behandling
- Rask dyret for fast føde 12 timer før operasjonen.
- Sedate dyret med 4,4 mg/kg Telazol, 2,2 mg/kg Xylazin og 0,04 mg/kg (i.m.) Atropinsulfat (se Materialfortegnelse).
- Plasser et 18 g perifert intravenøst kateter i en ørevene.
- Intuber svinet med et passende endotrakealrør (6-15 mm kan brukes til 10-200 kg griser) og koble røret til en ventilator. Administrer preoperativ analgesi med buprenorfin (0,05 mg/kg, i.m.) (se materialfortegnelse).
2. Intraoperativ overvåking
- Oppretthold anestesi med en inhalasjonsblanding på 1,5%-3% isofluran med 1,5 l / min oksygenstrøm.
- Overvåk kontinuerlig hjertefrekvens, pulsoksymetri og endetidal CO2. Vurder blodtrykk og kroppstemperatur hvert 5. minutt.
MERK: Målområdet for hjertefrekvensen er mellom 90-100 slag / min, oksygenmetningen må være høyere enn 93%, og endetidal CO 2-området er mellom 5% -6% av CO2. - Administrer 5-10 ml / kg per time 0,9% saltvann gjennom hele prosedyren for å regulere gjennomsnittlig arterielt trykk mellom 60 mmHg og 90 mmHg.
3. Bilateral saphenous FCF anskaffelse
- Plasser dyret i en liggende stilling. Barber og skrubb både lysker og bakben, inkluder hele bakbenene på operasjonsstedet, og draper på en steril måte.
- Palpere pulsen på saphenous arterien ~ 3 fingerbredder mediale fra patella og merke den.
- Identifiser og tegn grensene for klaffen.
MERK: Den øvre grensen er en akse parallelt med inngangsbrettet 3 cm under den. Sidegrensen er en akse fra den fremre overlegne iliac ryggraden til den mediale delen av patellaen. - Tegn en ovallignende klaff med en diameter på 10 cm sentrert på den saphenøse pedicleen og inneholdt i de tidligere beskrevne klaffgrensene (trinn 3.3).
- Lag et 1,5 cm hudinnsnitt angående den distale delen av pedicleen på klaffens landemerke.
- Åpne fascia og stump dissekere for å eksponere saphenous arterien og dens to venae comitantes. Utfør en dobbel ligatur og skill i en bunt.
- Snitt den gjenværende huden på klaffen med et blad.
- Bruk cautery for å åpne det subkutane vevet og den omkringliggende fascia. Utfør grundig hemostase ved hjelp av bipolar tang (se materialfortegnelse).
- Fest hudkomponenten i klaffen til den underliggende fascia med 3-0 ikke-absorberbare suturer for å unngå utilsiktet trekkraft og forstyrrelse av perforerende kar.
- Frigjør klaffen fra gracilis ved å dissekere fascia vekk fra muskelen.
MERK: Den distale delen av saphenous pedicle går i et plan mellom gracilis muskelen og fascia. Passende spenning og forsiktig bipolar hemostase av sidegrener er avgjørende elementer for å lette pedikeldisseksjonen. - Bruk en skalpell for å lage et 12 cm snitt i inngangskrøllen. Utfør et vinkelrett snitt som forbinder inngangskrøllen til den proksimale delen av klaffen. Løft bort tilkoblingshuden og åpne det subkutane laget ved hjelp av cautery.
- Fortsett pedikeldisseksjonen ved å følge de saphenøse karene ned mot lårkarene.
MERK: Den proksimale delen av saphenous pedicle kan enten løpe gjennom intermuskulær septum eller dykke inn i gracilis muskelen. - Skeletonize lårbenene og ligate dem distalt til saphenous grenen i to separate bunter. Fortsett disseksjonen av lårbenene fra distale til proksimale til du når nivået av inguinal ligamentet. Bruk bipolare tang til å cauterize eller vaskulære klips og 2-0 silkebånd for å ligate de dype lårbenene, og kutt deretter.
MERK: Vaskulære klips kan også brukes før kutting av karene. - Gjenta trinn 3.2-3.13 på den kontralaterale bakbenet for å høste den andre saphenøse klaffen.
- Hepariniser dyret med en intravenøs (IV) heparininjeksjon (100 IE/kg) 5 minutter før trinn 3,16.
- Ligate femoral pedicle (arterie og vene) så proksimalt til inguinal ligament som mulig og skille klaffen fra donorgrisen.
- Dilate lårbenets ender og sett inn et 20 G angiokateter i både arterie og vene. Bruk 3-0 silkebånd for å sikre kateteret til karene.
- Skyll langsomt den fascio-kutane lappearterien med 10 ml heparinsaltvann (100 IE/ml) til det observeres klar veneutstrømning (figur 1).
Figur 1: Innfødt og decellularisert saphenøs fascio-kutan klaff. (A) Isolert hudklaff med et 20 G angiokateter satt inn i lårarterien, slik at man kan vaske klaffen fra blodet og fortsette med forskjellige eksperimenter (angiografi, perfusjonsdecellularisering). (B) Decellularisert hudklaff. Perfusjonsdecellularisering som gir hvite, acellulære stillaser etter 10 dagers vaskemiddelperfusjon. H&E-farget tverrsnitt i full tykkelse av (C) innfødt hudklaff og (D) decellularisert hudklaff. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Avliv dyret med en IV injeksjon av natriumfenobarbital (100 mg/kg). Bekreft døden ved fravær av hjerteslag og luftveisbevegelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette arbeidet med levende dyr ble innledet med å bestemme saphenous perforasome på tre kadaveriske prøver (figur 2). En farget fyllingsløsning ble injisert i saphenøs arterien for å opacifisere det spesifikke vaskulære nettverket som kommer fra arterien. Løsningen består av 10 ml blåfarget glyserinmiddel blandet med 10 ml fortynningsmiddel (se materialfortegnelse). Dette genererte et farget kart over huden vaskularisert av saphenous arterien og tillot å tegne grensene for saphenous FCF.
Figur 2: Perforasome bestemmelse. En farget arkiveringsløsning ble injisert i Saphenous arterien av kadaveriske prøver for nøyaktig å bestemme grensene for huden som ble perfundert av Saphenous-pedicleen Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I denne studien ble det høstet 14 saphenøse fasciokutane klaffer (tab 1). Gjennomsnittlig klaffinnkjøpstid var 47 (41; 62) min. Gjennomsnittlig arterie og veinous diametre var henholdsvis 2,25 mm (2; 2,5) og 3,56 mm (2,7; 3,9). Til slutt var gjennomsnittlig pedikellengde 10,8 cm (10,4; 12,6).
| Dyrs vekt (kg) | FCF høsting varighet (min) | Pedicle lengde (cm) | Arteriediameter (mm) | Venøs diameter (mm) |
| Gjennomsnitt (min;maks) | Gjennomsnitt (min;maks) | Gjennomsnitt (min; maks) | Gjennomsnitt (min; maks) | Gjennomsnitt (min; maks) |
| 23 (20; 25) | 47 (41; 62) | 10,8 (10,4; 12,6) | 2,25 (2; 2,5) | 3,56 (2,7; 3,9) |
Tabell 1: Saphenøse klaffegenskaper basert på 14 klaffhøstinger.
Etter hver klaffehøsting ble det utført spinalinjeksjon av spinalarteriell injeksjon av 10 ml kontrastprodukt umiddelbart etter heparin saltvannsspyling. Dermed gjorde dette trinnet det mulig å vurdere vaskulariseringen av hudpadlen. Alle angiografibilder viste et tett og godt fordelt vaskulært nettverk på klaffen.
Figur 3: Saphenøs fascio-kutan klaffangiografi. Et kontrastprodukt ble injisert gjennom lårarterien, som viste et tett saphenøst vaskulært nettverk. Skala i centimeter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Klaffene ble deretter utsatt for den tilpassede decellulariseringsprotokollen11. Klaffene ble perfundert ved hjelp av trykkstyrt maskinperfusjon, og leverte en kontinuerlig strømning ved hjelp av denne protokollen. Med et måltrykk på 80 mmHg var strømmen av PBS, SDS og Triton X begrenset til en maksimal hastighet på 3,1 ml/min. Ingen oksygenforbruk ble notert da perfusjonssystemet var dedikert til klaffcelledeteksjonen. Denne protokollen resulterte i effektiv decellularisering av alle vev (figur 1), noe som bekreftes ved fravær av DNA i alle vevsprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen beskriver en pålitelig og reproduserbar fasciokutan klaff høstet på svin hindlimbs. Etter denne trinnvise kirurgiske protokollen vil det være mulig å kjøpe to klaffer på bare ett dyr på mindre enn 2 timer. Det mest kritiske trinnet i operasjonen er skeletonization av vaskulær pedicle i gracilis muskelfibre, noe som krever en grundig disseksjon av en dyktig kirurg. Å sikre huden til fascia ved hjelp av kutane suturer er et viktig tips for å unngå at en skjærende effekt forstyrrer perforatorens kar og en påfølgende hudavvaskularisering av klaffen. Egenskapene til saphenous FCF (lang vaskulær pedicle, anstendig kaliber av fartøy) og dens pålitelighet gjør den til en ideell modell for mange forskningsfelt.
Flere team har vist interesse for denne modellen i en hudbioengineeringsprotokoll ved decellularisering og recellularisering11. Fraværet av muskler var et sentralt punkt i implementeringen av en bioengineering-protokoll. Derfor søkte vi etter fasciokutane klaffer som ligger enten på forbenet, midtryggen, låret eller lysken der panniculus carnosus (tynt muskulært lag som deler de overfladiske og dype fettlagene i svin) mangler19. I foreløpige eksperimenter ble abdominale hudlapper basert på den dype overlegne epigastriske arterien høstet etter tidligere publiserte protokoller20,21,22. Imidlertid representerte fartøyets lille diameter, den vanskeligere høstteknikken og tilstedeværelsen av panniculus carnosus betydelige ulemper. Den eksperimentelle protokollen ved perfusjonsdecellularisering viste inkonsekvenser i hudperfusjonen gjennom perforatorene som virket for små og/eller skadet under operasjonen.
Denne klaffen har også blitt brukt til å studere de mekanistiske veiene som er involvert i immunavvisning av vaskulariserte hudtransplantater, huden er den mest immunogene komponenten i VCA 8,23. Ved hjelp av denne modellen har virkningen av hudkomponenten i transplantasjonstoleransen blitt nøyaktig evaluert.
Videre kan denne detaljerte prosedyren også tjene som en preklinisk modell i andre forskningsområder. Saphenous FCF kunne evaluere iskemi-reperfusjonsskader på en stor dyrehudmodell nærmere et menneske. Til slutt kan det også være nyttig for ex vivo VCA-maskin perfusjon bevaring og bidra til å bestemme de beste perfusjonsparametrene for å opprettholde hudens levedyktighet før transplantasjon24.
For å konkludere, tilbyr denne nøyaktige beskrivelsen av en pålitelig og reproduserbar klaffinnkjøpsteknikk et verdifullt verktøy for VCA bioengineering studier i svin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Shriners Hospitals for Children grants # 85127 (BEU og CLC) og # 84702 (AA). Forfatterne vil gjerne takke stiftelsen "Gueules Cassées" for lønnsstøtten til stipendiatene som er involvert i prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G angiocatheter | BD Insyte Autoguard | 381409 | |
| 20 G angiocatheter | BD Insyte Autoguard | 381411 | |
| Adson Tissue Forceps, 11 cm, 1 x 2 Teeth with Tying Platform | ASSI | ASSI.ATK26426 | |
| Atropine Sulfate | AdvaCare | 212-868 | |
| Bipolar cords | ASSI | 228000C | |
| Buprenorphine HCl | Pharmaceutical, Inc | 42023-179-01 | |
| Dilating Forceps | Fine science tools (FST) | 18131-12 | |
| Endotrachel tube | Jorgensen Labs | JO615X | size from 6 to 15mm depending on the pig weight |
| Ethilon 3-0 16 mm 3/8 | Ethicon | MPVCP683H | |
| Euthasol | Virbac AH | 200-071 | |
| Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 units/mL | BD PosiFlush | 306424 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-704-06 | |
| Jewelers Bipolar Forceps Non Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter | ASSI | ASSI.BPNS11223 | |
| Metzenbaum scissors 180 mm | B Braun | BC606R | |
| Microfil blue | Flow tech | LMV-120 | |
| Microfil dilution | Flow tech | LMV-112 | colored filing solution |
| Monopolar knife | ASSI | 221230C | |
| N°15 scalpel blade | Swann Morton | NS11 | |
| Omnipaque | General Electric | 4080358 | contrast product |
| Perma-Hand Silk 3-0 | Ethicon | A184H | |
| Small Ligaclip | Ethicon | MCM20 | |
| Stevens scissors 115 mm | B Braun | BC008R | |
| Telazol | Zoetis | 106-111 | |
| Xylamed (xylazine) | Bimeda | 200-529 |
References
- Dubernard, J. M., et al. Human hand allograft: Report on first 6 months. The Lancet. 353 (9161), 1315-1320 (1999).
- Meningaud, J. P., et al. Procurement of total human face graft for allotransplantation: A preclinical study and the first clinical case. Plastic and Reconstructive Surgery. 126 (4), 1181-1190 (2010).
- Cetrulo, C. L., et al. Penis transplantation: First US experience. Annals of Surgery. 267 (5), 983-988 (2018).
- Lantieri, L., et al. Face transplant: Long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388 (10052), London, England. 1398-1407 (2016).
- Derek, E., Dhanireddy, K.
- Lantieri, L., et al. First human facial retransplantation: 30-month follow-up. Lancet. 396 (10264), London, England. 1758-1765 (2020).
- Kauke, M., et al. Full facial retransplantation in a female patient-Technical, immunologic, and clinical considerations. American Journal of Transplantation. 21 (10), 3472-3480 (2021).
- Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. American Journal of Transplantation. 14 (2), 343-355 (2014).
- Kawai, T., et al. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. The New England Journal of Medicine. 368 (19), 1850-1852 (2013).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Lupon, E., et al. Engineering Vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 9 (2), 66-76 (2001).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475 (2013).
- Rosh, E. H., Vistnes, L. M., Ksander, G. A. The panniculus carnosus in the domestic pic. Plastic and Reconstructive Surgery. 59 (1), 94-97 (1977).
- Alessa, M. A., et al. Porcine as a training module for head and neck microvascular reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (139), e58104 (2018).
- Minqiang, X., Jie, L., Dali, M., Lanhua, M. Transmidline abdominal skin flap model in pig: Refinements and advancements. Journal of Reconstructive Microsurgery. 28 (02), 111-118 (2012).
- Bodin, F., et al. Porcine model for free-flap breast reconstruction training. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 68 (10), 1402-1409 (2015).
- Kadono, K., Gruszynski, M., Azari, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Vascularized composite allotransplantation versus solid organ transplantation: Innate-adaptive immune interphase. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (6), 714-720 (2019).
- Kruit, A. S., et al. Rectus Abdominis flap replantation after 18 h hypothermic extracorporeal perfusion-A Porcine Model. Journal of Clinical Medicine. 10 (17), 3858 (2021).
