Summary
Detta protokoll beskriver svinfascio-kutan klaffmodell och dess potentiella användning i vaskulariserad kompositvävnadsforskning.
Abstract
Vaskulariserade kompositallografter (VCA) såsom hand-, ansikts- eller penistransplantation representerar den banbrytande behandlingen för förödande huddefekter, som misslyckas med de första stegen i den rekonstruktiva stegen. Trots lovande estetiska och funktionella resultat är den viktigaste begränsande faktorn fortfarande behovet av en drastiskt tillämpad livslång immunsuppression och dess välkända medicinska risker, vilket förhindrar bredare indikationer. Därför är det viktigt att lyfta immunbarriären i VCA för att tippa den etiska skalan och förbättra patienternas livskvalitet med hjälp av de mest avancerade kirurgiska teknikerna. De novo skapandet av ett patientspecifikt transplantat är det kommande genombrottet inom rekonstruktiv transplantation. Med hjälp av vävnadstekniktekniker kan VCA frigöras från donatorceller och anpassas för mottagaren genom perfusion-decellularisering-recellularisering. För att utveckla denna nya teknik krävs en storskalig VCA-modell för djur. Därför representerar svinfascio-kutana flikar, bestående av hud, fett, fascia och kärl, en idealisk modell för förstudier i VCA. Ändå inkluderar de flesta VCA-modeller som beskrivs i litteraturen muskler och ben. Detta arbete rapporterar en pålitlig och reproducerbar teknik för saphenös fascio-kutan klaffskörd hos svin, ett praktiskt verktyg för olika forskningsområden, särskilt vaskulariserad kompositvävnadsteknik.
Introduction
Vaskulariserade sammansatta allografter (VCA) har revolutionerat behandlingen av svåra att reparera kroppsdelsförluster, såsom händer, ansikte och penis 1,2,3. Tyvärr har de första långsiktiga resultaten4 visat att livslång administrering av högdos immunsuppressiva medel kan leda till allvarliga medicinska tillstånd, inklusive diabetes, infektioner, neoplasi och reno-vaskulär dysfunktion5. På senare tid har expert-VCA-team varit tvungna att hantera risken för kronisk avstötning som leder till transplantatförlust och utföra de första ansiktsretransplantationsfallen 6,7. Olika strategier har beskrivits för att övervinna begränsningarna av immunsuppression vid VCA. Den första förlitar sig på att fastställa långsiktig transplantattolerans genom att inducera ett immunblandat chimerismtillstånd i allograftmottagaren 8,9. Den andra handlar om att skapa ett patientspecifikt transplantat via vävnadsteknik.
Nyligen har perfusionsdecellularisering av biologiska vävnader genererat inhemska extracellulära matrisställningar (ECM), vilket möjliggör bevarande av kärlnätverket och vävnadsarkitekturen hos hela organ10. Därför skulle recellulariseringen av dessa ECM med mottagarspecifika celler skapa ett anpassat transplantat fritt från immunbegränsningar. I forskning om VCA-bioteknik har flera team decellulariserat och erhållit sådan ECM som bevarar hela arkitekturen11,12,13. Recellulariseringsprocessen är dock fortfarande utmanande och har inte lyckats i stordjursmodellerna14,15. Utvecklingen av denna banbrytande teknik skapar ett behov av tillförlitliga och reproducerbara modeller för sammansatta vävnader för stora djur. Svinmodeller representerar det yttersta valet i utvecklingspipelinen för bioteknik, eftersom svinhud uppvisar de närmaste anatomiska och fysiologiska egenskaperna till mänsklig hud16. Användningen av fascio-kutana flikar (FCF) är idealisk under de första stegen mot skapandet av "skräddarsydda" vaskulariserade kompositvävnadstransplantat. Faktum är att FCF är en elementär VCA-modell som innehåller hud-, fett-, fascia- och endotelceller. En beskrivning av svinmyokutana flikar17 och osteomyokutana flikar18 finns i litteraturen. Ändå saknas fokus på fascio-kutana flikar skördetekniker.
Därför syftar denna studie till att ge forskare en detaljerad beskrivning av en svinsaphenös FCF-upphandlingsteknik och skildra alla klaffens egenskaper för dess användning inom många forskningsområden, särskilt inom vaskulariserad kompositvävnadsteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur fick mänsklig vård enligt National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Kommittén för institutionell djurvård och användning godkände försöksprotokollet (IACUC-protokoll #2020N000015). Sju kvinnliga Yorkshire-grisar (20-25 kg) användes för alla experiment.
1. Preoperativ vård
- Snabba djuret för fast mat 12 timmar före operationen.
- Lugna djuret med 4,4 mg/kg telazol, 2,2 mg/kg Xylazin och 0,04 mg/kg (IM) atropinsulfat (se materialtabell).
- Placera en 18 G perifer intravenös kateter i en öronven.
- Intubera svinen med ett lämpligt endotrakealt rör (6-15 mm kan användas för 10-200 kg grisar) och anslut röret till en ventilator. Administrera preoperativ analgesi med buprenorfin (0,05 mg/kg, IM) (se materialförteckning).
2. Intraoperativ övervakning
- Behåll anestesi med en inhalationsblandning av 1,5%-3% isofluran med 1,5 L/min syreflöde.
- Övervaka kontinuerligt hjärtfrekvensen, pulsoximetrin och end-tidal CO2. Bedöm blodtryck och kroppstemperatur var 5: e minut.
OBS: Målintervallet för hjärtfrekvensen är mellan 90-100 slag / min, syremättnaden måste vara högre än 93% och slutvatten-CO 2-intervallet är mellan 5% -6% av CO2. - Administrera 5-10 ml / kg per timme 0,9% saltlösning under hela proceduren för att reglera det genomsnittliga arteriella trycket mellan 60 mmHg och 90 mmHg.
3. Bilateral upphandling av livsmedelsföretagare
- Placera djuret i ryggläge. Raka och skrubba både ljumskar och bakben, inkludera hela bakbenen på operationsområdet och drapera på ett sterilt sätt.
- Palpera pulsen i den saphenösa artären ~ 3 fingerbredder mediala från patella och tagga den.
- Identifiera och rita gränserna för klaffen.
OBS: Den överlägsna gränsen är en axel parallell med inguinalvecket 3 cm under den. Sidogränsen är en axel från den främre överlägsna iliac ryggraden till den mediala delen av patella. - Rita en ovalliknande flik med en diameter på 10 cm centrerad på den saphenösa pedikeln och som finns i de tidigare beskrivna klaffgränserna (steg 3.3).
- Gör ett 1,5 cm hudsnitt angående den distala delen av pedikeln på klaffens landmärke.
- Öppna fascian och trubbig dissekera för att exponera den saphenösa artären och dess två venae comitantes. Utför en dubbel ligatur och separera i en bunt.
- Skär den återstående huden på klaffen med ett blad.
- Använd cautery för att öppna subkutan vävnad och den omgivande fascian. Utför grundlig hemostas med bipolära pincett (se Materialförteckning).
- Fäst hudkomponenten i klaffen på den underliggande fascian med 3-0 icke-absorberbara suturer för att undvika oavsiktlig dragkraft och störning av perforeringskärl.
- Frigör klaffen från gracilis genom att dissekera fascian bort från muskeln.
OBS: Den distala delen av den saphenösa pedikeln löper i ett plan mellan gracilismuskeln och fascian. Lämplig spänning och försiktig bipolär hemostas av sidogrenar är avgörande element för att underlätta pedikeldissektionen. - Använd en skalpell för att göra ett snitt på 12 cm i inguinalvecket. Utför ett vinkelrätt snitt som förenar inguinalvecket med den proximala delen av klaffen. Lyft bort den anslutande huden och öppna det subkutana skiktet med cautery.
- Fortsätt pedikeldissektionen genom att följa de saphenösa kärlen ner mot lårbenskärlen.
OBS: Den proximala delen av den saphenösa pedikeln kan antingen springa genom den intermuskulära septumet eller dyka in i gracilismuskeln. - Skelettisera lårbenskärlen och ligera dem distalt till den saphenösa grenen i två separata buntar. Fortsätt dissektion av lårbenskärlen från distal till proximal tills den når nivån på inguinalbandet. Använd bipolära pincett för att cauterize eller vaskulära klämmor och 2-0 silkesband för att ligera de djupa lårbenskären och skär sedan.
OBS: Kärlklämmor kan också användas innan du skär kärlen. - Upprepa steg 3.2-3.13 på den kontralaterala bakbenet för att skörda den andra saphenösa klaffen.
- Heparinisera djuret med en intravenös (IV) heparininjektion (100 IE/kg) 5 min före steg 3.16.
- Ligate lårbenspedikeln (artär och ven) så proximal till inguinalbandet som möjligt och separera klaffen från donatorgrisen.
- Vidga lårbenskärlets ändar och sätt in en 20 G angiokateter i både artär och ven. Använd 3-0 silkesband för att säkra katetern i kärlen.
- Spola långsamt den fascio-kutana klaffartären med 10 ml heparinsaltlösning (100 IE/ml) tills ett tydligt venöst utflöde observeras (figur 1).
Figur 1: Inbyggd och decellulariserad saphenös fascio-kutan flik. (A) Isolerad hudflik med en 20 G angiokateter införd i lårbensartären, vilket gör det möjligt att tvätta klaffen från blodet och fortsätta med olika experiment (angiografi, perfusionsdecellularisering). (B) Decellulariserad hudflik. Perfusionsdecellularisering som ger vita, acellulära byggnadsställningar efter 10 dagars tvättmedelsperfusion. H&E-färgade tvärsnitt i full tjocklek av (C) inhemsk hudflik och (D) decellulariserad hudflik. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Avliva djuret med en IV-injektion av natriumfenobarbital (100 mg/kg). Bekräfta döden genom frånvaro av hjärtslag och andningsrörelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta arbete på levande djur föregicks av bestämning av den saphenösa perforasomen på tre kadaveriska exemplar (figur 2). En färgad fyllningslösning injicerades i den saphenösa artären för att opacifiera det specifika vaskulära nätverket som kommer från artären. Lösningen består av 10 ml blåfärgat glycerinmedel blandat med 10 ml av utspädningsmedlet (se materialtabell). Detta genererade en färgad karta över huden vaskulariserad av den saphenösa artären och gjorde det möjligt att dra gränserna för den saphenösa FCF.
Figur 2: Bestämning av perforasom. En färgad arkiveringslösning injicerades i den saphenösa artären av kadaveriska prover för att exakt bestämma gränserna för huden som perfuseras av den saphenösa pedikeln Klicka här för att se en större version av denna figur.
Totalt skördades 14 saphenösa fasciokutana flikar i denna studie (tabell 1). Den genomsnittliga klaffupphandlingstiden var 47 (41; 62) min. Medelartären och venformiga diametrar var 2,25 mm (2; 2,5) respektive 3,56 mm (2,7; 3,9). Slutligen var den genomsnittliga pedikellängden 10,8 cm (10,4; 12,6).
| Djurvikt (kg) | FCF:s skördetid (min) | Pedikellängd (cm) | Artärdiameter (mm) | Venös diameter (mm) |
| Medelvärde (min;max) | Medelvärde (min;max) | Medelvärde (min; max) | Medelvärde (min; max) | Medelvärde (min; max) |
| 23 (20; 25) | 47 (41; 62) | 10,8 (10,4; 12,6) | 2.25 (2; 2.5) | 3,56 (2,7; 3,9) |
Tabell 1: Saphenösa flikars egenskaper baserat på 14 klaffskördar.
En FCF-angiografi (figur 3) utfördes efter varje klaffskörd genom intraarteriell injektion av 10 ml kontrastprodukt omedelbart efter heparinsaltspolningen. Således möjliggjorde detta steg att bedöma vaskulariseringen av hudpaddeln. Alla angiografibilder visade ett tätt och välfördelat vaskulärt nätverk på klaffen.
Figur 3: Saphenous fascio-kutan flikangiografi. En kontrastprodukt injicerades genom lårbensartären och visade ett tätt saphenöst vaskulärt nätverk. Skala i centimeter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Klaffarna utsattes sedan för det anpassade decellulariseringsprotokollet11. Klaffarna perfused med tryckstyrd maskinperfusion, vilket gav ett kontinuerligt flöde med hjälp av detta protokoll. Med ett måltryck på 80 mmHg begränsades flödet av PBS, SDS och Triton X till en maximal hastighet på 3,1 ml/min. Ingen syreförbrukning noterades eftersom perfusionssystemet var dedikerat till klaffcellsavskräckningen. Detta protokoll resulterade i effektiv decellularisering av alla vävnader (figur 1), vilket bekräftas av frånvaron av DNA i alla vävnadsprover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel beskriver en pålitlig och reproducerbar fasciokutan flik skördad på svinbakben. Genom att följa detta steg-för-steg-kirurgiska protokoll kommer det att vara möjligt att anskaffa två flikar på endast ett djur på mindre än 2 timmar. Det mest kritiska steget i operationen är skelettiseringen av den vaskulära pedikeln i gracilismuskelfibrerna, vilket kräver en grundlig dissektion av en skicklig kirurg. Att säkra huden mot fascian med kutana suturer är ett viktigt tips för att undvika en skjuvningseffekt som stör perforatorns kärl och en efterföljande huddevaskularisering av klaffen. Egenskaperna hos den saphenösa FCF (lång vaskulär pedikel, anständiga kalibrar av kärl) och dess tillförlitlighet gör den till en idealisk modell för många forskningsområden.
Flera team har visat intresse för denna modell i ett hudbioengineeringsprotokoll genom decellularisering och recellularisering11. Frånvaron av muskler var en avgörande punkt i genomförandet av ett bioengineeringsprotokoll. Därför sökte vi efter fasciokutana flikar som ligger antingen på frambenet, mittbacken, låret eller ljumsken där panniculus carnosus (tunt muskelskikt som delar de ytliga och djupa fettlagren i svin) saknas19. I preliminära experiment skördades bukhudflikar baserade på den djupa överlägsna epigastriska artären efter tidigare publicerade protokoll20,21,22. Fartygens lilla diameter, den svårare skördetekniken och närvaron av panniculus carnosus representerade emellertid betydande nackdelar. Det experimentella protokollet genom perfusionsdecellularisering avslöjade inkonsekvenser i hudperfusionen genom perforatorerna som verkade för små och / eller skadade under operationen.
Denna flik har också använts för att studera de mekanistiska vägarna som är involverade i immunavstötningen av vaskulära hudtransplantat, huden är den mest immunogena komponenten i VCA 8,23. Med hjälp av denna modell har hudkomponentens inverkan på transplantationstoleransen utvärderats exakt.
Dessutom kan detta detaljerade förfarande också fungera som en preklinisk modell inom andra forskningsområden. Saphenous FCF kan utvärdera ischemi-reperfusionsskador på en stor djurhudsmodell närmare en människa. Slutligen kan det också vara till hjälp för ex-vivo VCA-maskinperfusionsbevarande och hjälpa till att bestämma de bästa perfusionsparametrarna för att bibehålla hudens livskraft före transplantation24.
Sammanfattningsvis erbjuder denna exakta beskrivning av en pålitlig och reproducerbar klaffupphandlingsteknik ett värdefullt verktyg för VCA-bioingenjörsstudier i svin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Shriners Hospitals for Children bidrag #85127 (BEU och CLC) och #84702 (AA). Författarna vill tacka stiftelsen "Gueules Cassées" för lönestödet till stipendiaterna som är involverade i det projektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G angiocatheter | BD Insyte Autoguard | 381409 | |
| 20 G angiocatheter | BD Insyte Autoguard | 381411 | |
| Adson Tissue Forceps, 11 cm, 1 x 2 Teeth with Tying Platform | ASSI | ASSI.ATK26426 | |
| Atropine Sulfate | AdvaCare | 212-868 | |
| Bipolar cords | ASSI | 228000C | |
| Buprenorphine HCl | Pharmaceutical, Inc | 42023-179-01 | |
| Dilating Forceps | Fine science tools (FST) | 18131-12 | |
| Endotrachel tube | Jorgensen Labs | JO615X | size from 6 to 15mm depending on the pig weight |
| Ethilon 3-0 16 mm 3/8 | Ethicon | MPVCP683H | |
| Euthasol | Virbac AH | 200-071 | |
| Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 units/mL | BD PosiFlush | 306424 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-704-06 | |
| Jewelers Bipolar Forceps Non Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter | ASSI | ASSI.BPNS11223 | |
| Metzenbaum scissors 180 mm | B Braun | BC606R | |
| Microfil blue | Flow tech | LMV-120 | |
| Microfil dilution | Flow tech | LMV-112 | colored filing solution |
| Monopolar knife | ASSI | 221230C | |
| N°15 scalpel blade | Swann Morton | NS11 | |
| Omnipaque | General Electric | 4080358 | contrast product |
| Perma-Hand Silk 3-0 | Ethicon | A184H | |
| Small Ligaclip | Ethicon | MCM20 | |
| Stevens scissors 115 mm | B Braun | BC008R | |
| Telazol | Zoetis | 106-111 | |
| Xylamed (xylazine) | Bimeda | 200-529 |
References
- Dubernard, J. M., et al. Human hand allograft: Report on first 6 months. The Lancet. 353 (9161), 1315-1320 (1999).
- Meningaud, J. P., et al. Procurement of total human face graft for allotransplantation: A preclinical study and the first clinical case. Plastic and Reconstructive Surgery. 126 (4), 1181-1190 (2010).
- Cetrulo, C. L., et al. Penis transplantation: First US experience. Annals of Surgery. 267 (5), 983-988 (2018).
- Lantieri, L., et al. Face transplant: Long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388 (10052), London, England. 1398-1407 (2016).
- Derek, E., Dhanireddy, K.
- Lantieri, L., et al. First human facial retransplantation: 30-month follow-up. Lancet. 396 (10264), London, England. 1758-1765 (2020).
- Kauke, M., et al. Full facial retransplantation in a female patient-Technical, immunologic, and clinical considerations. American Journal of Transplantation. 21 (10), 3472-3480 (2021).
- Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. American Journal of Transplantation. 14 (2), 343-355 (2014).
- Kawai, T., et al. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. The New England Journal of Medicine. 368 (19), 1850-1852 (2013).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Lupon, E., et al. Engineering Vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 9 (2), 66-76 (2001).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475 (2013).
- Rosh, E. H., Vistnes, L. M., Ksander, G. A. The panniculus carnosus in the domestic pic. Plastic and Reconstructive Surgery. 59 (1), 94-97 (1977).
- Alessa, M. A., et al. Porcine as a training module for head and neck microvascular reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (139), e58104 (2018).
- Minqiang, X., Jie, L., Dali, M., Lanhua, M. Transmidline abdominal skin flap model in pig: Refinements and advancements. Journal of Reconstructive Microsurgery. 28 (02), 111-118 (2012).
- Bodin, F., et al. Porcine model for free-flap breast reconstruction training. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 68 (10), 1402-1409 (2015).
- Kadono, K., Gruszynski, M., Azari, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Vascularized composite allotransplantation versus solid organ transplantation: Innate-adaptive immune interphase. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (6), 714-720 (2019).
- Kruit, A. S., et al. Rectus Abdominis flap replantation after 18 h hypothermic extracorporeal perfusion-A Porcine Model. Journal of Clinical Medicine. 10 (17), 3858 (2021).
