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Immunology and Infection

गुलाब बंगाल-मध्यस्थता Photodynamic थेरेपी कैंडिडा अल्बिकन्स को बाधित करने के लिए

Published: March 24, 2022 doi: 10.3791/63558
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 5, 3,6, 7, 7, 3, 3,8,9
1Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Ophthalmology, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Department of Dermatology, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 4Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 5Department of Dermatology, Fu Jen Catholic University Hospital, Fu Jen Catholic University, 6Institute of Clinical Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 7School of Medicine, National Cheng Kung University, 8Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 9Center of Applied Nanomedicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

दवा प्रतिरोधी कैंडिडा अल्बिकन्स की बढ़ती घटना दुनिया भर में एक गंभीर स्वास्थ्य मुद्दा है। रोगाणुरोधी फोटोडायनामिक थेरेपी (एपीडीटी) दवा प्रतिरोधी फंगल संक्रमण के खिलाफ लड़ने के लिए एक रणनीति प्रदान कर सकती है। वर्तमान प्रोटोकॉल इन विट्रो में एक मल्टीड्रग-प्रतिरोधी सी अल्बिकन्स स्ट्रेन पर रोज़ बंगाल-मध्यस्थता एपीडीटी प्रभावकारिता का वर्णन करता है।

Abstract

इनवेसिव कैंडिडा अल्बिकन्स संक्रमण मनुष्यों में एक महत्वपूर्ण अवसरवादी फंगल संक्रमण है क्योंकि यह आंत, मुंह, योनि और त्वचा के सबसे आम उपनिवेशवादियों में से एक है। एंटिफंगल दवा की उपलब्धता के बावजूद, आक्रामक कैंडिडिआसिस की मृत्यु दर ~ 50% बनी हुई है। दुर्भाग्य से, दवा प्रतिरोधी सी अल्बिकन्स की घटनाएं विश्व स्तर पर बढ़ रही हैं। रोगाणुरोधी फोटोडायनामिक थेरेपी (एपीडीटी) सी अल्बिकन्स बायोफिल्म गठन को बाधित करने और दवा प्रतिरोध को दूर करने के लिए एक वैकल्पिक या सहायक उपचार प्रदान कर सकती है। रोज बंगाल (आरबी) - मध्यस्थता aPDT बैक्टीरिया और सी albicans के प्रभावी सेल हत्या दिखाया गया है. इस अध्ययन में, मल्टीड्रग-प्रतिरोधी सी अल्बिकन्स पर आरबी-एपीडीटी की प्रभावकारिता का वर्णन किया गया है। एक घर का बना हरा प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) प्रकाश स्रोत एक 96-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं के केंद्र के साथ संरेखित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। खमीर को आरबी के विभिन्न सांद्रता वाले कुओं में इनक्यूबेट किया गया था और हरे रंग की रोशनी के अलग-अलग समृद्धि के साथ रोशन किया गया था। हत्या के प्रभावों का विश्लेषण प्लेट कमजोर पड़ने की विधि द्वारा किया गया था। प्रकाश और आरबी के इष्टतम संयोजन के साथ, 3-लॉग विकास निषेध प्राप्त किया गया था। यह निष्कर्ष निकाला गया था कि आरबी-एपीडीटी संभावित रूप से दवा प्रतिरोधी सी अल्बिकन्स को रोक सकता है।

Introduction

C. albicans स्वस्थ व्यक्तियों के जठरांत्र संबंधी और genitourinary tracts में उपनिवेशऔर लगभग 50 प्रतिशत व्यक्तियों में सामान्य माइक्रोबायोटा के रूप में पता लगाया जा सकताहै। यदि मेजबान और रोगज़नक़ के बीच असंतुलन पैदा होता है, तो सी अल्बिकन्स आक्रमण करने और बीमारी पैदा करने में सक्षम है। संक्रमण स्थानीय श्लेष्म झिल्ली संक्रमण से लेकर कई अंग विफलता 2 तक हो सकताहै। अमेरिका में एक बहु-केंद्रीय निगरानी अध्ययन में, 2009 और 2017 के बीच आक्रामक कैंडिडिआसिस वाले रोगियों से लगभग आधे आइसोलेट्स सी अल्बिकन्स3 हैं। कैंडिडेमिया उच्च रुग्णता दर, मृत्यु दर, लंबे समय तक अस्पताल में रहने के साथ जुड़ा हो सकताहै 4। यूएस सेंटर ऑफ डिजीज कंट्रोल एंड प्रिवेंशन ने बताया कि परीक्षण किए गए सभी कैंडिडा रक्त नमूनों में से लगभग 7% एंटिफंगल दवा फ्लुकोनाज़ोल5 के लिए प्रतिरोधी हैं। दवा प्रतिरोधी कैंडिडा प्रजातियों का उद्भव एंटीमाइकोटिक एजेंटों के लिए एक वैकल्पिक या सहायक चिकित्सा विकसित करने के लिए चिंता पैदा करता है।

रोगाणुरोधी फोटोडायनामिक थेरेपी (एपीडीटी) में पीएस 6 के चरम अवशोषण तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश के साथ एक विशिष्ट फोटोसेंसिटाइज़र (पीएस) को सक्रिय करना शामिलहै। उत्तेजना के बाद, उत्साहित पीएस अपनी ऊर्जा या इलेक्ट्रॉनों को पास के ऑक्सीजन अणुओं में स्थानांतरित करता है और जमीन की स्थिति में लौटता है। इस प्रक्रिया के दौरान, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां और एकल ऑक्सीजन बनते हैं और सेल क्षति का कारण बनते हैं। 1990 के दशक के बाद से7 के बाद से एपीडीटी का व्यापक रूप से सूक्ष्मजीवों को मारने के लिए उपयोग किया गया है। एपीडीटी के लाभों में से एक यह है कि विकिरण के दौरान एकल ऑक्सीजन और / या प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) द्वारा एक सेल में कई ऑर्गेनेल क्षतिग्रस्त हो जाते हैं; इस प्रकार, एपीडीटी के लिए प्रतिरोध आज तक नहीं पाया गया है। इसके अलावा, हाल ही के एक अध्ययन ने बताया कि पीडीटी के बाद जीवित रहने वाले बैक्टीरिया एंटीबायोटिकदवाओं के प्रति अधिक संवेदनशील हो गए।

एपीडीटी में उपयोग किए जाने वाले प्रकाश स्रोतों में लेजर, फिल्टर के साथ धातु हैलोजन लैंप, निकट-अवरक्त प्रकाश और प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) 9,10,11,12 शामिल हैं। लेजर एक उच्च प्रकाश शक्ति प्रदान करता है, आमतौर पर 0.5 डब्ल्यू / सेमी2 से बड़ा होता है, जो बहुत कम समय में उच्च प्रकाश खुराक के वितरण की अनुमति देता है। यह व्यापक रूप से उन मामलों में उपयोग किया जाता है जहां लंबे समय तक उपचार का समय असुविधाजनक होता है जैसे कि मौखिक संक्रमण के लिए एपीडीटी। एक लेजर का दोष यह है कि रोशनी का इसका स्पॉट आकार छोटा है, जो कुछ सौ माइक्रोमीटर से लेकर एक विसारक के साथ 10 मिमी तक होता है। इसके अलावा, लेजर उपकरण महंगा है और संचालित करने के लिए विशिष्ट प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। दूसरी ओर, फिल्टर के साथ एक धातु हैलोजन लैंप का विकिरण क्षेत्र अपेक्षाकृत बड़ाहै 13। हालांकि, दीपक बहुत भारी और महंगा है। एलईडी प्रकाश स्रोत त्वचाविज्ञान क्षेत्र में एपीडीटी की मुख्यधारा बन गए हैं क्योंकि यह छोटा और कम महंगा है। विकिरण क्षेत्र एलईडी प्रकाश बल्ब की एक सरणी व्यवस्था के साथ अपेक्षाकृत बड़ा हो सकता है। पूरे चेहरे को एक ही समय में रोशन किया जा सकताहै। फिर भी, अधिकांश, यदि सभी नहीं, तो आज उपलब्ध एलईडी प्रकाश स्रोत नैदानिक उपयोग के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। यह एक प्रयोगशाला में प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है क्योंकि यह अंतरिक्ष पर कब्जा करने वाला और महंगा है। हमने एक सस्ती एलईडी सरणी विकसित की है जो बहुत छोटी है और इसे एलईडी स्ट्रिप से काटा और इकट्ठा किया जा सकता है। एल ई डी को विभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए विभिन्न व्यवस्थाओं में फिट किया जा सकता है। एक प्रयोग में 96-वेल प्लेट या यहां तक कि 384-वेल प्लेट में भी एपीडीटी की विभिन्न स्थितियों को पूरा किया जा सकता है।

रोज बंगाल (आरबी) एक रंगीन डाई है जिसका उपयोग व्यापक रूप से मानव आंखों में कॉर्नियल क्षति के विज़ुअलाइज़ेशन को बढ़ाने के लिए किया जाताहै। आरबी-मध्यस्थता एपीडीटी ने स्टैफिलोकोकस ऑरियस, एस्चेरिचिया कोलाई और सी अल्बिकन्स पर हत्या के प्रभाव दिखाए हैं, जो टोलुइडिन ब्लू ओ15 के लिए लगभग तुलनीय दक्षता के साथ हैं। यह अध्ययन मल्टीड्रग-प्रतिरोधी सी अल्बिकन्स पर आरबी-एपीडीटी के प्रभाव को मान्य करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करता है।

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Protocol

1. aPDT प्रणाली की तैयारी

  1. एक एलईडी पट्टी से चार हरे रंग के प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) काटें ( सामग्री की तालिका देखें) और उन्हें 96-अच्छी तरह से प्लेट (चित्रा 1) के चार कुओं के साथ संरेखित करें।
    नोट: एल ई डी को 4 x 3 सरणी में व्यवस्थित किया गया था। एलईडी के पीछे विकिरण के दौरान गर्मी फैलाने के लिए एक गर्मी सिंक का पालन किया गया था।
  2. एक प्रकाश बिजली मीटर के साथ 540 एनएम पर एलईडी की समृद्धि दर11 को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)। यह सुनिश्चित करने के लिए अनुपूरक चित्र1 देखें कि एलईडी की समृद्धि दर 510-560 एनएम के बीच है।
  3. विकिरण के दौरान प्लेट के साथ एक बिजली का पंखा रखें ताकि निरंतर तापमान (25 ± 1 डिग्री सेल्सियस) 11 को बनाए रखा जा सके। यह सुनिश्चित करने के लिए अनुपूरक चित्र 2 देखें कि विकिरण के दौरान माध्यम का निरंतर तापमान बनाए रखा जाए।

2. सी albicans के खमीर रूप की culturing

नोट: एक मल्टीड्रग-प्रतिरोधी सी अल्बिकन्स (BCRC 21538 / ATCC 10231), फ्लुकोनाज़ोल सहित अधिकांश एंटिफंगल के लिए प्रतिरोधी, प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है16।

  1. पहले से प्रकाशित रिपोर्ट17 के बाद एक डिस्क प्रसार विधि के साथ एंटीमाइकोटिक दवा संवेदनशीलता निर्धारित करें।
  2. खमीर, hyphae, और pseudohyphae रूपों में सी albicans बढ़ो सूक्ष्म पारिस्थितिक वातावरण18 पर निर्भर करता है.
    नोट: hyphae और pseudohyphae रूपों एक सटीक गणना के लिए मुश्किल हैं। खमीर रूप की गणना माइक्रोस्कोप के तहत या प्रवाह साइटोमेट्री के साथ ठीक से की जा सकती है। सेल विकास के दौरान तापमान इसकी आकृति विज्ञान को निर्धारित करता है। कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर, लगभग सभी कोशिकाएं खमीर रूप हैं। 30 डिग्री सेल्सियस पर सी अल्बिकन्स के 4 घंटे के छोटे इनक्यूबेशन ने इसकी खमीर आकृति विज्ञान को प्रभावित नहीं किया।

3. प्लवक सी. albicans पर aPDT

  1. एक बाँझ लूप के साथ एक अगर प्लेट से सी अल्बिकन्स की एक एकल कॉलोनी को अलग करें और इसे एक स्टरलाइज़्ड ग्लास ट्यूब में एक 3 एमएल खमीर निकालने पेप्टोन डेक्सट्रोज (वाईपीडी) माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) में जोड़ें।
    1. सी अल्बिकन्स का विस्तार करने और सटीक परिमाणीकरण के लिए खमीर के रूप में कवक को बनाए रखने के लिए 155 आरपीएम की रोटेशन गति के साथ एक इनक्यूबेटर में 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस रात भर (14-16 एच) पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
  2. 30 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 0.5 के ओडी600 मूल्य के माध्यम के साथ रातोंरात संस्कृति को पतला करें और सी अल्बिकन्स के लॉग विकास चरण को प्राप्त करने के लिए 4 घंटे के लिए 155 आरपीएम की गति से घुमाएं।
  3. 0.65 के एक OD 600 मूल्य के लिए ताजा YPD माध्यम के साथ फिर से लॉग चरण संस्कृति पतला (लगभग 1 x 107 कॉलोनी बनाने इकाइयों, CFU / mL). एक अगर प्लेट8 पर सीरियल कमजोर पड़ने विधि द्वारा अंतिम एकाग्रता की पुष्टि करें।
  4. 1x PBS में पाउडर को भंग करके रोज बंगाल (RB) का एक स्टॉक समाधान (4%) तैयार करें। फ़िल्टर और एक 0.22 μm फिल्टर के साथ इसे निष्फल और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर. आरबी की अंतिम कार्य एकाग्रता 0.2% है।
  5. कोशिकाओं में आरबी के अवशोषण को समझने के लिए कमरे के तापमान पर 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब और सह-संस्कृति में लॉग-फेज सी अल्बिकन्स के 1 मिलीलीटर में 2% आरबी के 111 μL जोड़ें (चित्रा 2)।
  6. कमरे के तापमान पर 2.5 मिनट के लिए 16,100 x g पर centrifugation के साथ 1x PBS के 1 mL के साथ सह-संस्कृति को तीन बार धोएं।
    नोट: aPDT में चार अलग-अलग स्थितियां होती हैं: पूर्ण नियंत्रण (कोई प्रकाश जोखिम नहीं, कोई आरबी), अंधेरे नियंत्रण (कोई प्रकाश नहीं लेकिन आरबी के साथ इनक्यूबेट), प्रकाश नियंत्रण (आरबी के बिना प्रकाश को उजागर करता है), एपीडीटी (आरबी की उपस्थिति में प्रकाश को उजागर करता है)।
  7. 1x PBS के 1 मिलीलीटर में C. albicans को फिर से निलंबित करें और उन्हें प्रत्येक स्थिति के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेट में तीन अलग-अलग कुओं में आवंटित करें। धोने के बाद एलईडी सरणी के साथ कुओं को संरेखित करें।
  8. प्रकाश उजागर समूहों में, बिजली के पंखे और प्रकाश को चालू करें।
    नोट: एक अलग समृद्धि (जे / सेमी2) अलग-अलग समय अवधि के लिए कुओं को उजागर करके प्राप्त किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक 16.7 मिनट का प्रकाश एक्सपोजर 10 mW / cm2 एलईडी प्रकाश बल्ब के साथ 10 J / cm2 पर आता है।
  9. विकिरण के बाद, एक 10x कमजोर पड़ने को तैयार करने के लिए 1x PBS के 180 μL युक्त 1.5 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक अच्छी तरह से सह-संस्कृति समाधान के 20 μL जोड़ें। इसके अलावा, दस बार पतला करें, बाद में उसी विधि का पालन करें।
  10. प्लेट की गिनती योग्य कॉलोनियों को प्राप्त करने के लिए एक वाईपीडी अगर प्लेट के एक चतुर्थांश पर प्रत्येक सीरियल कमजोर पड़ने की 20 μL की तीन बूँदें छोड़ दें। कालोनियों को कमजोर पड़ने वाले कारकों के साथ गुणा करकेCFU/mL की गणना कीजिये।

4. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. एक ग्राफ़िंग और सांख्यिकी सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एकत्र किए गए डेटा का विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. माध्य ± मानक त्रुटि द्वारा डेटा को चित्रित करें. विभिन्न परीक्षण स्थितियों के बीच महत्वपूर्ण अंतर का मूल्यांकन करने के लिए प्रसरण8 का दो-तरफ़ा एनोवा विश्लेषण करें।
  3. Pairwise तुलना8 के लिए Tukey के एकाधिक तुलना परीक्षण निष्पादित करें। प्रत्येक अलग-अलग उपचार के लिए, कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोग करें। पी-मान < 0.05 सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण पर विचार करें।

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Representative Results

चित्रा 1 वर्तमान अध्ययन में उपयोग की जा रही एपीडीटी प्रणाली को दर्शाता है। चूंकि उच्च तापमान महत्वपूर्ण सेल मृत्यु का कारण बन सकता है, इसलिए एलईडी सरणी को एक बिजली के पंखे द्वारा ठंडा किया जाता है, और विकिरण के दौरान 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर निरंतर तापमान बनाए रखने के लिए एक गर्मी सिंक का उपयोग किया जाता है। गर्मी प्रभाव छूट दी जा सकती है। एक भी प्रकाश वितरण होना भी एक सफल aPDT के लिए एक महत्वपूर्ण निर्धारण कारक है; इसलिए, रोशनी के दौरान एलईडी लाइट बल्ब को अच्छी तरह से ठीक से संरेखित करना महत्वपूर्ण है। एलईडी की चमक के कारण, प्रकाश को चालू करने से पहले धूप का चश्मा सुसज्जित करने की आवश्यकता होती है।

C. albicans को RB के साथ तुरंत दाग दिया जाता है जैसा कि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत लाल प्रतिदीप्ति द्वारा कल्पना की जाती है ( चित्रा 2 में 0 मिनट)। यह देखा जा सकता है कि आरबी कोशिकाओं में समय-निर्भर तरीके से प्रवेश करता है (चित्र2)। अध्ययन में 15 मिनट के आरबी इनक्यूबेशन का उपयोग किया गया था, जिस पर 15 मिनट के बाद, अधिकांश कोशिकाओं को आरबी के साथ दाग दिया गया था। आरबी की एक उच्च सांद्रता एक मजबूत प्रतिदीप्ति की ओर ले जाती है, जो कवक को मारने के लिए अधिक मुक्त कणों का उत्पादन करती है। फिर भी, यह सामान्य कोशिकाओं में महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु का कारण भी बन सकता है; इसलिए, 0.2% आरबी एकाग्रता आमतौर पर क्लीनिकों में उपयोग की जाती है। इस प्रकार, इस अध्ययन में उस सटीक एकाग्रता को चुना गया था।

पीडीटी में प्रकाश के साथ आरबी का सक्रियण शामिल है। जब सक्रिय आरबी अपनी जमीनी स्थिति में लौटता है, तो यह मुक्त कणों और एकल ऑक्सीजन उत्पन्न करने के लिए ऊर्जा और इलेक्ट्रॉनों को पास के ऑक्सीजन में स्थानांतरित करता है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिका मृत्यु होती है। चित्रा 3 कोई विकिरण या आरबी की अनुपस्थिति की स्थिति के तहत कोई कोशिका मृत्यु नहीं दिखाता है। C. albicans को 0.2% RB (चित्रा 3) की उपस्थिति में हरे रंग के प्रकाश विकिरण के बाद एक हल्के खुराक-निर्भर तरीके से बाधित किया गया था। कवक को 30 जे / सेमी2 के साथ हरी रोशनी में उजागर करने के परिणामस्वरूप सेल विकास का 4-लॉग (99.99%) निषेध हुआ।

Figure 1
चित्र1: फोटोडायनामिक सिस्टम( A) विकिरण के दौरान गर्मी को फैलाने के लिए एक हरे रंग की एलईडी सरणी को धातु गर्मी सिंक का पालन किया गया था। तापमान को 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रखने के लिए प्रकाश स्रोत के साथ एक बिजली का पंखा रखा गया था। (सी) एक 96 अच्छी तरह से प्लेट के कुओं को एलईडी के केंद्र के साथ संरेखित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सी अल्बिकन्स में प्रवेश करने वाले रोज बंगाल का समय-निर्भर अध्ययन। ब्राइट-फील्ड (ए-डी) और प्रतिदीप्ति छवियों (ई-एच) सी अल्बिकन्स के 0-30 मिनट के बाद 0.2% रोज बंगाल (आरबी) के साथ सह-सुसंस्कृत। (ए) और (ई) आरबी सह-सुसंस्कृत के बिना नियंत्रण। (बी) और (एफ) कोशिकाओं को तुरंत 0.2% आरबी के साथ दाग दिया गया था। (सी) और (जी) संस्कृति के 15 मिनट के बाद, अधिकांश कोशिकाओं ने लाल प्रतिदीप्ति दिखाई, जो कोशिकाओं के अंदर आरबी को दर्शाता है। (डी) और (एच) आरबी की मजबूत प्रतिदीप्ति को 30 मिनट के इनक्यूबेशन के साथ नोट किया गया था। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: मल्टीड्रग-प्रतिरोधी सी अल्बिकन्स पर रोगाणुरोधी फोटोडायनामिक थेरेपी प्रभाव। कोशिकाओं की वृद्धि निषेध प्रकाश समृद्धि पर निर्भर करता है। 10 जे / सेमी2 की समृद्धि के लिए सी अल्बिकन्स को उजागर करना 1.5 लॉग द्वारा सेल विकास को रोकता है, 20 जे / सेमी 2 के साथ 2 लॉग द्वारा, और0.2% रोज बंगाल की उपस्थिति में क्रमशः 30 जे / सेमी2 के साथ 4 लॉग। -आरबी, गुलाब बंगाल इनक्यूबेशन के बिना; +आरबी, 15 मिनट के लिए गुलाब बंगाल के साथ सह-सुसंस्कृत। डेटा डुप्लिकेट में किए गए तीन अलग-अलग प्रयोगों के SEM ± साधन हैं। पी मानों को आंकड़े में इंगित किया गया है (टकी के कई तुलना परीक्षण, दो-तरफ़ा एनोवा)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: एलईडी आउटपुट स्पेक्ट्रम। समृद्धि दर को एक पावर मीटर के साथ 510-560 एनएम से हर 2 एनएम मापा गया था। डेटा को तीन प्रतियों के माप के साथ दो स्वतंत्र प्रयोगों से पूल किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 2: विकिरण के दौरान माध्यम का तापमान। तापमान को मापने के लिए 100 μL शोरबा से भरे 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक थर्मोकपल डाला गया था। तापमान 25 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर था। डेटा को तीन गुना कुओं के साथ डुप्लिकेट किए गए प्रयोगों से पूल किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

फंगल केराटाइटिस के लिए आरबी-पीडीटी के नैदानिक अनुप्रयोगों के उत्साहजनक परिणाम हाल ही में19 की सूचना दी गई है। आरबी का अवशोषण शिखर 450-650 एनएम पर है। एक सफल aPDT के लिए प्रकाश स्रोत की समृद्धि दर निर्धारित करना आवश्यक है। कैंसर कोशिकाओं के इलाज के लिए एक उच्च समृद्धि (आमतौर पर >100 जे / सेमी2) की आवश्यकता होती है, जबकि संक्रमितघावों के इलाज के लिए कम समृद्धि की उम्मीद की जाती है। एक उच्च समृद्धि का मतलब है एक लंबा एक्सपोजर समय जो नैदानिक सेटिंग में व्यावहारिक नहीं हो सकता है। माइकोटिक केराटाइटिस के इलाज के लिए, नेत्र रोग समुदाय20 में 5.4 जे / सेमी2 पर सहमति व्यक्त की गई है। आरबी का एक लंबा इनक्यूबेशन समय भी एक रोगी के लिए पीडीटी उपचार प्राप्त करने के लिए असुविधाजनक है। इस प्रकार, आगे के प्रयोगों के लिए 15 मिनट इनक्यूबेशन का समय चुना गया था।

एक सफल प्रयोग के लिए कुछ कदम महत्वपूर्ण हैं। फंगल संस्कृति के लिए उपयोग की जाने वाली आगर प्लेटों को सतह पर नमी को कम करने के लिए पंखे के साथ एक लैमेलर फ्लो केबिन में 15-20 मिनट के लिए सुखाया गया था। एक नम सतह कवक बूंदों के प्रवाह को मिश्रण करने की अनुमति देगी, जिससे एक एकल कॉलोनी के गठन को रोका जा सके।

मंद प्रकाश में सभी प्रयोगों को निष्पादित करना आरबी को फोटोब्लीचिंग से रखने के लिए महत्वपूर्ण है। विद्युत परिपथ एक समानांतर कनेक्शन में था ताकि यदि सर्किट में से किसी एक में ब्रेक हुआ, तो शेष उपकरण प्रभावित नहीं होंगे। यदि ऐसे परिणाम हैं जो दूसरों की आउट-रेंज हैं, तो सरणी को पहले यह सुनिश्चित करने के लिए जांचा जा सकता है कि सभी एलईडी लाइट बल्ब अच्छे कार्य में हैं।

एक एलईडी प्रकाश स्रोत का उपयोग करने की एक सीमा इसकी तापमान निर्भरता है। एक एलईडी में, गर्मी का उत्पादन एलईडी लाइट बल्ब द्वारा ही नहीं किया जाता है, लेकिन डिवाइस 9 के भीतर अर्धचालक जंक्शन पर उत्पन्न होताहै। चूंकि उनके रेटेड वर्तमान के ऊपर ओवरड्राइविंग एल ई डी जंक्शन तापमान के बढ़ने को उजागर करता है, अंततः प्रकाश बल्ब की समय से पहले विफलता के लिए अग्रणी होता है, इसलिए जंक्शन के उपयुक्त शीतलन प्रदान करने के लिए डिवाइस को धातु गर्मी सिंक से लैस करना आवश्यक है। एलईडी सरणी के वर्तमान डिजाइन की एक और सीमा प्रत्येक एलईडी लाइट बल्ब द्वारा प्रकाशित प्रतिबंधित क्षेत्र है, जो केवल 96-अच्छी तरह से प्लेट के एक एकल कुएं को समायोजित करता है। यदि एक बड़े रोशनी क्षेत्र की आवश्यकता होती है, तो प्लेट के ऊपर या नीचे उचित संबंधित दूरी के साथ एलईडी बल्बों की एक अलग व्यवस्था भी रोशनी प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।

इस अध्ययन डिजाइन के फायदे aPDT प्रयोगों के लिए photodynamic प्रणाली की आसानी और सस्ती सेटअप कर रहे हैं। इसका उपयोग फंगल संक्रमण से संबंधित प्रयोगों में किया जा सकता है। वायरस और बैक्टीरिया का परीक्षण भी एक ही प्रणाली में किया जा सकता है। एलईडी लाइट स्ट्रिप को प्रकाश के एक अलग रंग से चुना जा सकता है ताकि विभिन्न फोटोसेंसिटाइज़र की अवशोषण चोटियों के साथ सहसंबंधित किया जा सके, जो दृश्यमान से लेकर निकट-अवरक्त प्रकाश स्पेक्ट्रम तक होता है। इन्हें बाजार से आसानी से खरीदा जा सकता है। पट्टी को काटा जा सकता है और एक उच्च थ्रूपुट परख के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेट के साथ संरेखित करने के लिए विभिन्न सरणियों में इकट्ठा किया जा सकता है। 96-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग प्रयोगशाला में समय और स्थान बचाने के लिए एक ही समय में विभिन्न परीक्षण स्थितियों की अनुमति देता है।

निष्कर्ष में, इस अध्ययन में स्थापित प्रणाली विभिन्न सूक्ष्मजीवों और कोशिकाओं पर विभिन्न फोटोडायनामिक प्रभावों की जांच करने के लिए सरल, आसान और बहुमुखी है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को एप्लाइड नैनोमेडिसिन के केंद्र से धन प्राप्त हुआ है, राष्ट्रीय चेंग कुंग विश्वविद्यालय शिक्षा मंत्रालय (एमओई) द्वारा उच्च शिक्षा स्प्राउट परियोजना के ढांचे के भीतर विशेष रुप से प्रदर्शित क्षेत्रों के अनुसंधान केंद्र कार्यक्रम से, और विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, ताइवान [MOST 109-2327-B-006-005] TW वोंग के लिए। जे.एच. हंग नेशनल चेंग कुंग यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल, ताइवान [NCKUH-11006018], और [MOST 110-2314-B-006-086-MY3] से धन स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microfuge tube Neptune, San Diego, USA #3745.x
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap Falcon, USA #352235
96-well plate Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan #16196
Aluminum foil sunmei, Tainan, Taiwan
Aluminum heat sink Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan BK-T220-0051-01 Disperses heat from the LED array.
Centrifuge Eppendorf, UK 5415R
Graph pad prism software GraphPad 8.0, San Diego, California, USA graphing and statistics software
Green light emitting diode (LED) strip Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan 2835 Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63
Incubator Yihder, Taipei, Taiwan LM-570D (R)
Light power meter Ophir, Jerusalem, Israel PD300-3W-V1-SENSOR,
Millex 0.22 μm filter Merck, NJ, USA SLGVR33RS
Multidrug-resistant Candida albicans Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan BCRC 21538/ATCC 10231 http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538
OD600 spectrophotometer Biochrom, London, UK Ultrospec 10
Rose Bengal Sigma-Aldrich, MO, USA 330000 stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium HIMEDIA, India M1363

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 181
गुलाब बंगाल-मध्यस्थता Photodynamic थेरेपी <em>कैंडिडा अल्बिकन्स</em> को बाधित करने के लिए
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