Summary
La crescente incidenza di Candida albicans resistente ai farmaci è un grave problema di salute in tutto il mondo. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) può offrire una strategia per combattere le infezioni fungine resistenti ai farmaci. Il presente protocollo descrive l'efficacia dell'aPDT mediata da Rose bengala su un ceppo di C. albicans multiresistente in vitro.
Abstract
L'infezione invasiva da Candida albicans è una significativa infezione fungina opportunistica negli esseri umani perché è uno dei colonizzatori più comuni dell'intestino, della bocca, della vagina e della pelle. Nonostante la disponibilità di farmaci antifungini, il tasso di mortalità della candidosi invasiva rimane ~ 50%. Sfortunatamente, l'incidenza di C. albicans resistente ai farmaci sta aumentando a livello globale. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) può offrire un trattamento alternativo o adiuvante per inibire la formazione di biofilm di C. albicans e superare la resistenza ai farmaci. L'aPDT mediato da Rose Bengal (RB) ha dimostrato un'efficace uccisione cellulare di batteri e C. albicans. In questo studio, viene descritta l'efficacia di RB-aPDT su C. albicans multiresistente ai farmaci. Una sorgente luminosa a diodi a emissione di luce verde (LED) fatta in casa è progettata per allinearsi con il centro di un pozzo di una piastra a 96 pozzetti. I lieviti sono stati incubati nei pozzetti con diverse concentrazioni di RB e illuminati con fluenze variabili di luce verde. Gli effetti di uccisione sono stati analizzati con il metodo di diluizione della piastra. Con una combinazione ottimale di luce e RB, è stata raggiunta l'inibizione della crescita a 3 log. Si è concluso che RB-aPDT potrebbe potenzialmente inibire C. albicans resistente ai farmaci.
Introduction
C. albicans colonizza nel tratto gastrointestinale e genito-urinario di individui sani e può essere rilevato come microbiota normale in circa il 50% degli individui1. Se si crea uno squilibrio tra l'ospite e l'agente patogeno, C. albicans è in grado di invadere e causare malattie. L'infezione può variare da infezioni locali della mucosa a insufficienza multiorgano2. In uno studio di sorveglianza multicentrico negli Stati Uniti, circa la metà degli isolati di pazienti con candidosi invasiva tra il 2009 e il 2017 è C. albicans3. La candidemia può essere associata ad alti tassi di morbilità, mortalità, degenza ospedaliera prolungata4. I Centri statunitensi di controllo e prevenzione delle malattie hanno riferito che circa il 7% di tutti i campioni di sangue di Candida testati sono resistenti al farmaco antifungino fluconazolo5. L'emergere di specie di Candida resistenti ai farmaci solleva la preoccupazione di sviluppare una terapia alternativa o adiuvante agli agenti antimicotici.
La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) prevede l'attivazione di un fotosensibilizzante specifico (PS) con la luce alla lunghezza d'onda di assorbimento di picco del PS6. Dopo l'eccitazione, il PS eccitato trasferisce la sua energia o elettroni alle molecole di ossigeno vicine e ritorna allo stato fondamentale. Durante questo processo, si formano specie reattive dell'ossigeno e ossigeno singoletto che causano danni alle cellule. aPDT è stato ampiamente utilizzato per uccidere i microrganismi dal 19907. Uno dei vantaggi dell'aPDT è che più organelli sono danneggiati in una cellula dall'ossigeno singoletto e / o dalle specie reattive dell'ossigeno (ROS) durante l'irradiazione; pertanto, la resistenza all'aPDT non è stata trovata fino ad oggi. Inoltre, un recente studio ha riportato che i batteri sopravvissuti dopo l'aPDT sono diventati più sensibili agli antibiotici8.
Le sorgenti luminose utilizzate in aPDT includono laser, lampade alogene metalliche con filtri, luce nel vicino infrarosso e diodi emettitori di luce (LED)9,10,11,12. Il laser fornisce un'elevata potenza luminosa, solitamente superiore a 0,5 W/cm2, che consente l'erogazione di una dose di luce elevata in un tempo molto breve. È stato ampiamente utilizzato nei casi in cui un tempo di trattamento più lungo è scomodo come aPDT per le infezioni orali. Lo svantaggio di un laser è che la sua dimensione spot di illuminazione è piccola, che va da poche centinaia di micrometri a 10 mm con un diffusore. Inoltre, le apparecchiature laser sono costose e richiedono una formazione specifica per funzionare. D'altra parte, l'area di irradiazione di una lampada alogena metallica con filtri è relativamente più grande13. Tuttavia, la lampada è troppo pesante e costosa. Le sorgenti luminose a LED sono diventate mainstream di aPDT in campo dermatologico perché è piccolo e meno costoso. L'area di irradiazione può essere relativamente grande con una disposizione array della lampadina a LED. L'intero viso può essere illuminato contemporaneamente9. Tuttavia, la maggior parte, se non tutte, le sorgenti luminose a LED disponibili oggi sono progettate per uso clinico. Potrebbe non essere adatto per esperimenti in un laboratorio perché occupa spazio e costoso. Abbiamo sviluppato un array di LED economico che è molto piccolo e può essere tagliato e assemblato da una striscia LED. I LED possono essere montati in diverse disposizioni per diversi progetti sperimentali. Diverse condizioni di aPDT possono essere completate in una piastra a 96 pozzetti o anche in una piastra a 384 pozzetti in un esperimento.
Rose bengal (RB) è un colorante colorato ampiamente utilizzato per migliorare la visualizzazione dei danni corneali negli occhi umani14. L'aPDT mediato da RB ha mostrato effetti di uccisione su Staphylococcus aureus, Escherichia coli e C. albicans con un'efficienza approssimativamente paragonabile a quella del blu di Toluidina O15. Questo studio dimostra un metodo per convalidare l'effetto di RB-aPDT su C. albicans multiresistente.
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Protocol
1. Preparazione del sistema aPDT
- Tagliare quattro diodi emettitori di luce verde (LED) da una striscia LED (vedere Tabella dei materiali) e allinearli con quattro pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (Figura 1).
NOTA: i LED sono stati disposti in un array 4 x 3. Il retro del LED è stato fatto aderire a un dissipatore di calore per disperdere il calore durante l'irradiazione. - Misurare la frequenza di fluenza11 del LED a 540 nm con un misuratore di potenza luminosa (vedi Tabella dei materiali). Vedere la Figura 1 supplementare per assicurarsi che la frequenza di fluenza del LED sia compresa tra 510-560 nm.
- Mettere un ventilatore elettrico accanto alla piastra durante l'irradiazione per mantenere la temperatura costante (25 ± 1 °C)11. Vedere la figura supplementare 2 per garantire che la temperatura costante del mezzo sia mantenuta durante l'irradiazione.
2. Coltivazione della forma di lievito di C. albicans
NOTA: Per gli esperimentiviene utilizzato un C. albicans multiresistente (BCRC 21538 / ATCC 10231), resistente alla maggior parte degli antifungini, incluso il fluconazolo.
- Determinare la sensibilità al farmaco antimicotico con un metodo di diffusione del disco seguendo il rapportoprecedentemente pubblicato 17.
- Coltiva C. albicans in forme di lievito, ife e pseudoife a seconda degli ambienti microecologici18.
NOTA: Le forme ife e pseudoife sono difficili per un calcolo accurato. La forma del lievito può essere calcolata con precisione al microscopio o con citometria a flusso. La temperatura durante la crescita cellulare determina la sua morfologia. A temperatura ambiente (25 °C), quasi tutte le cellule sono sotto forma di lievito. Una breve incubazione di 4 ore di C. albicans a 30 °C non ha influenzato la morfologia del lievito.
3. aPDT sul planctonico C. albicans
- Isolare una singola colonia di C. albicans da una piastra di agar con un anello sterile e aggiungerla a un mezzo di 3 mL di estratto di lievito peptone destrosio (YPD) (vedi Tabella dei materiali) in un tubo di vetro sterilizzato.
- Incubare il tubo a 25 ± 1 °C durante la notte (14-16 h) in un incubatore con una velocità di rotazione di 155 rpm per espandere C. albicans e mantenere il fungo in forma di lievito per una quantificazione accurata.
- Diluire la coltura notturna con un valore medio a un valore di OD600 di circa 0,5 a 30 ° C e ruotare ad una velocità di 155 giri / min per 4 ore per ottenere una fase di crescita logaritmica di C. albicans.
- Diluire nuovamente la coltura in fase logaritmica con mezzo YPD fresco a un valore OD600 di 0,65 (circa 1 x 107 unità formanti colonie, CFU/mL). Confermare la concentrazione finale con metodo di diluizione seriale su una piastra di agar8.
- Preparare una soluzione madre (4%) di Rose bengal (RB) sciogliendo la polvere in 1x PBS. Filtrare e sterilizzare con un filtro da 0,22 μm e conservarlo a 4 °C al buio. La concentrazione finale di lavoro di RB è dello 0,2%.
- Aggiungere 111 μL di RB al 2% a 1 mL di C. albicans in fase logaritmica in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e co-coltura in diversi punti temporali (0, 15 e 30 min) a temperatura ambiente per comprendere l'assorbimento di RB nelle cellule (Figura 2).
- Lavare la cocoltura tre volte con 1 mL di 1x PBS con centrifugazione a 16.100 x g per 2,5 min a temperatura ambiente.
NOTA: aPDT contiene quattro diverse condizioni: controllo assoluto (nessuna esposizione alla luce, nessun RB), controllo del buio (nessuna luce ma incuba con RB), controllo della luce (espone alla luce senza RB), aPDT (espone alla luce in presenza di RB). - Risospese il C. albicans in 1 mL di 1x PBS e allocarli in tre diversi pozzetti in una piastra da 96 pozzi per ogni condizione. Allineare i pozzetti con l'array di LED dopo il lavaggio.
- Nei gruppi esposti alla luce, accendere la ventola elettrica e la luce.
NOTA: Una diversa fluenza (J/cm2) può essere ottenuta esponendo i pozzetti a periodi di tempo variabili. Ad esempio, un'esposizione alla luce di 16,7 minuti arriva a 10 J / cm2 con una lampadina a LED da 10 mW / cm2 . - Dopo l'irradiazione, aggiungere 20 μL della soluzione di cocoltura da un pozzo a un tubo di centrifuga da 1,5 mL contenente 180 μL di 1x PBS per preparare una diluizione 10x. Inoltre, diluire dieci volte, seguendo successivamente lo stesso metodo.
- Far cadere tre gocce di 20 μL di ogni diluizione seriale su un quadrante di una piastra di agar YPD per ottenere colonie numerabili la piastra. Calcolare il CFU/mL moltiplicando le colonie per i fattori di diluizione3.
4. Analisi statistica
- Analizzare i dati raccolti utilizzando un software di grafica e statistica (vedi Tabella dei materiali).
- Rappresentare i dati per mezzo ± errore standard della media. Eseguire un'analisi ANOVA bidirezionale della varianza8 per valutare le differenze significative tra le diverse condizioni di test.
- Eseguire i test di confronto multipli di Tukey per i confronti a coppie8. Per ogni diverso trattamento, eseguire almeno tre esperimenti indipendenti. Considera il valore p < 0,05 statisticamente significativo.
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Representative Results
La Figura 1 mostra il sistema aPDT utilizzato nel presente studio. Poiché le alte temperature possono causare una significativa morte cellulare, l'array di LED viene raffreddato da una ventola elettrica e un dissipatore di calore viene utilizzato durante l'irradiazione per mantenere una temperatura costante a 25 ± 1 °C. L'effetto calore può essere scontato. Avere una distribuzione uniforme della luce è anche un importante fattore determinante per un aPDT di successo; pertanto, è fondamentale allineare la lampadina a LED al pozzo con precisione durante l'illuminazione. A causa della luminosità del LED, gli occhiali da sole devono essere equipaggiati prima di accendere la luce.
C. albicans viene immediatamente macchiato con RB come visualizzato dalla fluorescenza rossa sotto microscopia fluorescente (0 min in Figura 2). Si può vedere che l'RB entra nelle celle in modo dipendente dal tempo (Figura 2). Lo studio ha utilizzato un'incubazione RB di 15 minuti in cui, dopo 15 minuti, la maggior parte delle cellule sono state macchiate con RB. Una maggiore concentrazione di RB porta ad una fluorescenza più forte, producendo più radicali liberi per uccidere i funghi. Tuttavia, può anche causare una significativa morte cellulare nelle cellule normali; pertanto, la concentrazione di RB dello 0,2% è comunemente usata nelle cliniche. Pertanto, quella concentrazione esatta è stata scelta in questo studio.
PDT comporta l'attivazione di RB con la luce. Quando il RB attivato ritorna al suo stato fondamentale, trasferisce l'energia e gli elettroni all'ossigeno vicino per generare radicali liberi e ossigeno singoletto, con conseguente morte cellulare. La figura 3 non mostra morte cellulare in condizioni di assenza di irradiazione o assenza di RB. C. albicans è stato inibito in modo dose-dipendente dalla luce dopo irradiazione di luce verde in presenza di 0,2% RB (Figura 3). L'esposizione dei funghi alla luce verde con 30 J / cm2 ha comportato un'inibizione a 4 log (99,99%) della crescita cellulare.
Figura 1: Il sistema fotodinamico. (A) Un array di LED verdi è stato aderito a un dissipatore di calore metallico per disperdere il calore durante l'irradiazione. Un ventilatore elettrico è stato messo accanto alla sorgente luminosa per mantenere costante la temperatura a 25 ± 1 °C. (B) La luce è stata accesa. (C) I pozzetti di una piastra a 96 pozzi erano allineati con il centro del LED. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Lo studio dipendente dal tempo di Rose bengal che entra in C. albicans. Immagini in campo luminoso (A-D) e fluorescenza (E-H) dei C. albicans dopo 0-30 min co-coltivati con lo 0,2% di Rose bengal (RB). (A) e (E) Controllo senza RB co-coltivato. (B) e (F) Le cellule sono state immediatamente macchiate con lo 0,2% di RB. (C) e (G) Dopo 15 minuti di coltura, la maggior parte delle cellule ha mostrato fluorescenza rossa, indicando RB all'interno delle cellule. (D) e (H) Una fluorescenza più forte del RB è stata osservata con un'incubazione di 30 minuti. Barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetti della terapia fotodinamica antimicrobica su C. albicans multiresistenti. L'inibizione della crescita delle cellule dipende dalla fluenza della luce. L'esposizione di C. albicans a una fluenza di 10 J/cm2 ha inibito la crescita cellulare di 1,5 log, di 2 log con 20 J/cm2 e di 4 log con 30 J/cm2 rispettivamente in presenza dello 0,2% di Rose bengal. -RB, senza incubazione di Rose bengal; +RB, co-coltivato con Rose bengal per 15 min. I dati sono mezzi ± SEM di tre esperimenti separati eseguiti in duplice copia. I valori p sono indicati nella figura (test di confronto multipli di Tukey, ANOVA bidirezionale). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: Lo spettro di uscita LED. La frequenza di fluenza è stata misurata ogni 2 nm da 510-560 nm con un misuratore di potenza. I dati sono raggruppati da due esperimenti indipendenti con misurazioni triplicate. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: La temperatura del mezzo durante l'irradiazione. Una termocoppia è stata inserita in ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti riempita con brodo da 100 μL per misurare la temperatura. La temperatura era costante a 25 ± 1 °C. I dati vengono raggruppati da esperimenti duplicati con pozzi triplicati. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Risultati incoraggianti delle applicazioni cliniche di RB-PDT per la cheratite fungina sono stati riportati di recente19. Il picco di assorbimento di RB è a 450-650 nm. È essenziale determinare la frequenza di fluenza della sorgente luminosa per un aPDT di successo. Una fluenza elevata (di solito >100 J / cm2) è necessaria per trattare le cellule tumorali, mentre una fluenza inferiore dovrebbe trattare le lesioni infette6. Un'elevata fluenza significa un lungo tempo di esposizione che potrebbe non essere pratico in un ambiente clinico. Per il trattamento della cheratite micotica, nella comunità oftalmologica2 è concordato un 5,4 J/cm2. Un lungo tempo di incubazione di RB è anche scomodo per un paziente per ricevere un trattamento aPDT. Pertanto, è stato scelto un tempo di incubazione di 15 minuti per ulteriori esperimenti.
Alcuni passaggi sono fondamentali per un esperimento di successo. Le piastre di agar utilizzate per la coltura fungina sono state essiccate per 15-20 minuti in una cabina a flusso lamellare con il ventilatore acceso per ridurre l'umidità sulla superficie. Una superficie umida consentirebbe al flusso delle goccioline dei funghi di mescolarsi, impedendo la formazione di una singola colonia.
L'esecuzione di tutti gli esperimenti in penombra è vitale per impedire a RB di fotosbiancare. Il circuito elettrico era in una connessione parallela in modo che se si verificava un'interruzione in uno dei circuiti, gli apparecchi rimanenti non sarebbero stati interessati. Se ci sono risultati che superano la portata di altri, l'array può essere controllato prima per garantire che tutte le lampadine a LED siano in buone condizioni.
Una limitazione dell'utilizzo di una sorgente luminosa a LED è la sua dipendenza dalla temperatura. In un LED, il calore non viene prodotto dalla lampadina a LED stessa, ma generato alla giunzione del semiconduttore all'interno del dispositivo9. Poiché il sovraccarico dei LED al di sopra della loro corrente nominale evoca l'aumento della temperatura di giunzione, portando infine a un guasto prematuro della lampadina, è necessario dotare il dispositivo di un dissipatore di calore metallico per fornire un adeguato raffreddamento della giunzione. Un'altra limitazione dell'attuale design dell'array di LED è l'area riservata illuminata da ciascuna lampadina a LED, che ospita solo un singolo pozzo di una piastra da 96 pozzetti. Se è necessaria un'area di illuminazione più ampia, è necessaria una diversa disposizione delle lampadine a LED con distanze corrispondenti adeguate sopra o sotto la piastra per ottenere un'illuminazione uniforme.
I vantaggi di questo progetto di studio sono la facilità e l'impostazione economica del sistema fotodinamico per gli esperimenti aPDT. Può essere utilizzato in esperimenti riguardanti infezioni fungine. Virus e batteri possono anche essere testati nello stesso sistema. La striscia luminosa a LED può essere scelta tra un diverso colore di luce per correlarsi con i picchi di assorbimento di diversi fotosensibilizzatori, che vanno dallo spettro di luce visibile a quello del vicino infrarosso. Possono essere facilmente acquistati dal mercato. La striscia può essere tagliata e assemblata in diversi array per allinearla con una piastra a 96 pozzetti per un test ad alta produttività. L'uso di una piastra a 96 pozzetti consente diverse condizioni di test contemporaneamente per risparmiare tempo e spazio in laboratorio.
In conclusione, il sistema stabilito in questo studio è semplice, facile e versatile per esaminare diversi effetti fotodinamici su vari microrganismi e cellule.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dal Center of Applied Nanomedicine, dalla National Cheng Kung University dal Featured Areas Research Center Program nell'ambito del Higher Education Sprout Project dal Ministero dell'Istruzione (MOE) e dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan [MOST 109-2327-B-006-005] a TW Wong. J.H. Hung riconosce i finanziamenti del National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11006018] e [MOST 110-2314-B-006-086-MY3].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | Disperses heat from the LED array. |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
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