Summary
Die zunehmende Inzidenz von arzneimittelresistenten Candida albicans ist weltweit ein ernstes Gesundheitsproblem. Die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) kann eine Strategie zur Bekämpfung arzneimittelresistenter Pilzinfektionen bieten. Das vorliegende Protokoll beschreibt die bengalenvermittelte aPDT-Wirksamkeit von Rose auf einem multiresistenten C. albicans-Stamm in vitro.
Abstract
Die invasive Candida albicans-Infektion ist eine signifikante opportunistische Pilzinfektion beim Menschen, da sie einer der häufigsten Kolonisatoren von Darm, Mund, Vagina und Haut ist. Trotz der Verfügbarkeit von antimykotischen Medikamenten bleibt die Sterblichkeitsrate der invasiven Candidiasis ~ 50%. Leider nimmt die Inzidenz von arzneimittelresistenten C. albicans weltweit zu. Die antimikrobielle photodynamische Therapie (aPDT) kann eine alternative oder adjuvante Behandlung bieten, um die Bildung von C. albicans-Biofilmen zu hemmen und Arzneimittelresistenzen zu überwinden. Rose bengal (RB) vermittelte aPDT hat eine effektive Zellabtötung von Bakterien und C. albicans gezeigt. In dieser Studie wird die Wirksamkeit von RB-aPDT auf multiresistente C. albicans beschrieben. Eine hausgemachte grüne Leuchtdioden-Lichtquelle (LED) ist so konzipiert, dass sie sich an der Mitte einer Vertiefung einer 96-Well-Platte ausrichtet. Die Hefen wurden in den Brunnen mit unterschiedlichen Konzentrationen von RB inkubiert und mit unterschiedlichen Grünlichtfluanzen beleuchtet. Die Tötungseffekte wurden mit der Plattenverdünnungsmethode analysiert. Mit einer optimalen Kombination von Licht und RB wurde eine 3-log-Wachstumshemmung erreicht. Es wurde der Schluss gezogen, dass RB-aPDT möglicherweise arzneimittelresistente C. albicans hemmen könnte.
Introduction
C. albicans besiedelt im Magen-Darm- und Urogenitaltrakt gesunder Personen und kann bei etwa 50 Prozent der Individuen als normale Mikrobiota nachgewiesen werden1. Wenn ein Ungleichgewicht zwischen dem Wirt und dem Erreger entsteht, ist C. albicans in der Lage, einzudringen und Krankheiten zu verursachen. Die Infektion kann von lokalen Schleimhautinfektionen bis hin zu multiplem Organversagenreichen 2. In einer multizentrischen Surveillance-Studie in den USA ist etwa die Hälfte der Isolate von Patienten mit invasiver Candidiasis zwischen 2009 und 2017 C. albicans3. Candidämie kann mit hohen Morbiditätsraten, Mortalität, längerem Krankenhausaufenthaltverbunden sein 4. Die US-amerikanischen Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention berichteten, dass etwa 7% aller getesteten Candida-Blutproben gegen das AntimykotikumFluconazol 5 resistent sind. Das Auftreten arzneimittelresistenter Candida-Spezies wirft die Sorge auf, eine alternative oder adjuvante Therapie zu Antimykotika zu entwickeln.
Bei der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (aPDT) wird ein spezifischer Photosensibilisator (PS) mit Licht auf der maximalen Absorptionswellenlänge des PS6 aktiviert. Nach der Anregung überträgt das angeregte PS seine Energie oder Elektronen auf die nahe gelegenen Sauerstoffmoleküle und kehrt in den Grundzustand zurück. Während dieses Prozesses bilden sich reaktive Sauerstoffspezies und Singulett-Sauerstoff, die Zellschäden verursachen. aPDT wird seit den 1990er Jahren häufig zur Abtötung von Mikroorganismeneingesetzt 7. Einer der Vorteile von aPDT besteht darin, dass mehrere Organellen in einer Zelle durch Singulett-Sauerstoff und / oder reaktive Sauerstoffspezies (ROS) während der Bestrahlung beschädigt werden; Daher wurde bis heute kein Widerstand gegen aPDT gefunden. Darüber hinaus berichtete eine kürzlich durchgeführte Studie, dass die Bakterien, die nach der aPDT überlebten, empfindlicher auf Antibiotikareagierten 8.
Zu den in aPDT verwendeten Lichtquellen gehören Laser, Metallhalogenlampen mit Filtern, Nahinfrarotlicht und Leuchtdioden (LED) 9,10,11,12. Der Laser liefert eine hohe Lichtleistung, in der Regel größer als 0,5 W/cm2, die die Abgabe einer hohen Lichtdosis in sehr kurzer Zeit ermöglicht. Es wurde häufig in Fällen verwendet, in denen eine längere Behandlungszeit unbequem ist, wie z.B. aPDT für orale Infektionen. Der Nachteil eines Lasers ist, dass seine Spotgröße der Beleuchtung klein ist und von einigen hundert Mikrometern bis 10 mm mit einem Diffusor reicht. Darüber hinaus sind Lasergeräte teuer und erfordern eine spezielle Schulung für die Bedienung. Auf der anderen Seite ist die Bestrahlungsfläche einer Metallhalogenlampe mit Filtern relativ groß13. Allerdings ist die Lampe zu kräftig und teuer. LED-Lichtquellen sind im dermatologischen Bereich zum Mainstream der aPDT geworden, da sie klein und kostengünstiger sind. Die Bestrahlungsfläche kann bei einer Anordnung der LED-Glühbirne relativ groß sein. Das ganze Gesicht kann gleichzeitig beleuchtetwerden 9. Dennoch sind die meisten, wenn nicht alle, heute verfügbaren LED-Lichtquellen für den klinischen Einsatz konzipiert. Es ist möglicherweise nicht für Experimente in einem Labor geeignet, da es platzraubend und teuer ist. Wir haben ein preiswertes LED-Array entwickelt, das sehr klein ist und aus einem LED-Streifen geschnitten und montiert werden kann. Die LEDs können in verschiedene Anordnungen für unterschiedliche Versuchsdesigns eingebaut werden. Verschiedene Bedingungen der aPDT können in einer 96-Well-Platte oder sogar einer 384-Well-Platte in einem Experiment abgeschlossen werden.
Rose Bengal (RB) ist ein farbiger Farbstoff, der häufig verwendet wird, um die Visualisierung von Hornhautschäden in menschlichen Augen zu verbessern14. RB-vermittelte aPDT hat abtötende Wirkungen auf Staphylococcus aureus, Escherichia coli und C. albicans mit einer in etwa vergleichbaren Effizienz wie bei ToluidinblauO 15 gezeigt. Diese Studie zeigt eine Methode zur Validierung der Wirkung von RB-aPDT auf multiresistente C. albicans.
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Protocol
1. Vorbereitung des aPDT-Systems
- Schneiden Sie vier grüne Leuchtdioden (LEDs) aus einem LED-Streifen (siehe Materialtabelle) und richten Sie sie mit vier Vertiefungen einer 96-Well-Platte aus (Abbildung 1).
HINWEIS: Die LEDs wurden zu einem 4 x 3 Array angeordnet. Die Rückseite der LED wurde an einen Kühlkörper geklebt, um die Wärme während der Bestrahlung zu verteilen. - Messen Sie die Fluenzrate11 der LED bei 540 nm mit einem Lichtleistungsmesser (siehe Materialtabelle). Siehe ergänzende Abbildung 1 , um sicherzustellen, dass die Flussrate der LED zwischen 510-560 nm liegt.
- Stellen Sie während der Bestrahlung einen elektrischen Ventilator neben die Platte, um die konstante Temperatur (25 ± 1 °C) aufrechtzuerhalten11. Siehe ergänzende Abbildung 2 , um sicherzustellen, dass die konstante Temperatur des Mediums während der Bestrahlung aufrechterhalten wird.
2. Kultivierung der Hefeform von C. albicans
HINWEIS: Für die Experimente wird ein multiresistenter C. albicans (BCRC 21538/ATCC 10231) verwendet, der gegen die meisten Antimykotika, einschließlich Fluconazol, resistent ist16.
- Bestimmen Sie die Empfindlichkeit des Antimykotikums mit einer Bandscheibendiffusionsmethode gemäß dem zuvor veröffentlichten Bericht17.
- Züchten Sie C. albicans in Hefe-, Hyphen- und Pseudohyphenformen, abhängig von den mikroökologischen Umgebungen18.
HINWEIS: Die Hyphen und Pseudohyphenformen sind für eine genaue Berechnung schwierig. Die Hefeform kann unter dem Mikroskop oder mit Durchflusszytometrie präzise berechnet werden. Die Temperatur während des Zellwachstums bestimmt ihre Morphologie. Bei Raumtemperatur (25 °C) sind fast alle Zellen hefeform. Eine 4 h kurze Inkubation von C. albicans bei 30 °C hatte keinen Einfluss auf seine Hefemorphologie.
3. aPDT auf planktonischem C. albicans
- Isolieren Sie eine einzelne Kolonie von C. albicans aus einer Agarplatte mit einer sterilen Schleife und fügen Sie sie in einem sterilisierten Glasröhrchen zu einem 3 ml Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Medium (YPD) hinzu (siehe Materialtabelle).
- Inkubieren Sie das Rohr bei 25 ± 1 °C über Nacht (14-16 h) in einem Inkubator mit einer Drehzahl von 155 U / min, um C. albicans zu erweitern und den Pilz in Hefeform für eine genaue Quantifizierung zu erhalten.
- Verdünnen Sie die Übernachtkultur mit einem mittleren bis zu einem OD600-Wert von etwa 0,5 bei 30 ° C und drehen Sie sie mit einer Geschwindigkeit von 155 U / min für 4 h, um eine logarithmische Wachstumsphase von C. albicans zu erreichen.
- Verdünnen Sie die Log-Phasenkultur erneut mit frischem YPD-Medium auf einen OD600-Wert von 0,65 (ca. 1 x 107 koloniebildende Einheiten, CFU/ml). Bestätigen Sie die Endkonzentration durch serielle Verdünnungsmethode auf einer Agarplatte8.
- Bereiten Sie eine Stammlösung (4%) Rose bengal (RB) vor, indem Sie das Pulver in 1x PBS auflösen. Filtern und sterilisieren Sie es mit einem 0,22 μm Filter und lagern Sie es bei 4 °C im Dunkeln. Die endgültige Arbeitskonzentration von RB beträgt 0,2%.
- Fügen Sie 111 μL von 2% RB zu 1 ml Log-Phase C. albicans in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Kokultur zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 15 und 30 min) bei Raumtemperatur hinzu, um die Absorption von RB in den Zellen zu verstehen (Abbildung 2).
- Waschen Sie die Co-Kultur dreimal mit 1 ml 1x PBS mit Zentrifugation bei 16.100 x g für 2,5 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: aPDT enthält vier verschiedene Bedingungen: absolute Kontrolle (keine Lichteinwirkung, keine RB), Dunkelsteuerung (kein Licht, sondern inkubiert mit RB), Lichtsteuerung (setzt Licht ohne RB aus), aPDT (setzt Licht in Gegenwart von RB aus). - Suspendieren Sie die C. albicans in 1 ml von 1x PBS und weisen Sie sie drei verschiedenen Vertiefungen in einer 96-Well-Platte für jeden Zustand zu. Richten Sie die Vertiefungen nach dem Waschen mit dem LED-Array aus.
- Schalten Sie in lichtexponierten Gruppen den elektrischen Lüfter und das Licht ein.
HINWEIS: Eine andere Fluenz (J/cm2) kann erreicht werden, indem die Bohrlöcher unterschiedlichen Zeiträumen ausgesetzt werden. Zum Beispiel kommt eine 16,7-minütige Lichtbelichtung auf 10 J / cm 2 mit einer 10 mW / cm2 LED-Glühbirne. - Nach der Bestrahlung 20 μL der Co-Kulturlösung aus einer Vertiefung in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit 180 μL 1x PBS geben, um eine 10-fache Verdünnung vorzubereiten. Weiter zehnmal verdünnen, anschließend nach der gleichen Methode.
- Lassen Sie drei Tropfen von 20 μL jeder seriellen Verdünnung auf einen Quadranten einer YPD-Agarplatte fallen, um zählbare Kolonien der Platte zu erreichen. Berechnen Sie die KBE/ml, indem Sie die Kolonien mit den Verdünnungsfaktoren3 multiplizieren.
4. Statistische Auswertung
- Analysieren Sie die gesammelten Daten mit einer Grafik- und Statistiksoftware (siehe Materialverzeichnis).
- Zeigen Sie Daten nach Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts an. Führen Sie eine bidirektionale ANOVA-Analyse der Varianz 8 durch, um signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Testbedingungen zu bewerten.
- Führen Sie Tukeys mehrere Vergleichstests für paarweise Vergleichedurch 8. Führen Sie für jede verschiedene Behandlung mindestens drei unabhängige Experimente durch. Betrachten Sie den p-Wert < 0,05 statistisch signifikant.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt das aPDT-System, das in der vorliegenden Studie verwendet wird. Da hohe Temperaturen zu einem signifikanten Zelltod führen können, wird das LED-Array durch einen elektrischen Lüfter gekühlt, und während der Bestrahlung wird ein Kühlkörper verwendet, um eine konstante Temperatur bei 25 ± 1 ° C aufrechtzuerhalten. Der Hitzeeffekt kann diskontiert werden. Eine gleichmäßige Lichtverteilung ist auch ein wichtiger bestimmender Faktor für eine erfolgreiche aPDT; Daher ist es wichtig, die LED-Glühbirne während der Beleuchtung genau auf den Brunnen auszurichten. Aufgrund der Helligkeit der LED muss vor dem Einschalten des Lichts eine Sonnenbrille angebracht werden.
C. albicans wird sofort mit RB gefärbt, wie durch rote Fluoreszenz unter Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht (0 min in Abbildung 2). Es ist zu erkennen, dass die RB zeitabhängig in die Zellen eindringt (Abbildung 2). Die Studie verwendete eine 15-minütige RB-Inkubation, bei der nach 15 Minuten die meisten Zellen mit RB gefärbt wurden. Eine höhere Konzentration von RB führt zu einer stärkeren Fluoreszenz und produziert mehr freie Radikale, um Pilze abzutöten. Es kann jedoch auch zu einem signifikanten Zelltod in normalen Zellen führen; Daher wird die RB-Konzentration von 0,2% häufig in Kliniken verwendet. Daher wurde in dieser Studie genau diese Konzentration gewählt.
PDT beinhaltet die Aktivierung von RB mit Licht. Wenn die aktivierte RB in ihren Grundzustand zurückkehrt, überträgt sie die Energie und Elektronen auf den nahe gelegenen Sauerstoff, um freie Radikale und Singulett-Sauerstoff zu erzeugen, was zum Zelltod führt. Abbildung 3 zeigt keinen Zelltod unter der Bedingung keine Bestrahlung oder Abwesenheit von RB. C. albicans wurde nach einer Grünlichtbestrahlung in Gegenwart von 0,2% RB lichtdosisabhängig gehemmt (Abbildung 3). Die Exposition der Pilze gegenüber grünem Licht mit 30 J / cm2 führte zu einer 4-log (99,99%) Hemmung des Zellwachstums.
Abbildung 1: Das photodynamische System . (A) Ein grünes LED-Array wurde an einen Metallkühlkörper geklebt, um die Wärme während der Bestrahlung zu verteilen. Ein elektrischer Ventilator wurde neben der Lichtquelle angebracht, um die Temperatur konstant bei 25 ± 1 °C zu halten. (B) Das Licht wurde eingeschaltet. (C) Die Vertiefungen einer 96-Well-Platte wurden mit der Mitte der LED ausgerichtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Die zeitabhängige Studie von Rose bengal, die in C. albicans eindringt. Hellfeld- (A-D) und Fluoreszenzbilder (E-H) der C. albicans nach 0-30 min kokultiviert mit 0,2% Rose bengal (RB). (A) und (E) Kontrolle ohne RB co-cultured. (B) und (F) Die Zellen wurden sofort mit 0,2% RB gefärbt. (C) und (G) Nach 15 Minuten Kultur zeigten die meisten Zellen eine rote Fluoreszenz, was auf eine RB in den Zellen hinweist. (D) und (H) Eine stärkere Fluoreszenz der RB wurde mit einer 30-minütigen Inkubation festgestellt. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Auswirkungen der antimikrobiellen photodynamischen Therapie auf multiresistente C. albicans. Die Wachstumshemmung von Zellen hängt von der Lichtfluenz ab. Die Exposition von C. albicans gegenüber einer Fluenz von 10 J/cm 2 hemmte das Zellwachstum durch 1,5 Stämme, durch 2 Stämme mit 20 J/cm2 und 4 Stämme mit 30 J/cm 2 jeweils in Gegenwart von 0,2 % Rosenbengalen. -RB, ohne Rosenbengalen-Inkubation; +RB, zusammen mit Rose bengal für 15 min. Daten sind Mittel ± SEM von drei separaten Experimenten, die doppelt durchgeführt werden. p-Werte sind in der Abbildung angegeben (Tukey's multiple comparison tests, two-way ANOVA). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Das LED-Ausgangsspektrum. Die Fluenzrate wurde alle 2 nm von 510-560 nm mit einem Leistungsmesser gemessen. Die Daten aus zwei unabhängigen Experimenten mit dreifachen Messungen werden gepoolt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Die Temperatur des Mediums während der Bestrahlung. Ein Thermoelement wurde in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte eingeführt, die mit 100-μL-Brühe gefüllt war, um die Temperatur zu messen. Die Temperatur lag konstant bei 25 ± 1 °C. Die Daten werden aus doppelten Experimenten mit dreifachen Bohrungen gepoolt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Ermutigende Ergebnisse der klinischen Anwendungen von RB-PDT bei Pilzkeratitis wurden kürzlichberichtet 19. Der Absorptionspeak von RB liegt bei 450-650 nm. Es ist wichtig, die Fluenzrate der Lichtquelle für eine erfolgreiche aPDT zu bestimmen. Eine hohe Fluenz (normalerweise >100 J / cm2) ist erforderlich, um Krebszellen zu behandeln, während eine niedrigere Fluenz zur Behandlung infizierter Läsionen6 erwartet wird. Eine hohe Fluenz bedeutet eine lange Expositionszeit, die in einem klinischen Umfeld möglicherweise nicht praktikabel ist. Zur Behandlung der mykotischen Keratitis wird in der ophthalmologischen Gemeinschaft20 ein 5,4 J/cm2 vereinbart. Eine lange Inkubationszeit von RB ist auch für einen Patienten unbequem, um eine aPDT-Behandlung zu erhalten. So wurde für weitere Experimente eine Inkubationszeit von 15 min gewählt.
Einige Schritte sind entscheidend für ein erfolgreiches Experiment. Die Agarplatten, die für die Pilzkultur verwendet wurden, wurden 15-20 Minuten lang in einer Lamellenströmungskabine mit eingeschaltetem Ventilator getrocknet, um die Feuchtigkeit auf der Oberfläche zu reduzieren. Eine feuchte Oberfläche würde es ermöglichen, dass sich die Pilztröpfchen vermischen und die Bildung einer einzigen Kolonie verhindern.
Die Durchführung aller Experimente bei schwachem Licht ist wichtig, um zu verhindern, dass RB photobleicht. Der Stromkreis war in einer Parallelschaltung, so dass, wenn ein Bruch in einem der Stromkreise passierte, die verbleibenden Geräte nicht betroffen waren. Wenn es Ergebnisse gibt, die die Reichweite anderer übertreffen, kann das Array zuerst überprüft werden, um sicherzustellen, dass alle LED-Glühbirnen in guter Funktion sind.
Eine Einschränkung bei der Verwendung einer LED-Lichtquelle ist ihre Temperaturabhängigkeit. In einer LED wird Wärme nicht von der LED-Glühbirne selbst erzeugt, sondern am Halbleiterübergang innerhalb des Bauelementserzeugt 9. Da das Übersteuern von LEDs über ihrem Nennstrom den Anstieg der Sperrschichttemperatur hervorruft, was schließlich zu einem vorzeitigen Ausfall der Glühbirne führt, ist es notwendig, das Gerät mit einem Metallkühlkörper auszustatten, um eine geeignete Kühlung der Verbindung zu gewährleisten. Eine weitere Einschränkung des derzeitigen Designs des LED-Arrays ist der eingeschränkte Bereich, der von jeder LED-Glühbirne beleuchtet wird und nur eine einzige Vertiefung einer 96-Well-Platte beherbergt. Wenn eine größere Beleuchtungsfläche benötigt wird, ist eine andere Anordnung der LED-Lampen mit den entsprechenden Abständen über oder unter der Platte erforderlich, um eine gleichmäßige Ausleuchtung zu erreichen.
Die Vorteile dieses Studiendesigns sind der einfache und kostengünstige Aufbau des photodynamischen Systems für aPDT-Experimente. Es kann in Experimenten zu Pilzinfektionen eingesetzt werden. Auch Viren und Bakterien können im selben System getestet werden. Der LED-Lichtstreifen kann aus einer anderen Lichtfarbe ausgewählt werden, um mit den Absorptionsspitzen verschiedener Photosensibilisatoren zu korrelieren, die vom sichtbaren bis zum nahinfraroten Lichtspektrum reichen. Sie können leicht auf dem Markt gekauft werden. Das Band kann geschnitten und in verschiedene Arrays zusammengesetzt werden, um sich mit einer 96-Well-Platte für einen Assay mit hohem Durchsatz auszurichten. Die Verwendung einer 96-Well-Platte ermöglicht unterschiedliche Testbedingungen gleichzeitig, um Zeit und Platz im Labor zu sparen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das etablierte System in dieser Studie einfach, leicht und vielseitig ist, um verschiedene photodynamische Effekte auf verschiedene Mikroorganismen und Zellen zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Center of Applied Nanomedicine, der National Cheng Kung University vom Featured Areas Research Center Program im Rahmen des Higher Education Sprout Project vom Bildungsministerium (MOE) und vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan [MOST 109-2327-B-006-005] an TW Wong finanziert. J.H. Hung erkennt die Finanzierung durch das National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11006018], und [MOST 110-2314-B-006-086-MY3] an.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | Disperses heat from the LED array. |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
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