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Immunology and Infection

Terapia fotodinámica mediada por rosa de Bengala para inhibir Candida albicans

Published: March 24, 2022 doi: 10.3791/63558
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 5, 3,6, 7, 7, 3, 3,8,9
1Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Ophthalmology, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Department of Dermatology, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 4Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 5Department of Dermatology, Fu Jen Catholic University Hospital, Fu Jen Catholic University, 6Institute of Clinical Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 7School of Medicine, National Cheng Kung University, 8Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 9Center of Applied Nanomedicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

La creciente incidencia de Candida albicans resistente a los medicamentos es un grave problema de salud en todo el mundo. La terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) puede ofrecer una estrategia para luchar contra las infecciones fúngicas resistentes a los medicamentos. El presente protocolo describe la eficacia de la aPDT mediada por Rose bengal en una cepa de C. albicans multirresistente in vitro.

Abstract

La infección invasiva por Candida albicans es una infección fúngica oportunista significativa en humanos porque es uno de los colonizadores más comunes del intestino, la boca, la vagina y la piel. A pesar de la disponibilidad de medicamentos antimicóticos, la tasa de mortalidad de la candidiasis invasiva sigue siendo de ~ 50%. Desafortunadamente, la incidencia de C. albicans resistente a los medicamentos está aumentando a nivel mundial. La terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) puede ofrecer un tratamiento alternativo o adyuvante para inhibir la formación de biopelículas de C. albicans y superar la resistencia a los medicamentos. La aPDT mediada por rosa de bengala (RB) ha demostrado una eliminación celular efectiva de bacterias y C. albicans. En este estudio, se describe la eficacia de RB-aPDT en C. albicans multirresistente . Una fuente de luz de diodo emisor de luz verde (LED) casera está diseñada para alinearse con el centro de un pozo de una placa de 96 pocillos. Las levaduras se incubaron en los pozos con diferentes concentraciones de RB y se iluminaron con diferentes fluencias de luz verde. Los efectos de matanza se analizaron mediante el método de dilución de placas. Con una combinación óptima de luz y RB, se logró la inhibición del crecimiento de 3 log. Se concluyó que RB-aPDT podría inhibir potencialmente la C. albicans resistente a los medicamentos.

Introduction

C. albicans coloniza en los tractos gastrointestinal y genitourinario de individuos sanos y puede detectarse como microbiota normal en aproximadamente el 50 por ciento de los individuos1. Si se crea un desequilibrio entre el huésped y el patógeno, C. albicans es capaz de invadir y causar enfermedades. La infección puede variar desde infecciones locales de la membrana mucosa hasta insuficiencia orgánica múltiple2. En un estudio de vigilancia multicéntrico en los Estados Unidos, alrededor de la mitad de los aislamientos de pacientes con candidiasis invasiva entre 2009 y 2017 es C. albicans3. La candidemia puede asociarse con altas tasas de morbilidad, mortalidad, estancia hospitalaria prolongada4. Los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos informaron que aproximadamente el 7% de todas las muestras de sangre de Candida analizadas son resistentes al medicamento antimicótico fluconazol5. La aparición de especies de Candida resistentes a los medicamentos plantea la preocupación de desarrollar una terapia alternativa o adyuvante a los agentes antimicóticos.

La terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) consiste en activar un fotosensibilizador (PS) específico con luz en la longitud de onda de absorción máxima de la PS6. Después de la excitación, el PS excitado transfiere su energía o electrones a las moléculas de oxígeno cercanas y regresa al estado fundamental. Durante este proceso, se forman especies reactivas de oxígeno y oxígeno singlete y causan daño celular. La aPDT se ha utilizado ampliamente para matar microorganismos desde la década de 19907. Uno de los beneficios de la aPDT es que múltiples orgánulos se dañan en una célula por oxígeno singlete y / o especies reactivas de oxígeno (ROS) durante la irradiación; por lo tanto, la resistencia a la APDT no se ha encontrado hasta hoy. Además, un estudio reciente informó que las bacterias que sobrevivieron después de la aPDT se volvieron más sensibles a los antibióticos8.

Las fuentes de luz utilizadas en aPDT incluyen láseres, lámparas halógenas de metal con filtros, luz infrarroja cercana y diodo emisor de luz (LED)9,10,11,12. El láser proporciona una alta potencia de luz, generalmente mayor que 0,5 W / cm2, que permite la entrega de una dosis de luz alta en muy poco tiempo. Se ha utilizado ampliamente en los casos en que un tiempo de tratamiento más largo es inconveniente, como la APDT para las infecciones orales. El inconveniente de un láser es que su tamaño de punto de iluminación es pequeño, que va desde unos pocos cientos de micrómetros hasta 10 mm con un difusor. Además, los equipos láser son caros y necesitan capacitación específica para operar. Por otro lado, el área de irradiación de una lámpara halógena de metal con filtros es relativamente más grande13. Sin embargo, la lámpara es demasiado pesada y cara. Las fuentes de luz LED se han convertido en la corriente principal de aPDT en el campo dermatológico porque es pequeña y menos costosa. El área de irradiación puede ser relativamente grande con una disposición de matriz de la bombilla LED. Toda la cara se puede iluminar al mismo tiempo9. Sin embargo, la mayoría, si no todas, las fuentes de luz LED disponibles hoy en día están diseñadas para uso clínico. Puede que no sea adecuado para experimentos en un laboratorio porque ocupa espacio y es costoso. Desarrollamos una matriz de LED económica que es muy pequeña y se puede cortar y ensamblar a partir de una tira de LED. Los LED se pueden instalar en diferentes arreglos para diferentes diseños experimentales. Se pueden completar diferentes condiciones de aPDT en una placa de 96 pocillos o incluso una placa de 384 pocillos en un experimento.

Rose bengal (RB) es un tinte de color ampliamente utilizado para mejorar la visualización de los daños corneales en los ojos humanos14. La aPDT mediada por RB ha demostrado efectos asesinos sobre Staphylococcus aureus, Escherichia coli y C. albicans con una eficiencia aproximadamente comparable a la del azul de toluidina O15. Este estudio demuestra un método para validar el efecto de RB-aPDT sobre C. albicans multirresistente.

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Protocol

1. Preparación del sistema aPDT

  1. Corte cuatro diodos emisores de luz verde (LED) de una tira de LED (consulte la Tabla de materiales) y alinee con cuatro pocillos de una placa de 96 pocillos (Figura 1).
    NOTA: Los LED se organizaron en una matriz de 4 x 3. La parte posterior del LED se adhirió a un disipador de calor para dispersar el calor durante la irradiación.
  2. Mida la velocidad de fluencia11 del LED a 540 nm con un medidor de potencia de luz (consulte la Tabla de materiales). Consulte la Figura suplementaria 1 para asegurarse de que la velocidad de fluencia del LED esté entre 510-560 nm.
  3. Coloque un ventilador eléctrico junto a la placa durante la irradiación para mantener la temperatura constante (25 ± 1 °C)11. Consulte la Figura suplementaria 2 para garantizar que la temperatura constante del medio se mantenga durante la irradiación.

2. Cultivo de la forma de levadura de C. albicans

NOTA: Para los experimentos se utiliza un C. albicans multirresistente (BCRC 21538/ATCC 10231), resistente a la mayoría de los antifúngicos, incluido el fluconazol16.

  1. Determinar la sensibilidad al fármaco antimicótico con un método de difusión en disco siguiendo el informe publicado previamente17.
  2. Cultivar C. albicans en formas de levadura, hifas y pseudohifas dependiendo de los ambientes microecológicos18.
    NOTA: Las formas de hifas y pseudohifas son difíciles para un cálculo preciso. La forma de levadura se puede calcular con precisión bajo un microscopio o con citometría de flujo. La temperatura durante el crecimiento celular determina su morfología. A temperatura ambiente (25 °C), casi todas las células son en forma de levadura. Una incubación corta de 4 h de C. albicans a 30 °C no afectó su morfología de levadura.

3. aPDT sobre C. albicans planctónica

  1. Aislar una sola colonia de C. albicans de una placa de agar con un asa estéril y agregarla a un medio de peptona dextrosa (YPD) de extracto de levadura de 3 ml (ver Tabla de materiales) en un tubo de vidrio esterilizado.
    1. Incubar el tubo a 25 ± 1 °C durante la noche (14-16 h) en una incubadora con una velocidad de rotación de 155 rpm para expandir C. albicans y mantener el hongo en forma de levadura para una cuantificación precisa.
  2. Diluir el cultivo durante la noche con un valor medio a un valor de OD600 de alrededor de 0,5 a 30 ° C y girar a una velocidad de 155 rpm durante 4 h para lograr una fase de crecimiento logarítmico de C. albicans.
  3. Diluya de nuevo el cultivo en fase logarítmica con medio YPD fresco a un valor OD600 de 0,65 (alrededor de 1 x 107 unidades formadoras de colonias, UFC/ml). Confirme la concentración final mediante el método de dilución en serie en una placa de agar8.
  4. Prepare una solución madre (4%) de Rosa de bengala (RB) disolviendo el polvo en 1x PBS. Filtrar y esterilizar con un filtro de 0,22 μm y almacenarlo a 4 °C en la oscuridad. La concentración final de trabajo de RB es del 0,2%.
  5. Agregue 111 μL de RB al 2% a 1 ml de C. albicans de fase logarítmica en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y cocultivo en diferentes puntos de tiempo (0, 15 y 30 min) a temperatura ambiente para comprender la absorción de RB en las células (Figura 2).
  6. Lavar el cocultivo tres veces con 1 mL de 1x PBS con centrifugación a 16.100 x g durante 2,5 min a temperatura ambiente.
    NOTA: aPDT contiene cuatro condiciones diferentes: control absoluto (sin exposición a la luz, sin RB), control oscuro (sin luz pero incuba con RB), control de la luz (expone a la luz sin RB), aPDT (expone a la luz en presencia de RB).
  7. Resuspender los C. albicans en 1 mL de 1x PBS y asignarlos en tres pozos diferentes en una placa de 96 pocillos para cada condición. Alinee los pozos con la matriz de LED después del lavado.
  8. En grupos expuestos a la luz, encienda el ventilador eléctrico y encienda la luz.
    NOTA: Se puede lograr una fluencia diferente (J/cm2) exponiendo los pozos a períodos de tiempo variables. Por ejemplo, una exposición a la luz de 16,7 minutos llega a 10 J/cm2 con una bombilla LED de 10 mW/cm2 .
  9. Después de la irradiación, agregue 20 μL de la solución de cocultivo de un pocillo a un tubo centrífugo de 1,5 ml que contenga 180 μL de 1x PBS para preparar una dilución de 10x. Además, diluya diez veces, siguiendo posteriormente el mismo método.
  10. Deje caer tres gotas de 20 μL de cada dilución en serie en un cuadrante de una placa de agar YPD para lograr colonias contables de la placa. Calcule la UFC/ml multiplicando las colonias por los factores de dilución3.

4. Análisis estadístico

  1. Analizar los datos recopilados utilizando un software de gráficos y estadísticas (ver Tabla de Materiales).
  2. Representar los datos por medio ± error estándar de la media. Realizar un análisis ANOVA bidireccional de la varianza8 para evaluar las diferencias significativas entre las diferentes condiciones de prueba.
  3. Realice las pruebas de comparación múltiple de Tukey para comparaciones por pares8. Para cada tratamiento diferente, realice al menos tres experimentos independientes. Considere el valor p < 0,05 estadísticamente significativo.

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Representative Results

La Figura 1 muestra el sistema aPDT que se está utilizando en el presente estudio. Dado que las altas temperaturas pueden causar una muerte celular significativa, la matriz de LED se enfría mediante un ventilador eléctrico y se utiliza un disipador de calor durante la irradiación para mantener una temperatura constante a 25 ± 1 ° C. El efecto calor se puede descontar. Tener una distribución uniforme de la luz también es un factor determinante importante para un aPDT exitoso; por lo tanto, es fundamental alinear la bombilla LED con el pozo con precisión durante la iluminación. Debido al brillo del LED, las gafas de sol deben equiparse antes de encender la luz.

C. albicans se tiñe inmediatamente con RB como se visualiza por fluorescencia roja bajo microscopía fluorescente (0 min en la Figura 2). Se puede ver que el RB entra en las células de una manera dependiente del tiempo (Figura 2). El estudio utilizó una incubación de RB de 15 minutos en la que, después de 15 minutos, la mayoría de las células se tiñeron con RB. Una mayor concentración de RB conduce a una fluorescencia más fuerte, produciendo más radicales libres para matar hongos. Sin embargo, también puede causar una muerte celular significativa en las células normales; por lo tanto, la concentración de RB al 0,2% se usa comúnmente en las clínicas. Por lo tanto, esa concentración exacta fue elegida en este estudio.

PDT implica la activación de RB con luz. Cuando el RB activado regresa a su estado fundamental, transfiere la energía y los electrones al oxígeno cercano para generar radicales libres y oxígeno singlete, lo que resulta en la muerte celular. La Figura 3 no muestra muerte celular bajo la condición de no irradiación o ausencia de RB. C. albicans se inhibió de manera ligera dependiente de la dosis después de la irradiación de luz verde en presencia de RB al 0,2% (Figura 3). Exponer los hongos a luz verde con 30 J/cm2 resultó en una inhibición del crecimiento celular de 4 log (99,99%).

Figure 1
Figura 1: El sistema fotodinámico. (A) Se adhirió una matriz de LED verdes a un disipador de calor metálico para dispersar el calor durante la irradiación. Se colocó un ventilador eléctrico junto a la fuente de luz para mantener la temperatura constante a 25 ± 1 ° C. (B) La luz se encendió. (C) Los pozos de una placa de 96 pozos se alinearon con el centro del LED. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: El estudio dependiente del tiempo de Rose bengal entrando en C. albicans. Imágenes de campo brillante (A-D) y fluorescencia (E-H) de C. albicans después de 0-30 min cocultivadas con 0.2% de rosa de bengala (RB). (A) y (E) Control sin RB co-cultivado. (B) y (F) Las células se tiñeron inmediatamente con 0,2% de RB. (C) y (G) Después de 15 min de cultivo, la mayoría de las células mostraron fluorescencia roja, lo que indica RB dentro de las células. (D) y (H) Se observó una fluorescencia más fuerte del RB con una incubación de 30 minutos. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Efectos de la terapia fotodinámica antimicrobiana sobre C. albicans multirresistente. La inhibición del crecimiento de las células depende de la fluencia de la luz. La exposición de C. albicans a una fluencia de 10 J/cm2 inhibió el crecimiento celular en 1,5 troncos, en 2 troncos con 20 J/cm2 y en 4 troncos con 30 J/cm2 respectivamente en presencia de 0,2% de rosa de bengala. -RB, sin incubación de rosa de bengala; +RB, co-cultivado con Rose bengal durante 15 min. Los datos son medios ± SEM de tres experimentos separados realizados por duplicado. Los valores de p se indican en la figura (pruebas de comparación múltiple de Tukey, ANOVA bidireccional). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: El espectro de salida del LED. La tasa de fluencia se midió cada 2 nm de 510-560 nm con un medidor de potencia. Los datos se agrupan a partir de dos experimentos independientes con mediciones triplicadas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: La temperatura del medio durante la irradiación. Se insertó un termopar en cada pozo de una placa de 96 pocillos llena de caldo de 100 μL para medir la temperatura. La temperatura era constante a 25 ± 1 °C. Los datos se agrupan a partir de experimentos duplicados con pozos triplicados. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Recientemente se han reportado resultados alentadores de aplicaciones clínicas de RB-PDT para la queratitis fúngica19. El pico de absorción de RB está en 450-650 nm. Es esencial determinar la tasa de fluencia de la fuente de luz para una aPDT exitosa. Se requiere una fluencia alta (generalmente >100 J/cm2) para tratar las células cancerosas, mientras que se espera una fluencia más baja para tratar las lesiones infectadas6. Una alta fluencia significa un largo tiempo de exposición que puede no ser práctico en un entorno clínico. Para el tratamiento de la queratitis micótica, se acuerda un 5,4 J/cm2 en la comunidad oftalmológica20. Un largo tiempo de incubación de RB también es un inconveniente para que un paciente reciba tratamiento con aPDT. Por lo tanto, se eligió un tiempo de incubación de 15 minutos para experimentos posteriores.

Algunos pasos son críticos para un experimento exitoso. Las placas de agar utilizadas para el cultivo de hongos se secaron durante 15-20 minutos en una cabina de flujo lamelar con el ventilador encendido para reducir la humedad en la superficie. Una superficie húmeda permitiría que el flujo de las gotas de hongos se mezcle, evitando la formación de una sola colonia.

Ejecutar todos los experimentos con luz tenue es vital para evitar que RB se fotoblanque. El circuito eléctrico estaba en una conexión paralela de modo que si ocurría una rotura en uno de los circuitos, los aparatos restantes no se verían afectados. Si hay resultados que superan el rango de otros, la matriz se puede verificar primero para garantizar que todas las bombillas LED estén en buen funcionamiento.

Una limitación de utilizar una fuente de luz LED es su dependencia de la temperatura. En un LED, el calor no es producido por la bombilla LED en sí, sino que se genera en la unión del semiconductor dentro del dispositivo9. Dado que el sobrealimentación de los LED por encima de su corriente nominal evoca el aumento de la temperatura de la unión, lo que eventualmente conduce a una falla prematura de la bombilla, es necesario equipar el dispositivo con un disipador de calor de metal para proporcionar un enfriamiento adecuado de la unión. Otra limitación del diseño actual de la matriz LED es el área restringida iluminada por cada bombilla LED, que solo acomoda un solo pozo de una placa de 96 pocillos. Si se necesita un área de iluminación más grande, se necesita una disposición diferente de bombillas LED con las distancias correspondientes adecuadas por encima o por debajo de la placa para lograr una iluminación uniforme.

Las ventajas de este diseño de estudio son la facilidad y la configuración económica del sistema fotodinámico para experimentos aPDT. Se puede utilizar en experimentos relacionados con infecciones por hongos. Los virus y las bacterias también se pueden probar en el mismo sistema. La tira de luz LED se puede elegir entre un color de luz diferente para correlacionarse con los picos de absorción de diferentes fotosensibilizadores, que van desde el espectro de luz visible hasta el infrarrojo cercano. Se pueden comprar fácilmente en el mercado. La tira se puede cortar y ensamblar en diferentes matrices para alinearse con una placa de 96 pocillos para un ensayo de alto rendimiento. El uso de una placa de 96 pocillos permite diferentes condiciones de prueba al mismo tiempo para ahorrar tiempo y espacio en el laboratorio.

En conclusión, el sistema establecido en este estudio es simple, fácil y versátil para examinar diferentes efectos fotodinámicos en diversos microorganismos y células.

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Disclosures

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo ha recibido financiación del Centro de Nanomedicina Aplicada, Universidad Nacional Cheng Kung del Programa del Centro de Investigación de Áreas Destacadas en el marco del Proyecto Sprout de Educación Superior del Ministerio de Educación (MOE), y del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán [MOST 109-2327-B-006-005] a TW Wong. J.H. Hung reconoce la financiación del Hospital Universitario Nacional Cheng Kung, Taiwán [NCKUH-11006018] y [MOST 110-2314-B-006-086-MY3].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microfuge tube Neptune, San Diego, USA #3745.x
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap Falcon, USA #352235
96-well plate Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan #16196
Aluminum foil sunmei, Tainan, Taiwan
Aluminum heat sink Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan BK-T220-0051-01 Disperses heat from the LED array.
Centrifuge Eppendorf, UK 5415R
Graph pad prism software GraphPad 8.0, San Diego, California, USA graphing and statistics software
Green light emitting diode (LED) strip Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan 2835 Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63
Incubator Yihder, Taipei, Taiwan LM-570D (R)
Light power meter Ophir, Jerusalem, Israel PD300-3W-V1-SENSOR,
Millex 0.22 μm filter Merck, NJ, USA SLGVR33RS
Multidrug-resistant Candida albicans Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan BCRC 21538/ATCC 10231 http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538
OD600 spectrophotometer Biochrom, London, UK Ultrospec 10
Rose Bengal Sigma-Aldrich, MO, USA 330000 stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium HIMEDIA, India M1363

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References

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Inmunología e Infección Número 181
Terapia fotodinámica mediada por rosa de Bengala para inhibir <em>Candida albicans</em>
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