Summary
De groeiende incidentie van resistente Candida albicans is wereldwijd een ernstig gezondheidsprobleem. Antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) kan een strategie bieden om resistente schimmelinfecties te bestrijden. Het huidige protocol beschrijft rose bengal-gemedieerde aPDT werkzaamheid op een multiresistente C. albicans stam in vitro.
Abstract
Invasieve Candida albicans-infectie is een belangrijke opportunistische schimmelinfectie bij de mens omdat het een van de meest voorkomende kolonisatoren van de darm, mond, vagina en huid is. Ondanks de beschikbaarheid van antischimmelmedicatie blijft het sterftecijfer van invasieve candidiasis ~ 50%. Helaas neemt de incidentie van resistente C. albicans wereldwijd toe. Antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) kan een alternatieve of adjuvante behandeling bieden om de vorming van C. albicans biofilm te remmen en resistentie tegen geneesmiddelen te overwinnen. Rose bengal (RB)-gemedieerde aPDT heeft aangetoond effectieve celdoding van bacteriën en C. albicans. In deze studie wordt de werkzaamheid van RB-aPDT op multiresistente C. albicans beschreven. Een zelfgemaakte groene lichtgevende diode (LED) lichtbron is ontworpen om uit te lijnen met het midden van een put van een 96-well plaat. De gisten werden geïncubeerd in de putten met verschillende concentraties RB en verlicht met verschillende fluences van groen licht. De dodende effecten werden geanalyseerd met behulp van de plaatverdunningsmethode. Met een optimale combinatie van licht en RB werd 3-log groeiremming bereikt. Er werd geconcludeerd dat RB-aPDT mogelijk medicijnresistente C. albicans zou kunnen remmen.
Introduction
C. albicans koloniseert in de gastro-intestinale en urogenitale tractus van gezonde personen en kan worden gedetecteerd als normale microbiota in ongeveer 50 procent van de individuen1. Als er een onbalans wordt gecreëerd tussen de gastheer en de ziekteverwekker, is C. albicans in staat om binnen te dringen en ziekte te veroorzaken. De infectie kan variëren van lokale slijmvliesinfecties tot meervoudig orgaanfalen2. In een multicenter surveillancestudie in de VS is ongeveer de helft van de isolaten van patiënten met invasieve candidiasis tussen 2009 en 2017 C. albicans3. Candidemie kan worden geassocieerd met hoge morbiditeitscijfers, mortaliteit, langdurig ziekenhuisverblijf4. Amerikaanse Centers of Disease Control and Prevention meldden dat ongeveer 7% van alle geteste Candida-bloedmonsters resistent zijn tegen het antischimmelmiddel fluconazol5. De opkomst van medicijnresistente Candida-soorten verhoogt de bezorgdheid om een alternatieve of adjuvante therapie voor antimycotische middelen te ontwikkelen.
Antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) omvat het activeren van een specifieke fotosensitizer (PS) met licht op de piekabsorptiegolflengte van de PS6. Na excitatie brengt de aangeslagen PS zijn energie of elektronen over naar de nabijgelegen zuurstofmoleculen en keert terug naar de grondtoestand. Tijdens dit proces worden reactieve zuurstofsoorten en singletzuurstof gevormd en veroorzaken celschade. aPDT is op grote schaal gebruikt om micro-organismen te doden sinds de jaren 19907. Een van de voordelen van aPDT is dat meerdere organellen in een cel beschadigd raken door singlet zuurstof en/of reactieve zuurstofsoorten (ROS) tijdens bestraling; resistentie tegen aPDT is dus tot op de dag van vandaag niet gevonden. Bovendien meldde een recente studie dat de bacteriën die overleefden na aPDT gevoeliger werden voor antibiotica8.
De lichtbronnen die in aPDT worden gebruikt, zijn lasers, metalen halogeenlampen met filters, nabij-infrarood licht en light-emitting diode (LED)9,10,11,12. De laser levert een hoog lichtvermogen, meestal groter dan 0,5 W/cm2, dat de levering van een hoge lichtdosis in een zeer korte tijd mogelijk maakt. Het is veel gebruikt in gevallen waar een langere behandelingstijd onhandig is, zoals aPDT voor orale infecties. Het nadeel van een laser is dat de spotgrootte van verlichting klein is, variërend van een paar honderd micrometer tot 10 mm met een diffuser. Bovendien is laserapparatuur duur en heeft het specifieke training nodig om te kunnen werken. Aan de andere kant is het bestralingsgebied van een metalen halogeenlamp met filters relatief groter13. De lamp is echter te fors en te duur. LED-lichtbronnen zijn mainstream geworden van aPDT op dermatologisch gebied omdat het klein en goedkoper is. Het bestralingsgebied kan relatief groot zijn met een array-opstelling van de LED-lamp. Het hele gezicht kan tegelijkertijd worden verlicht9. Niettemin zijn de meeste, zo niet alle, LED-lichtbronnen die tegenwoordig beschikbaar zijn, ontworpen voor klinisch gebruik. Het is misschien niet geschikt voor experimenten in een laboratorium omdat het ruimte in beslag neemt en duur is. We hebben een goedkope LED-array ontwikkeld die erg klein is en uit een LED-strip kan worden gesneden en gemonteerd. De LED's kunnen in verschillende opstellingen worden gemonteerd voor verschillende experimentele ontwerpen. Verschillende omstandigheden van aPDT kunnen in één experiment worden voltooid in een 96-well plaat of zelfs een 384-well plaat.
Rose bengal (RB) is een gekleurde kleurstof die veel wordt gebruikt om de visualisatie van hoornvliesschade in menselijke ogen te verbeteren14. RB-gemedieerde aPDT heeft dodelijke effecten aangetoond op Staphylococcus aureus, Escherichia coli en C. albicans met ongeveer vergelijkbare efficiëntie als die van Toluidine blue O15. Deze studie toont een methode om het effect van RB-aPDT op multiresistente C. albicans te valideren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van het aPDT-systeem
- Knip vier groene lichtgevende diodes (LED's) uit een LED-strip (zie Tabel met materialen) en lijn ze uit met vier putjes van een 96-putplaat (figuur 1).
OPMERKING: De LED's waren gerangschikt in een 4 x 3 array. De achterkant van de LED werd op een koellichaam geplakt om warmte te verspreiden tijdens de bestraling. - Meet de invloedssnelheid11 van de LED bij 540 nm met een lichtvermogensmeter (zie Tabel met materialen). Zie aanvullende figuur 1 om ervoor te zorgen dat de vloeiendheidssnelheid van de LED tussen 510-560 nm ligt.
- Plaats tijdens de bestraling een elektrische ventilator naast de plaat om de constante temperatuur (25 ± 1 °C)11 te handhaven. Zie aanvullende figuur 2 om ervoor te zorgen dat de temperatuur van het medium tijdens de bestraling constant blijft.
2. Kweken van de gistvorm van C. albicans
OPMERKING: Een multiresistente C. albicans (BCRC 21538 / ATCC 10231), resistent tegen de meeste antischimmelmiddelen, waaronder fluconazol, wordt gebruikt voor de experimenten16.
- Bepaal de gevoeligheid van het antimycotische geneesmiddel met een schijfdiffusiemethode volgens eerder gepubliceerd rapport17.
- Kweek C. albicans in gist-, schimmeldraden- en pseudohyphaevormen, afhankelijk van de micro-ecologische omgevingen18.
OPMERKING: De schimmeldraden en pseudohyphae vormen zijn moeilijk voor een nauwkeurige berekening. De gistvorm kan nauwkeurig worden berekend onder een microscoop of met flowcytometrie. De temperatuur tijdens de celgroei bepaalt de morfologie. Bij kamertemperatuur (25 °C) zijn bijna alle cellen gistvormig. Een korte incubatie van C. albicans van 4 uur bij 30 °C had geen invloed op de gistmorfologie.
3. aPDT op planktonic C. albicans
- Isoleer een enkele kolonie C. albicans uit een agarplaat met een steriele lus en voeg deze toe aan een 3 ml gistextract pepton dextrose (YPD) medium (zie Tabel met materialen) in een gesteriliseerde glazen buis.
- Incubeer de buis bij 25 ± 1 °C 's nachts (14-16 uur) in een incubator met een rotatiesnelheid van 155 tpm om C. albicans uit te breiden en de schimmel in gistvorm te houden voor nauwkeurige kwantificering.
- Verdun de nachtcultuur met medium tot een OD600-waarde van ongeveer 0,5 bij 30°C en draai gedurende 4 uur met een snelheid van 155 tpm om een loggroeifase van C. albicans te bereiken.
- Verdun de logfasecultuur opnieuw met vers YPD-medium tot een OD600-waarde van 0,65 (ongeveer 1 x 107 kolonievormende eenheden, KVE/ml). Bevestig de eindconcentratie met behulp van seriële verdunningsmethode op een agarplaat8.
- Bereid een bouillonoplossing (4%) van Rose bengal (RB) door het poeder op te lossen in 1x PBS. Filtreer en steriliseer het met een filter van 0,22 μm en bewaar het bij 4 °C in het donker. De uiteindelijke werkconcentratie van RB is 0,2%.
- Voeg 111 μL van 2% RB toe aan 1 ml log-fase C. albicans in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en co-kweek op verschillende tijdstippen (0, 15 en 30 min) bij kamertemperatuur om de absorptie van RB in de cellen te begrijpen (figuur 2).
- Was de co-cultuur driemaal met 1 ml 1x PBS met centrifugatie op 16.100 x g gedurende 2,5 min bij kamertemperatuur.
OPMERKING: aPDT bevat vier verschillende voorwaarden: absolute controle (geen blootstelling aan licht, geen RB), donkere controle (geen licht maar incubeert met RB), lichtregeling (blootstelling aan licht zonder RB), aPDT (blootstelling aan licht in aanwezigheid van RB). - Resuspend de C. albicans in 1 ml van 1x PBS en wijs ze toe in drie verschillende putten in een 96 putplaat voor elke toestand. Lijn de putten na het wassen uit met de LED-array.
- Schakel in licht blootgestelde groepen de elektrische ventilator en het licht in.
OPMERKING: Een andere fluence (J/cm2) kan worden bereikt door de putten bloot te stellen aan verschillende tijdsperioden. Een lichtblootstelling van 16,7 minuten komt bijvoorbeeld op 10 J / cm2 met een 10 mW / cm2 LED-lamp. - Voeg na bestraling 20 μL van de cokweekoplossing uit één put toe aan een centrifugebuis van 1,5 ml met 180 μL 1x PBS om een verdunning van 10x te bereiden. Verdun verder tien keer, vervolgens volgens dezelfde methode.
- Laat drie druppels van 20 μL van elke seriële verdunning op één kwadrant van een YPD-agarplaat vallen om telbare kolonies van de plaat te bereiken. Bereken de KVE/ml door de kolonies te vermenigvuldigen met de verdunningsfactoren3.
4. Statistische analyse
- Analyseer de verzamelde gegevens met behulp van een grafische en statistische software (zie Tabel met materialen).
- Toon gegevens door middel ± standaardfout van het gemiddelde. Voer een tweerichtings ANOVA-analyse van variantie8 uit om significante verschillen tussen de verschillende testomstandigheden te evalueren.
- Voer tukey's meerdere vergelijkingstests uit voor paarsgewijze vergelijkingen8. Voer voor elke verschillende behandeling ten minste drie onafhankelijke experimenten uit. Beschouw de p-waarde < 0,05 statistisch significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont het aPDT-systeem dat in deze studie wordt gebruikt. Omdat hoge temperaturen aanzienlijke celdood kunnen veroorzaken, wordt de LED-array gekoeld door een elektrische ventilator en wordt een koellichaam gebruikt tijdens de bestraling om een constante temperatuur op 25 ± 1 °C te handhaven. Het warmte-effect kan worden verdisconteerd. Het hebben van een gelijkmatige lichtverdeling is ook een belangrijke bepalende factor voor een succesvolle aPDT; daarom is het van cruciaal belang om de LED-lamp tijdens de verlichting precies op de put uit te lijnen. Vanwege de helderheid van de LED moet een zonnebril worden uitgerust voordat het licht wordt ingeschakeld.
C. albicans wordt onmiddellijk gekleurd met RB zoals gevisualiseerd door rode fluorescentie onder fluorescerende microscopie (0 min in figuur 2). Te zien is dat de RB op tijdsafhankelijke wijze de cellen binnenkomt (figuur 2). De studie gebruikte een RB-incubatie van 15 minuten waarbij na 15 minuten de meeste cellen werden gekleurd met RB. Een hogere concentratie RB leidt tot een sterkere fluorescentie, waardoor meer vrije radicalen worden geproduceerd om schimmels te doden. Toch kan het ook aanzienlijke celdood veroorzaken in normale cellen; daarom wordt 0,2% RB-concentratie vaak gebruikt in klinieken. In deze studie is dus voor die exacte concentratie gekozen.
PDT omvat de activering van RB met licht. Wanneer de geactiveerde RB terugkeert naar zijn grondtoestand, brengt het de energie en elektronen over naar de nabijgelegen zuurstof om vrije radicalen en singletzuurstof te genereren, wat resulteert in celdood. Figuur 3 toont geen celdood onder de voorwaarde van geen bestraling of afwezigheid van RB. C. albicans werd geremd op een lichte dosisafhankelijke manier na bestraling van groen licht in aanwezigheid van 0,2% RB (figuur 3). Het blootstellen van de schimmels aan groen licht met 30 J/cm2 resulteerde in een 4-log (99,99%) remming van de celgroei.
Figuur 1: Het fotodynamische systeem. (A) Een groene LED-array werd op een metalen koellichaam geplakt om warmte tijdens de bestraling te verspreiden. Naast de lichtbron werd een elektrische ventilator geplaatst om de temperatuur constant te houden op 25 ± 1 °C. (B) Het licht werd ingeschakeld. (C) De putten van een 96 putplaat waren uitgelijnd met het midden van de LED. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De tijdsafhankelijke studie van Rose bengal die C. albicans binnenkomt. Heldere veldbeelden (A-D) en fluorescentiebeelden (E-H) van de C. albicans na 0-30 min samen gekweekt met 0,2% Rose bengal (RB). (A) en (E) Controle zonder RB-co-gekweekt. (B) en (F) De cellen werden onmiddellijk gekleurd met 0,2% RB. (C) en (G) Na 15 minuten cultuur vertoonden de meeste cellen rode fluorescentie, wat wijst op RB in de cellen. (D) en (H) Sterkere fluorescentie van de RB werd opgemerkt met een incubatietijd van 30 minuten. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Antimicrobiële fotodynamische therapie-effecten op multiresistente C. albicans. De groeiremming van cellen hangt af van de lichtfluence. Blootstelling van C. albicans aan een fluence van 10 J/cm2 remde de celgroei met respectievelijk 1,5 logs, met 2 logs met 20 J/cm2 en 4 logs met 30 J/cm2 in aanwezigheid van 0,2% Rose bengal. -RB, zonder Rose bengal incubatie; +RB, gecoöpteerd met Rose bengal gedurende 15 min. Gegevens worden ± SEM van drie afzonderlijke experimenten die in tweevoud worden uitgevoerd. p-waarden worden aangegeven in de figuur (Tukey's meerdere vergelijkingstests, tweerichtings-ANOVA). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Het LED-uitgangsspectrum. De fluence rate werd elke 2 nm gemeten van 510-560 nm met een vermogensmeter. Gegevens worden samengevoegd uit twee onafhankelijke experimenten met drievoudige metingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: De temperatuur van het medium tijdens de bestraling. Een thermokoppel werd in elke put van een 96-putplaat gevuld met 100 μL bouillon ingebracht om de temperatuur te meten. De temperatuur was constant bij 25 ± 1 °C. Gegevens worden samengevoegd van gedupliceerde experimenten met drievoudige putten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bemoedigende resultaten van klinische toepassingen van RB-PDT voor schimmelkeratitis zijn onlangs gemeld19. De absorptiepiek van RB ligt bij 450-650 nm. Het is essentieel om de fluence rate van de lichtbron te bepalen voor een succesvolle aPDT. Een hoge fluence (meestal >100 J/cm2) is vereist om kankercellen te behandelen, terwijl een lagere fluence naar verwachting geïnfecteerde laesies zal behandelen6. Een hoge fluence betekent een lange blootstellingstijd die mogelijk niet praktisch is in een klinische omgeving. Voor de behandeling van mycotische keratitis wordt in de oogheelkundige gemeenschapeen 5,4 J/cm2 overeengekomen 20. Een lange incubatietijd van RB is ook onhandig voor een patiënt om een APDT-behandeling te krijgen. Zo werd een incubatietijd van 15 minuten gekozen voor verdere experimenten.
Sommige stappen zijn van cruciaal belang voor een succesvol experiment. De agarplaten die worden gebruikt voor schimmelcultuur werden gedurende 15-20 minuten gedroogd in een lamellaire stroomcabine met de ventilator ingeschakeld om vocht op het oppervlak te verminderen. Een vochtig oppervlak zou de stroom van de schimmeldruppels mogelijk maken om zich te mengen, waardoor de vorming van een enkele kolonie wordt voorkomen.
Het uitvoeren van alle experimenten bij weinig licht is van vitaal belang om te voorkomen dat RB fotobleaching maakt. Het elektrische circuit bevond zich in een parallelle verbinding, zodat als er een storing optrad in een van de circuits, de resterende apparaten niet zouden worden beïnvloed. Als er resultaten zijn die buiten het bereik van anderen liggen, kan de array eerst worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat alle LED-lampen goed functioneren.
Een beperking van het gebruik van een LED-lichtbron is de temperatuurafhankelijkheid. In een LED wordt warmte niet geproduceerd door de LED-lamp zelf, maar gegenereerd op de halfgeleiderverbinding in het apparaat9. Aangezien overdreven LED's boven hun nominale stroom de stijging van de junctietemperatuur oproepen, wat uiteindelijk leidt tot voortijdig falen van de gloeilamp, is het noodzakelijk om het apparaat uit te rusten met een metalen koellichaam om geschikte koeling van de junctie te bieden. Een andere beperking van het huidige ontwerp van de LED-array is het beperkte gebied dat wordt verlicht door elke LED-lamp, die slechts één enkele put van een 96-putplaat herbergt. Als een groter verlichtingsgebied nodig is, is een andere opstelling van LED-lampen met de juiste overeenkomstige afstanden boven of onder de plaat noodzakelijk om een gelijkmatige verlichting te bereiken.
De voordelen van dit studieontwerp zijn de eenvoudige en goedkope installatie van het fotodynamische systeem voor aPDT-experimenten. Het kan worden gebruikt in experimenten met schimmelinfecties. Virussen en bacteriën kunnen ook in hetzelfde systeem worden getest. De LED-lichtstrip kan worden gekozen uit een andere kleur licht om te correleren met de absorptiepieken van verschillende fotosensitizers, variërend van zichtbaar tot nabij-infrarood lichtspectrum. Ze kunnen gemakkelijk op de markt worden gekocht. De strip kan worden gesneden en geassembleerd in verschillende arrays om uit te lijnen met een 96-well plaat voor een hoge doorvoertest. Het gebruik van een 96-well plaat maakt verschillende testomstandigheden tegelijkertijd mogelijk om tijd en ruimte in het lab te besparen.
Kortom, het gevestigde systeem in deze studie is eenvoudig, gemakkelijk en veelzijdig om verschillende fotodynamische effecten op verschillende micro-organismen en cellen te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Dit werk heeft financiering ontvangen van het Center of Applied Nanomedicine, National Cheng Kung University van het Featured Areas Research Center Program in het kader van het Higher Education Sprout Project door het ministerie van Onderwijs (MOE) en het ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan [MOST 109-2327-B-006-005] aan TW Wong. J.H. Hung erkent financiering van het National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11006018], en [MOST 110-2314-B-006-086-MY3].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | Disperses heat from the LED array. |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
- Naglik, J. R., Challacombe, S. J., Hube, B. Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 400-428 (2003).
- Pappas, P. G., et al. Clinical practice guideline for the management of candidiasis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 62 (4), 1-50 (2016).
- Ricotta, E. E., et al. Invasive candidiasis species distribution and trends, United States, 2009-2017. Journal of Infectious Diseases. 223 (7), 1295-1302 (2021).
- Koehler, P., et al. Morbidity and mortality of candidaemia in Europe: an epidemiologic meta-analysis. Clinical Microbiology and Infection. 25 (10), 1200-1212 (2019).
- Toda, M., et al. Population-based active surveillance for culture-confirmed candidemia - four sites, United States, 2012-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries. 68 (8), 1-15 (2019).
- Lee, C. N., Hsu, R., Chen, H., Wong, T. W. Daylight photodynamic therapy: an update. Molecules. 25 (21), 5195 (2020).
- Wainwright, M.
- Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant staphylococcus aureus drug resistance. Journal of Clinical Medicine. 8 (3), 411 (2019).
- Kim, M. M., Darafsheh, A. Light sources and dosimetry techniques for photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 280-294 (2020).
- Wong, T. W., Sheu, H. M., Lee, J. Y., Fletcher, R. J. Photodynamic therapy for Bowen's disease (squamous cell carcinoma in situ) of the digit. Dermatologic Surgery. 27 (5), 452-456 (2001).
- Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dermatologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
- Stasko, N., et al. Visible blue light inhibits infection and replication of SARS-CoV-2 at doses that are well-tolerated by human respiratory tissue. Scientific Reports. 11 (1), 20595 (2021).
- Crosbie, J., Winser, K., Collins, P. Mapping the light field of the Waldmann PDT 1200 lamp: potential for wide-field low light irradiance aminolevulinic acid photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 76 (2), 204-207 (2002).
- Feenstra, R. P., Tseng, S. C. Comparison of fluorescein and rose bengal staining. Ophthalmology. 99 (4), 605-617 (1992).
- Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Effect of cell-photosensitizer binding and cell density on microbial photoinactivation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (6), 2329-2335 (2005).
- Shahid, H., et al. Duclauxin derivatives from fungi and their biological activities. Frontiers in Microbiology. 12, 766440 (2021).
- Arendrup, M. C., Park, S., Brown, S., Pfaller, M., Perlin, D. S. Evaluation of CLSI M44-A2 disk diffusion and associated breakpoint testing of caspofungin and micafungin using a well-characterized panel of wild-type and fks hot spot mutant Candida isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (5), 1891-1895 (2011).
- Mukaremera, L., Lee, K. K., Mora-Montes, H. M., Gow, N. A. R. Candida albicans yeast, pseudohyphal, and hyphal morphogenesis differentially affects immune recognition. Frontiers in Immunology. 8, 629 (2017).
- Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).
- Martinez, J. D., et al. Rose Bengal photodynamic antimicrobial therapy: a pilot safety study. Cornea. 40 (8), 1036-1043 (2021).
