Summary
A crescente incidência de albicanos candida resistentes a medicamentos é um sério problema de saúde em todo o mundo. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) pode oferecer uma estratégia para combater infecções fúngicas resistentes a medicamentos. O presente protocolo descreve a eficácia da APDT mediada por Rose bengala em uma cepa c. albicans resistente a multidrogas in vitro.
Abstract
A infecção por cânbis invasivos é uma infecção fúngica oportunista significativa em humanos porque é um dos colonizadores mais comuns do intestino, boca, vagina e pele. Apesar da disponibilidade de medicamentos antifúngicos, a taxa de mortalidade por candidíase invasiva permanece ~50%. Infelizmente, a incidência de C. albicans resistentes a medicamentos está aumentando globalmente. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) pode oferecer um tratamento alternativo ou adjuvante para inibir a formação de biofilmes C. albicans e superar a resistência a medicamentos. Rose bengala (RB) mediada aPDT mostrou morte celular eficaz de bactérias e C. albicans. Neste estudo, descreve-se a eficácia do RB-aPDT em C. albicans multidroga resistentes. Uma fonte de luz diodo verde caseira (LED) foi projetada para se alinhar com o centro de uma placa de 96 poços. As leveduras foram incubadas nos poços com diferentes concentrações de RB e iluminadas com fluências variadas de luz verde. Os efeitos da morte foram analisados pelo método de diluição da placa. Com uma combinação ideal de luz e RB, a inibição do crescimento de 3 log foi alcançada. Concluiu-se que o RB-aPDT poderia potencialmente inibir c. albicans resistentes a medicamentos.
Introduction
C. albicans coloniza nos tratos gastrointestinal e genitourinary de indivíduos saudáveis e pode ser detectado como microbiota normal em cerca de 50% dos indivíduos1. Se um desequilíbrio é criado entre o hospedeiro e o patógeno, os albicanos são capazes de invadir e causar doenças. A infecção pode variar de infecções locais de membrana mucosa a falência múltipla de órgãos2. Em um estudo de vigilância multicêntrico nos EUA, cerca de metade dos isolados de pacientes com candidíase invasiva entre 2009 e 2017 é C. albicans3. A candidemia pode estar associada a altas taxas de morbidade, mortalidade, internação prolongada4. Os Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA relataram que cerca de 7% de todas as amostras de sangue candida testadas são resistentes ao fluconazol antifúngico5. O surgimento de espécies candidas resistentes a medicamentos levanta a preocupação de desenvolver uma terapia alternativa ou adjuvante para agentes antimícticos.
A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) envolve a ativação de um fotoensibilizador específico (PS) com luz no comprimento de onda de absorção máxima do PS6. Após a excitação, o PS animado transfere sua energia ou elétrons para as moléculas de oxigênio próximas e retorna ao estado terrestre. Durante esse processo, espécies reativas de oxigênio e oxigênio único são formadas e causam danos celulares. aPDT tem sido amplamente usada para matar microrganismos desde a década de 19907. Um dos benefícios do APDT é que várias organelas são danificadas em uma célula por espécies de oxigênio único e/ou reativa (ROS) durante a irradiação; assim, a resistência ao APDT não foi encontrada até hoje. Além disso, um estudo recente relatou que as bactérias que sobreviveram após o APDT tornaram-se mais sensíveis aos antibióticos8.
As fontes de luz utilizadas no APDT incluem lasers, lâmpadas halógenas metálicas com filtros, luz quase infravermelha e diodo emissor de luz (LED)9,10,11,12. O laser fornece uma alta potência de luz, geralmente maior que 0,5 W/cm2, que permite a entrega de uma dose de luz alta em um tempo muito curto. Tem sido amplamente utilizado em casos em que um tempo de tratamento mais longo é inconveniente, como o APDT para infecções bucais. A desvantagem de um laser é que seu tamanho de ponto de iluminação é pequeno, variando de algumas centenas de micrômetros a 10 mm com um difusor. Além disso, o equipamento a laser é caro e precisa de treinamento específico para operar. Por outro lado, a área de irradiação de uma lâmpada de halogênio metálico com filtros é relativamente maior13. No entanto, a lâmpada é muito pesada e cara. As fontes de luz LED tornaram-se comuns de aPDT no campo dermatológico porque é pequena e menos cara. A área de irradiação pode ser relativamente grande com um arranjo de matriz da lâmpada LED. O rosto inteiro pode ser iluminado ao mesmo tempo9. No entanto, a maioria, se não todas, as fontes de luz LED disponíveis hoje são projetadas para uso clínico. Pode não ser adequado para experimentos em laboratório porque é ocupando espaço e caro. Desenvolvemos uma matriz led barata que é muito pequena e pode ser cortada e montada a partir de uma tira led. Os LEDs podem ser instalados em diferentes arranjos para diferentes projetos experimentais. Diferentes condições de aPDT podem ser completadas em uma placa de 96 poços ou até mesmo em uma placa de 384 poços em um experimento.
Rose bengala (RB) é um corante colorido amplamente utilizado para melhorar a visualização de danos na córnea nos olhos humanos14. APDT mediada por RB mostrou efeitos de morte em Staphylococcus aureus, Escherichia coli e C. albicans com eficiência aproximadamente comparável à do azul Toluidine O15. Este estudo demonstra um método para validar o efeito do RB-aPDT em C. albicans multidroga resistentes.
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Protocol
1. preparação do sistema aPDT
- Corte quatro diodos emissores de luz verde (LEDs) de uma tira led (ver Tabela de Materiais) e alinhe-os com quatro poços de uma placa de 96 poços (Figura 1).
NOTA: Os LEDs foram organizados em uma matriz 4 x 3. A parte de trás do LED foi aderida a um dissipador de calor para dispersar o calor durante a irradiação. - Meça a taxa de fluência11 do LED a 540 nm com um medidor de energia leve (ver Tabela de Materiais). Consulte a Figura Suplementar 1 para garantir que a taxa de fluência do LED esteja entre 510-560 nm.
- Coloque um ventilador elétrico ao lado da placa durante a irradiação para manter a temperatura constante (25 ± 1 °C)11. Consulte a Figura Suplementar 2 para garantir que a temperatura constante do meio seja mantida durante a irradiação.
2. Culturing da forma de levedura de C. albicans
NOTA: Um C. albicans multidroga resistente (BCRC 21538/ATCC 10231), resistente à maioria dos antifúngicos, incluindo fluconazol, é usado para os experimentos16.
- Determine a sensibilidade da droga antimíctica com um método de difusão de disco após o relatório publicado anteriormente17.
- Cultivar C. albicans em formas de levedura, hifa e pseudohifas, dependendo dos ambientes microecológicos18.
NOTA: As formas de hifa e pseudohifas são difíceis para um cálculo preciso. A forma de levedura pode ser calculada precisamente sob um microscópio ou com citometria de fluxo. A temperatura durante o crescimento celular determina sua morfologia. À temperatura ambiente (25 °C), quase todas as células são forma de levedura. Uma incubação curta de 4h de C. albicans a 30 °C não afetou sua morfologia de levedura.
3. aPDT sobre planktônico C. albicans
- Isole uma única colônia de C. albicans de uma placa de ágar com um laço estéril e adicione-o a um extrato de levedura de 3 mL peptone dextrose (YPD) médio (ver Tabela de Materiais) em um tubo de vidro esterilizado.
- Incubar o tubo a 25 ± 1 °C durante a noite (14-16 h) em uma incubadora com uma velocidade de rotação de 155 rpm para expandir C. albicans e manter o fungo na forma de levedura para quantificação precisa.
- Diluir a cultura da noite com valor médio a600 de OD de cerca de 0,5 a 30° C e girar a uma velocidade de 155 rpm por 4h para alcançar uma fase de crescimento de troncos de C. albicans.
- Diluir novamente a cultura da fase de registro com um meio YPD fresco para um valor de600 OD de 0,65 (em torno de 1 x 107 unidades formadoras de colônias, CFU/mL). Confirme a concentração final por método de diluição serial em uma placade ágar 8.
- Prepare uma solução de estoque (4%) de Rose bengala (RB) dissolvendo o pó em 1x PBS. Filtre e esterilize-o com um filtro de 0,22 μm e armazene-o a 4 °C no escuro. A concentração final de trabalho de RB é de 0,2%.
- Adicione 111 μL de 2% RB a 1 mL de albicanos de fase de tronco em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e co-cultura em diferentes pontos de tempo (0, 15 e 30 min) à temperatura ambiente para entender a absorção de RB nas células (Figura 2).
- Lave a co-cultura três vezes com 1 mL de 1x PBS com centrifugação a 16.100 x g por 2,5 min em temperatura ambiente.
NOTA: aPDT contém quatro condições diferentes: controle absoluto (sem exposição à luz, sem RB), controle escuro (sem luz, mas incuba com RB), controle de luz (expõe à luz sem RB), aPDT (expõe à luz na presença de RB). - Resuspenque os C. albicans em 1 mL de 1x PBS e aloque-os em três poços diferentes em uma placa de 96 poços para cada condição. Alinhe os poços com a matriz LED após a lavagem.
- Em grupos expostos à luz, ligue o ventilador elétrico e a luz.
NOTA: Uma fluência diferente (J/cm2) pode ser alcançada expondo os poços a períodos de tempo variados. Por exemplo, uma exposição de luz de 16,7 min chega a 10 J/cm2 com uma lâmpada LED led de 10 mW/cm2 . - Após a irradiação, adicione 20 μL da solução de cocultura de um poço para um tubo centrífuga de 1,5 mL contendo 180 μL de PBS 1x para preparar uma diluição de 10x. Além disso, diluir dez vezes, seguindo posteriormente o mesmo método.
- Solte três gotas de 20 μL de cada diluição serial em um quadrante de uma placa de ágar YPD para alcançar colônias contáveis a placa. Calcule a UFC/mL multiplicando as colônias com os fatores de diluição3.
4. Análise estatística
- Analisar os dados coletados por meio de um software de gráficos e estatísticas (ver Tabela de Materiais).
- Retraia dados por erro padrão ± média da média. Realize uma análise bidirecional de variância8 para avaliar diferenças significativas entre as diferentes condições de teste.
- Realize os múltiplos testes de comparação de Tukey para comparações em pares8. Para cada tratamento diferente, realize pelo menos três experimentos independentes. Considere o valor p < 0,05 estatisticamente significante.
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Representative Results
A Figura 1 mostra o sistema aPDT utilizado no presente estudo. Uma vez que altas temperaturas podem causar morte celular significativa, a matriz led é resfriada por um ventilador elétrico, e um dissipador de calor é usado durante a irradiação para manter uma temperatura constante de 25 ± 1 °C. O efeito térmico pode ser descontado. Ter uma distribuição uniforme também é um importante fator determinante para um APDT bem sucedido; portanto, é fundamental alinhar a lâmpada LED ao poço precisamente durante a iluminação. Devido ao brilho do LED, os óculos de sol precisam ser equipados antes de acender a luz.
C. albicans é manchado imediatamente com RB como visualizado por fluorescência vermelha sob microscopia fluorescente (0 min na Figura 2). Pode-se ver que o RB entra nas células de forma dependente do tempo (Figura 2). O estudo utilizou uma incubação de 15 min RB na qual, após 15 min, a maioria das células estava manchada com RB. Uma maior concentração de RB leva a uma fluorescência mais forte, produzindo mais radicais livres para matar fungos. No entanto, também pode causar morte celular significativa em células normais; portanto, a concentração de 0,2% de RB é comumente utilizada em clínicas. Assim, essa concentração exata foi escolhida neste estudo.
PDT envolve a ativação de RB com luz. Quando o RB ativado retorna ao seu estado terrestre, ele transfere a energia e os elétrons para o oxigênio próximo para gerar radicais livres e oxigênio único, resultando em morte celular. A Figura 3 não mostra morte celular sob a condição de não irradiação ou ausência de RB. C. albicans foi inibido de forma leve dependente de dose após irradiação de luz verde na presença de 0,2% RB (Figura 3). Expor os fungos à luz verde com 30 J/cm2 resultou em uma inibição de 4 log (99,99%) do crescimento celular.
Figura 1: O sistema fotodinâmico. (A) Uma matriz led verde foi aderida a um dissipador de calor metálico para dispersar o calor durante a irradiação. Um ventilador elétrico foi colocado ao lado da fonte de luz para manter a temperatura constante em 25 ± 1 °C. (B) A luz foi acesa. (C) Os poços de uma placa de 96 poços estavam alinhados com o centro do LED. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O estudo de rose bengala entrando em C. albicans. Imagens de campo brilhante (A-D) e fluorescência (E-H) dos albicanos C. após 0-30 min co-cultivados com 0,2% de Rose bengala (RB). (A) e (E) Controle sem co-cultura RB. (B) e (F) As células foram imediatamente manchadas com 0,2% de RB. (C) e (G) Após 15 min de cultura, a maioria das células apresentou fluorescência vermelha, indicando RB dentro das células. (D) e (H) Fluorescência mais forte do RB foi notada com uma incubação de 30 min. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeitos da terapia fotodinâmica antimicrobiana em C. albicans multirresistentes. A inibição do crescimento das células depende da fluência leve. Expor os albicanos a uma fluência de 10 J/cm2 inibiu o crescimento celular por 1,5 toras, por 2 toras com 20 J/cm2, e 4 troncos com 30 J/cm2, respectivamente, na presença de 0,2% de Rose bengala. -RB, sem incubação de bengala rosa; +RB, co-cultivado com Rose bengala por 15 min. Os dados são ± SEM de três experimentos separados realizados em duplicata. p valores são indicados na figura (testes de comparação múltipla de Tukey, ANOVA bidirecional). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: O espectro de saída led. A taxa de fluência foi medida a cada 2 nm de 510-560 nm com um medidor de potência. Os dados são agrupados a partir de dois experimentos independentes com medidas triplicadas. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar 2: A temperatura do meio durante a irradiação. Um termopar foi inserido em cada poço de uma placa de 96 poços preenchida com caldo de 100 μL para medir a temperatura. A temperatura foi constante em 25 ± 1 °C. Os dados são agrupados a partir de experimentos duplicados com poços triplicados. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Resultados encorajadores das aplicações clínicas de RB-PDT para ceratite fúngica foram relatados recentemente19. O pico de absorção de RB é de 450-650 nm. É essencial determinar a taxa de fluência da fonte de luz para um aPDT bem sucedido. Uma alta fluência (geralmente >100 J/cm2) é necessária para tratar células cancerígenas, enquanto espera-se que uma fluência mais baixa trate lesões infectadas6. Uma alta fluência significa um longo tempo de exposição que pode não ser prático em um ambiente clínico. Para o tratamento da ceratite mcótica, um 5.4 J/cm2 é acordado na comunidade oftalmológica20. Um longo tempo de incubação de RB também é inconveniente para um paciente receber tratamento aPDT. Assim, foi escolhido um tempo de incubação de 15 minutos para outros experimentos.
Alguns passos são fundamentais para um experimento bem sucedido. As placas de ágar usadas para a cultura fúngica foram secas por 15-20 min em uma cabine de fluxo lamelar com o ventilador ligado para reduzir a umidade na superfície. Uma superfície úmida permitiria que o fluxo das gotículas de fungos se misturasse, impedindo a formação de uma única colônia.
Executar todos os experimentos em luz fraca é vital para evitar que a RB fotobleaching. O circuito elétrico estava em uma conexão paralela para que se uma ruptura acontecesse em um dos circuitos, os demais aparelhos não seriam afetados. Se houver resultados que estão fora do alcance de outros, a matriz pode ser verificada primeiro para garantir que todas as lâmpadas LED estejam em boa função.
Uma limitação de utilizar uma fonte de luz LED é sua dependência de temperatura. Em um LED, o calor não é produzido pela lâmpada LED em si, mas gerado na junção de semicondutores dentro do dispositivo9. Uma vez que a sobregarção de LEDs acima de sua corrente nominal evoca o aumento da temperatura de junção, eventualmente levando à falha prematura da lâmpada, é necessário equipar o dispositivo com um dissipador de calor metálico para fornecer um resfriamento adequado da junção. Outra limitação do design atual do array LED é a área restrita iluminada por cada lâmpada LED, que acomoda apenas um único poço de uma placa de 96 poços. Se for necessária uma área de iluminação maior, é necessário um arranjo diferente de lâmpadas LED com distâncias correspondentes adequadas acima ou abaixo da placa para alcançar a iluminação uniforme.
As vantagens deste projeto de estudo são a facilidade e a configuração barata do sistema fotodinâmico para experimentos de APDT. Pode ser usado em experimentos relativos a infecções fúngicas. Vírus e bactérias também podem ser testados no mesmo sistema. A tira de luz LED pode ser escolhida a partir de uma cor diferente de luz para se correlacionar com os picos de absorção de diferentes fotosensibilizadores, variando de espectro de luz visível a quase infravermelho. Eles podem ser facilmente comprados no mercado. A tira pode ser cortada e montada em diferentes matrizes para se alinhar com uma placa de 96 poços para um ensaio de alto rendimento. O uso de uma placa de 96 poços permite diferentes condições de teste ao mesmo tempo para economizar tempo e espaço no laboratório.
Em conclusão, o sistema estabelecido neste estudo é simples, fácil e versátil para examinar diferentes efeitos fotodinâmicos em vários microrganismos e células.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho recebeu financiamento do Centro de Nanomedicina Aplicada, Universidade Nacional de Cheng Kung do Programa de Centro de Pesquisa de Áreas Destacadas no âmbito do Projeto Desafeito do Ensino Superior pelo Ministério da Educação (MOE), e do Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan [MOST 109-2327-B-006-005] à TW Wong. J.H. Hung reconhece financiamento do National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11006018], e [MOST 110-2314-B-006-086-MY3].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | Disperses heat from the LED array. |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
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