Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר את תרבית האורגנואידים של המעי הכלבי במערכת תמיכה חדירה בעלת תא כפול. מתוארים זריעת אורגנואידים בתמיכות החדירות, תחזוקת המונולאייר וניסויי חדירות התרופות הבאים.
Abstract
מערכת התמיכה החדירה משמשת בדרך כלל בשילוב עם קווי תאים דו-ממדיים מסורתיים (דו-ממדיים) ככלי חוץ גופי להערכת חדירות הפה של מועמדים חדשים לתרופות טיפוליות. עם זאת, לשימוש בקווי תאים קונבנציונליים אלה יש מגבלות, כגון ביטוי שונה של צמתים הדוקים, התמיינות תאים חלקית והיעדר קולטנים גרעיניים מרכזיים. למרות חסרונות אלה, המודלים של Caco-2 ו-MDCK מקובלים ומאומתים באופן נרחב לחיזוי החדירות האוראלית של האדם in vivo .
כלבים הם מודל תרגומי רלוונטי למחקר ביו-רפואי בשל הדמיון ביניהם באנטומיה של מערכת העיכול ובמיקרופלורה של המעיים עם בני אדם. בהתאם לכך, ולתמיכה בפיתוח תרופות מקבילות, רצוי מאוד להרחיב את השימוש בכלי יעיל ומדויק במבחנה לניבוי מאפייני חדירות של תרופות in vivo הן אצל כלבים והן אצל בני אדם. כלי כזה יכול להיות מערכת האורגנואידים של מעי הכלבים, המאופיינת במבני אפיתל תלת-ממדיים (תלת-ממדיים), המורכבים מעצמם, שמקורם בתאי גזע בוגרים.
(1) פרוטוקול זריעת תמיכה חדירה מתאר את השיטות הניסיוניות לניתוק וזריעה של אורגנואידים של כלבים בתוספות. בידוד אורגנואידים של כלבים, תרבית וקציר תוארו בעבר בסדרה נפרדת של פרוטוקולים בגיליון מיוחד זה. שיטות לתחזוקה כללית של monolayer אורגנואיד מעיים כלבים נדונים ביסודיות ב (2) פרוטוקול תחזוקה Monolayer. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת השלמות המבנית של החד-שכבתי באמצעות מדידות התנגדות חשמלית טרנס-פיתלית (TEER) ומיקרוסקופיית אור. לבסוף, הפרוטוקול הניסויי (3) חדירות מתאר את המשימות שקדמו ישירות לניסוי, כולל אימות מבחנה של תוצאות הניסוי.
באופן כללי, המודל האורגנואידי של הכלב, בשילוב עם טכנולוגיית תרבית תאים דו-תאית, מתגבר על מגבלות הקשורות למודלים ניסיוניים דו-ממדיים, ובכך משפר את אמינות התחזיות של חדירות האוראלית לכאורה של מועמדים לתרופות טיפוליות הן אצל הכלב והן אצל המטופל האנושי.
Introduction
מערכות תמיכה חדירות משמשות בדרך כלל לקביעת החדירות לכאורה של מועמדים לתרופות טיפוליות דרך מחסום אפיתלהמעיים 1,2. ניתן להשתמש בהם גם כדי להעריך הפרשה תאית3, נדידת תאים4 ורעילות סמים5. בדיקות חדירות של תרופות פומיות במבחנה הן שלב מפתח בתהליך הגילוי והפיתוח של התרופה2, כאשר מועמדים בודדים לתרופות נבדקים בשלב המוקדם של מחזור החיים של המו"פ של התרופה6. מערכת התמיכה החדירה היא מנגנון תרבית תאים דו-תאי המורכב מתוסף עם קרום חצי נקבובי הממוקם בלוח רב-תכליתי. מערכת זו מאפשרת גישה ישירה לצדדים האפיקליים והבזולטרליים של חד-שכבתי תאים הגדלים בתוסף7. החד-שכבתי המשמש במערכות אלה מופק בדרך כלל מתאי אפיתל במערכת העיכול (למשל, קו תאים של אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי Caco-2)8. תרביות תאים גדלות במצב מקוטב המחקה את המיקרו-ארכיטקטורה הטבעית של תאי אפיתל במעיים, ומאפשרות התמיינות תאית נוספת, מיקרואנטומיה דומה ותפקוד7. פרטים על תוספת התמיכה החדירה ניתן למצוא באיור 1. זריעת התוספות עם תרביות תאים דו-ממדיות, המשמשות באופן מסורתי להערכת חדירות תרופות מעיים, היא זולה יחסית וקלה לתרבית9. מערכות אלה מציגות מספר מגבלות עיקריות, כולל יכולתן המוגבלת לחזות את חילוף החומרים במעיים של מועמדים לתרופות טיפוליות10,11. זה נכון לגבי כל המנגנונים של ספיגת תרופות, בין אם זה ספיגה פסיבית דרך הצמתים ההדוקים בין תאי אפיתל, ספיגה טרנסאפיתליאלית פעילה באמצעות efflux, או מובילי ספיגה (למשל, P-גליקופרוטאין, טרנספורטר מונוקרבוקסילט 1), ותרופות שעברו חילוף חומרים על ידי אנטרוציטים.
כלבים חולקים סביבה משותפת ותזונה עם בני אדםבני 12. האנטומיה של המעיים הכלביים והרכב המיקרוביום דומים מאוד לאלה של בני אדםבני 13, המיוחסים לביות ולתזונה משותפת במהלך 36,000 השנים האחרונות14. למרבה הצער, קווי דמיון אלה יכולים להיות גם גורמים /טריגרים נפוצים להתפתחות המחלה. כלבים מפתחים תחלואה כרונית דומה לבני אדם, כגון השמנת יתר15, מחלת מעי דלקתית16, אדנוקרצינומה של המעי הגס17, גידול סטרומלי במערכת העיכול (GIST)18, ופתולוגיות שונות אחרות הקשורות לאריכות הימים היחסית שלהם19. בהתאם לכך, ניתן להשתמש בהצלחה באורגנואידים של כלבים למחקר תרגומי הפוך של מחלות רב-גורמיות כרוניות אלה ברוח יוזמת הבריאות האחת20.
תאי קאקו-2 הם קווי התאים הנפוצים ביותר לבדיקות ספיגה פומיות של תרופות21. תאים אלה נחשבים כיום למודל "תקן הזהב" לבדיקות חדירות מעיים במבחנה 2,22,23. קו התאים של Caco-2 מבטא את השטף ואת מובילי הקליטה שנמצאו במערכת העיכול האנושית, אם כי ברמות ביטוי שונות 24,25,26. תאי Caco-2 נמצאים בשימוש נרחב גם כמודלים כדי לקבוע אם תרופה היא מצע או מעכב של מובילי זרם מעיים22,27. למרות שתאי קאקו-2 הם ממקור המעי הגס, הם מחקים תא אנטרוציטים. למרבה הצער, תאי Caco-2 מייצגים רק סוג תא אחד משכבת האפיתל של המעי הדק9, אשר אינו מצליח לשחזר את הרכב סוג התאים המורכבים של אפיתל המעי במדויק. לדוגמה, תאי גביע המוקדשים לייצור ריר נעדרים מתרביות קאקו-2, כך שלא ניתן להעריך אינטראקציות של ליחה-תרופה ללא קוקולטורה עם קווי תאים אחרים28. יתר על כן, תרביות Caco-2 אינן מבטאות כמה מהקולטנים הגרעיניים החשובים הקיימים בדרך כלל במעי, כגון קולטן Pregnane X (PXR), קולטן סטרואיד X (SXR) וקולטן אנדרוסטן מכונן (CAR)29. כתוצאה מכך, תרביות Caco-2 אינן מצליחות לדגום את האינדוקציה של מובילי תרופות ואנזימים על ידי תרופות מסוימות המעוררות של קולטנים אלה (למשל, ריפאמפין)30.
טכנולוגיית האורגנואידים של המעי התלת-ממדי מטפלת בחלק מהמגבלות הללו19. אורגנואידים הם מבנים בהרכבה עצמית המופקים מתאי גזע בוגרים שניתן לבסס מדגימות רקמה שנקצרו באמצעות טכניקות מיקרו-פולשניות20. תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם משמשים למודלים של חדירות מעיים31,32. אורגנואידים של כלבים מספקים אלטרנטיבה רלוונטית לאורגנואידים אנושיים מכיוון שמחקר תאי גזע אנושיים מוגבל על ידי סוגיות אתיות33. יתר על כן, אורגנואידים של כלבים מספקים מערכת חוץ גופית לחקר חדירות תרופות לכלבים, חילוף חומרים, הובלה פעילה ואינטראקציות בין תרופות לתרופות. כדי להתמודד עם הפער הטכנולוגי הזה, תוארה הצמיחה העקבית והאמינה של אורגנואידים במעיים של כלבים במערכת תמיכה חדירה34. בדיקת חדירות עם אורגנואידים של מעיים כלביים עשויה לחזות את חדירות מעי הכלבים ואת חילוף החומרים של מולקולות תרופות קטנות בהשוואה לבדיקות הנמצאות בשימוש כיום (Caco-2). אישור של תכונות מרכזיות אלה מעניק למערכת מבחנה חדשנית זו לעבודה עתידית הבוחנת את ההשפעה הפוטנציאלית של משרי ההשראה על חילוף החומרים התוך-תאי ועל ההובלה הפעילה.
האורגנואידים הכלביים מורכבים מכל סוגי התאים הקיימים בדרך כלל בשכבת האפיתל של המעי. מנקודת מבט פונקציונלית ומיקרואנטומית, הם משכפלים באופן מהימן את הסביבה של שכבת האפיתל של המעי הכלבי19,35. יתר על כן, נוכחותם של רירים, מובילי תרופות ואנזימים ספציפיים לכלבים, והתמיינות תאית כוללת באורגנואידים של מעיים כלביים דומה למה שנראה ב-in vivo אצל כלביםבני 34. לפיכך, ניתן לבודד אורגנואידים מחולים וטרינריים חולים ולהשתמש בהם כדי לדגום את ההשפעה של תהליכי מחלה שונים (למשל, דלקת מעיים כרונית) על חדירות תרופות אוראליות כלביות19,36. מערכת האורגנואידים של המעי הכלבי יכולה לשמש גם במסגרות אחרות מאשר ניסויים בחדירות תרופות. מבנים תלת-ממדיים אלה יכולים גם להיות מבודדים מחולים חולים כפי שתואר בעבר על ידי Chandra et al. למחלות מעי דלקתיות, אדנוקרצינומה של המעי הגס וגידול סטרומלי במערכת העיכול19.
פרוטוקול זריעת התמיכה החדירה מתאר שיטות לביסוס תרביות אורגנואידים במעיים של כלבים בתוספות. פרוטוקול ראשון זה מתווה שיטות לדיסוציאציה של תרביות אורגנואידים מבוססות של כלבים המצופים במטריצת הממברנה החוץ-תאית. יתר על כן, ההקדמה של התוספות עם קולגן I ומטריצת הממברנה החוץ-תאית נדונה בפרוטוקול זה. הטמעת אורגנואידים של כלבים בתוספות התמיכה החדירות מתוארת גם היא בפירוט.
הפרוטוקול השני הוא פרוטוקול התחזוקה Monolayer, הכולל תחזוקה כללית של אורגנואידים תלת-ממדיים של כלבים המצופים בתוסף. התדירות והנפחים של המדיה האורגנואידית המשמשת לרענון התרבית, ודרכים למניעת נזק לתרבית תאים, מוצגים בפרוטוקול השני, יחד עם שיטות ניסיוניות להערכת המפגש של חד שכבת האפיתל.
לבסוף, פרוטוקול ניסוי החדירות מתמקד בדרכים לקבוע אם האורגנואידים התלת-ממדיים של המעי הכלבי בבדיקת חדירות מוכנים לשימוש ניסיוני ולשלבי האימות הדרושים לפני ביצוע ניסוי כלשהו. חלק זה מתאר גם את ההתקנה והביצוע המוצלח של ניסוי חדירות, יחד עם הדגירה והדגימה של מועמדים לתרופות טיפוליות בתאי התרבות החד-שכבתית. כמו כן, נדון השימוש בפלואורסצ'ין איזותיוציאנט בעל חדירות נמוכה (FITC-dextran) לניטור שלמות חד-שכבתית. לבסוף, מתוארת שיטת הערכה חוץ גופית לאימות התוצאות לאחר סיום הניסוי. ניסויי חדירות הם נושא רחב ביותר ומסוכמים היטב על ידי Hubatsch et al.37. זרימת העבודה של הפרוטוקולים מסוכמת באיור 2.
איור 1: אורגנואידים של מעיים כלביים על מערכת תמיכה חדירה. תוספת התמיכה החדירה ממוקמת בבאר של צלחת של 24 בארות. הממברנה המיקרו-נקבובית מאפשרת זריעה של אורגנואידים של מעיים כלביים מנותקים, ותאים אלה ייצרו בסופו של דבר חד-שכבתית דו-ממדית אורגנואידית. טכנולוגיה זו מאפשרת גישה הן לצדדים AP והן ל- BL של החד-שכבתי. מדיום אורגנואידי מוצג הן בתאי AP והן בתאי BL של התמיכה החדירה. הקליטה (AP→BL) וההפרשה (BL→AP) של המועמד לתרופה מודגמות, כמו גם שני מצבים אפשריים של הובלת סמים. קיצורים: AP = apical; BL = basolateral. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: זרימת עבודה של פרוטוקולי תמיכה חדירים אורגנואידים לכלבים. תוסף התמיכה החדיר מצופה מראש בתערובת של מטריצת הממברנה החוץ-תאית וקולגן I ומדגר במשך שעה אחת. במהלך תהליך הדגירה, תרבית האורגנואידים מנותקת. תאים אורגנואידים בודדים נזרעים בתוסף, מדיום בתא הבזולטרלי מתווסף מיד לאחר הזריעה, ואילו בינוני לתא האפי מתווסף 24 שעות לאחר סיום תהליך הזריעה. תחזוקה וניטור של האורגנואידים כוללים שינויים קבועים בתווך, מדידות ערך TEER ומיקרוסקופיית אור כדי להעריך את שלמות החד-שכבתי. לפני הניסוי, יש להבדיל בין האורגנואידים על ידי הסרת מעכב ROCK ו- GSKiβ מהתקשורת. ערכי ה-TEER נמדדים ביום הניסוי, והחד-שכבתית האורגנואידית נבדקת באמצעות מיקרוסקופיית אור לאיתור נזק לתאים. לאחר מכן מדיום מוחלף עבור חיץ מתאים ודגירה לפני הניסוי. בדיקת FITC-dextran משמשת במהלך ניסויי חדירות מעיים39 כסמן לשלמות חד-שכבתית. מדידות TEER נלקחות לאחר הניסוי, ומיקרוסקופיית אור תאמת את התוצאות לאחר 24 שעות. קיצורים: TEER = התנגדות חשמלית טרנס-פיתלית; ROCK = קינאז הקשור ל-rho; GSKiβ = גליקוגן סינתאז קינאז בטא; F = פלואורסצנציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Protocol
המחקר אושר ובוצע בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת איווה סטייט (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017). הסעיף הבא (שלבים 1.1-1.3) מתאר את פרוטוקול זריעת התמיכה החדירה, וההליכים מסוכמים באיור 3.
איור 3: זרימת העבודה של פרוטוקול זריעת התמיכה החדיר. תוספות התמיכה החדירות מעוצבות מראש עם שילוב של CMGF+ R/G, קולגן I ומטריצת הממברנה החוץ-תאית ולאחר מכן דוגרות. מדיה מתרבית האורגנואידים הכלבית שואפת ומוחלפת בתמיסת שחזור תאים, ולאחר מכן דגירה של 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. התרבית מועברת לאחר מכן לצינור, ודיסוציאציה אורגנואידית מבוצעת באמצעות פרוטאז דמוי טריפסין. אורגנואידים לא מובחנים מוסרים על ידי מעבר דרך מסננת כדי להשיג תרחיף של תא יחיד, וריכוז התא נקבע באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. התאים נזרעים על תוסף תמיכה חדיר, ו-CMGF+ R/G מתווסף לתא הבזולטרלי. לאחר מכן התרבית מודגרת למשך 24 שעות, והנוזל הנותר מוסר מהתא האפיקלי ומוחלף ב-CMGF+ R/G. קיצורים: ROCK = קינאז הקשור ל-rho; GSKiβ = גליקוגן סינתאז קינאז בטא; CMGF + R/G = מדיום שלם עם גורמי גדילה משופרים עם מעכב ROCK ו- GSKiβ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
1. פרוטוקול זריעת תמיכה חדירה
- הקדמה של תוספות התמיכה החדירות
- הכן מדיום מלא עם גורמי גדילה משופרים עם מעכב חלבון קינאז הקשור ל-Rho (ROCK) ומעכב גליקוגן סינתאז קינאז-בטא (GSKiβ) (CMGF + R/G) על פי המידע בטבלה 1.
- הכינו דלי קרח והתחילו להפשיר את מטריצת הממברנה החוץ-תאית על הקרח. הניחו לוחית בעלת 24 בארות המכילה את מספר התוספות הדרוש באינקובטור לפני המלחמה. אספו קולגן בזנב חולדה I (3 מ"ג/מ"ל) והניחו אותו על קרח תוך הגנה מפני אור. אספו CMGF + R/G והניחו אותו על קרח.
- חשב את המספר הכולל של תוספות וחסרים הנדרשים לניסוי, תוך שמירה על 100 μL של תמיסת הציפוי עבור כל תוספת.
הערה: הכינו יותר תמיסת ציפוי מהנדרש; מומלץ להכין לפחות 15% יותר מהנדרש. - בצינור של 15 מ"ל, יש לערבב CMGF+ R/G עם מטריצת הממברנה החוץ-תאית (1%) והקולגן I (1%) ותערובת פיפט בעדינות.
- מצפים כל תוספת פוליאסטר ב-100 μL של תמיסת הציפוי ומניחים את התוספות באינקובטור (37 °C; 5% CO2 אטמוספירה) למשך שעה אחת.
- לאחר הדגירה, שאפו בזהירות את תמיסת הציפוי מכל תוסף באמצעות שאיפת ואקום או פיפטה P1000, תוך הקפדה שלא להפריע למסנן ההוספה. מניחים צלחת מוכנה באינקובטור כדי להתחמם.
- דיסוציאציה אורגנואידית של כלבים
הערה: השתמש באורגנואידים של כלבים שעברו תרבית במשך ארבעה ימים לפחות. לפני תחילת הדיסוציאציה, עיין ב- Gabriel et al.38 כדי לקבוע מתי דגימה היא בריאה, צפופה ומספיקה לניסויים. מומלץ לנתק באר אחת נוספת של אורגנואידים לכל הליך ציפוי באר. יתר על כן, מומלץ להגדיל את מספר התוספות הרצוי בכ-20% כדי להסביר צמיחה לא אחידה של אורגנואידים או נזק שנגרם כתוצאה ממניפולציה לא נכונה. אם אתם מתכננים להשתמש ב-FITC-dextran, הכינו בארות נוספות.- הכינו דלי קרח ובקבוקון של מלאי DMEM/F12 מתקדם קר 1x בארון הבטיחות הביולוגית.
- הניחו את מטריצת הממברנה החוץ-תאית על הקרח כדי להתחיל להפשיר, והטביעו אותו בקרח כדי להגן מפני הפשרה מהירה ולהימנע מהתמצקות. הניחו קופסה של קצות פיפטה (P200) במקפיא לציפוי מטריצת הממברנה החוץ-תאית.
- Prechill צנטריפוגה מקוררת עד 4 °C (75 °F).
- העבירו את CMGF+ R/G מהמקפיא/מקרר לאמבטיית מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. יש להימנע מחשיפה ישירה לאור במידת האפשר.
- יש להסיר את כל המדיום מצלחת 24-בארות בתרבית אורגנואידית עבור מספר מתאים של בארות (באר אחת של צלחת של 24 בארות לכל 2-4 תוספות) תוך הקפדה לא להפריע למטריצת הממברנה החוץ-תאית.
הערה: עוצמת הקול עשויה להשתנות בהתאם למערכת ספירת התאים שבה נעשה שימוש. - הוסיפו 0.5 מ"ל של תמיסת שחזור תאים קדם-תאית לכל באר כדי להמיס את כיפות מטריצת הממברנה החוץ-תאית.
- דגירה של הצלחת במקרר (4 מעלות צלזיוס) למשך 30 דקות.
- פיפט את ההשעיה, לאסוף את כל האורגנואידים ואת מטריצת הממברנה החוץ-תאית המומסת, ולהעביר אותם לצינור של 15 מ"ל.
- צנטריפוגה (700 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס) ומסירה את הסופרנטנט עד שהרמה מגיעה ל-0.5 מ"ל, תוך הקפדה לא להפריע לכדור.
- מוסיפים 1 מ"ל של פרוטאז דמוי טריפסין ודגירה באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות. הזיזו את הצינור מספר פעמים במהלך תקופת הדגירה כדי לערבב את התאים.
- העבירו את הצינורית עם הדגימה בחזרה לארון בטיחות ביולוגית והוסיפו באיטיות 7 מ"ל של DMEM/F12 מתקדם מקדים כדי להשבית את הפרוטאז דמוי הטריפסין ולעצור את דיסוציאציית התאים.
- הקדימו מסנן של 40 מיקרומטר עם 1 מ"ל של DMEM/F12 מתקדם. בעדינות לטפטף את התערובת ולסנן את ההשעיה דרך; פיפטה נוספת DMEM/F12 מתקדמת לשטיפת המסננת.
- צנטריפוגה את הצינור (700 × גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס) ולהסיר את supernatant. אין להפריע לכדור.
- בצעו החייאה של גלולת התאים בכ-50-100 מיקרול של מדיום תרבית (CMGF+ R/G) עבור כל באר של אורגנואידים שהייתה מנותקת.
- ספרו תת-דגימה של ההשעיה (כ-10 μL) באמצעות המוציטומטר או מכונה מתאימה וקבעו את מספר התא הכולל בהשעיה.
- זריעת אורגנואידים כלביים
- לדלל או לרכז את תרחיף התא כדי להשיג ריכוז תאים של כ-75,000 תאים למ"ל.
- זרע 100 μL של ההשעיה לתוך כל תוסף באמצעות BSA (1%) טיפים מוכנים מראש כדי למנוע הידבקות תאים במהלך ההעברה. הוסיפו תוסף מצופה אחד כריק ללא תאים מבלי שהאורגנואידים יגדלו ועדיין יקבלו שינויי מדיה קבועים.
- סובבו בעדינות את הצלחת בתנועה מעגלית במשך כ-30 שניות כדי לפזר את התאים הנזרעים על פני התוספת. אשר באמצעות מיקרוסקופיית אור את ההתפלגות השווה של התאים.
- הוסף 700 μL של CMGF + R/G לתא הבזולטרלי והנח את הצלחת באינקובטור (37 °C ; 5% CO2 אטמוספירה) במשך 24 שעות.
- לאחר 24 שעות, הסר בעדינות את מתלי התא מהתא האפיקלי והחלף אותו ב- 200 μL של CMGF + R/G. החזיר את הצלחת לאינקובטור.
2. פרוטוקול תחזוקה חד-שכבתי של תאים אורגנואידים
הערה: הסעיף הבא (שלבים 2.1-2.2) מתאר את פרוטוקול התחזוקה של מונו-שכבת התא האורגנואידי. זרימת העבודה של ההליכים המוצגים בפרוטוקול זה מסוכמת באיור 4. טבלה לרישום הערות שיכולה לסייע בסטנדרטיזציה של מדידות ערך TEER מוצגת בטבלה משלימה 1.
איור 4: זרימת עבודה של תחזוקת תרבות התמיכה החדירה. ערכי TEER נמדדים באמצעות אלקטרודות (בדיקות) ומד וולט/אוהם. בדיקות חייבות להיות מעוקרות כימית עם 70% אלכוהול לפני החדרתן לבארות. התוספות לתאים ריקים ואורגנואידים נמדדות, וערכי TEER מחושבים. מדיום מתרענן לאחר מכן הן בתאים אפיקליים והן בתאים בזולטרליים, ותרבית האורגנואידים הכלבית על התוספת מדמיינת באמצעות מיקרוסקופ אור. קרעים בתרבית אורגנואידית או בקרום מיקרו-נקבובי מצוין ומטופל על פי הפרוטוקול. קיצור: TEER = התנגדות חשמלית טרנס-פיתלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
- מדידת ערך TEER
הערה: מדידות ערך TEER מבוצעות באמצעות מד וולט/אוהם אפיתל עם חיבור מקלות אכילה. עיין בהוראות השימוש של היצרן. ערכי TEER מספקים מידע על שלמות החד-שכבתי האורגנואידי הכלבי.- קח את מדידות הערך של TEER בכל יום חלופי במהלך צמיחת תרביות תאים.
- העבר את מד ה-Epithelial Volt/Ohm ואת האלקטרודות שלו לארון הבטיחות הביולוגית. לעקר כימית את האלקטרודות ב-70% אלכוהול לפני השימוש. הגדר את הפונקציה ל- Ohms. יש להמתין לפחות דקה אחת עד שהאלקטרודות יתייבשו.
- לפני ביצוע המדידה הראשונה, הכנס את אלקטרודת החוט ליציאה והפעל את הכוח. ודא שהמד מציג 1,000 Ω עם תוספת אלקטרודת החוט במקום למדוד מקלות אכילה. אם זה לא המקרה, התאם את ההתקן.
- הכנס את האלקטרודות בתא האפיקלי והבזולטרלי של התוספת נטולת התאים (ריק), כך שהתא האפיקלי יכיל את האלקטרודה הקצרה יותר, והתא הבזולטרלי יכיל את האלקטרודה הארוכה יותר (כפי שניתן לראות באיור 4). אין לגעת בקרום, אך יחד עם זאת, ודא כי האלקטרודות שקועות בתווך.
- המתן מספר שניות עד שהערך יתייצב וציין את הערך בספר מעבדה. מודדים את שארית האורגנואידים האורגנואידים הכלביים, ומקפידים לעקר את האלקטרודות עם 70% אלכוהול בעת מדידת דגימות שונות. היזהרו לא לגעת במונולייר האורגנואידי עם האלקטרודה.
- לאחר ביצוע המדידות, לעקר את האלקטרודות עם 70% אלכוהול בפעם האחרונה. הקפד להגן עליהם מפני נזק שנגרם על ידי מניפולציה בלתי הולמת ולאחסן אותם על פי הוראות היצרן.
- חשב את ערכי TEER עבור כל באר באמצעות Eq (1), כאשרמדגם R ו- Rריק הם ערכי ה- ohm (Ω) מהבארות החד-שכבתיות והריקות, בהתאמה, והאזור (cm²) הוא זה של התוסף.
(1)
- אחזקה מונולאייר
הערה: סקור את תוכנית השינוי הבינוני המומלצת בטבלה 2.- באמצעות פיפטות פסטר חד פעמיות סטריליות בקוטר 9 אינץ' ושואף ואקום, יש לשאוף בעדינות את המדיום מהאפיקלית ולאחר מכן את התאים הבזולטרליים. הטה את הצלחת כדי לראות את המשטח הבינוני בבירור. הימנעו משאיפה קרובה מדי לממברנה המיקרו-נקבובית בתא האפי כדי למנוע נזק למונולייר של התא.
הערה: השתמש בצינור פסטר חדש בעת מעבר בין דוגמאות. פיפטות הן גם תחליף אפשרי להליך זה. - הוסיפו לאט את CMGF+ R/G באמצעות פיפטות P1000 המכוונות לדופן של התא האפי או הבזולטרלי. בצע את השינוי הבינוני בתא האפיקלי בזהירות רבה כדי למנוע פגיעה במונולייר.
- בדוק את הבארות כל יומיים תחת מיקרוסקופ אור, הערכת בריאות התרבית ומעקב אחר קרעים במונולייר האורגנואידי או בקרום המיקרו-נקבובי. השתמש במיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה כדי להדגיש פרטים על התרבית.
הערה: במקרה של קרעים חד-שכבתיים של אורגנואידים לכלבים, ניתן למונולאייר זמן להתאושש ולצמוח מחדש. במקרה של קרעים בקרום מיקרו-נקבובי, יש להוציא את הבאר מהניסוי.
- באמצעות פיפטות פסטר חד פעמיות סטריליות בקוטר 9 אינץ' ושואף ואקום, יש לשאוף בעדינות את המדיום מהאפיקלית ולאחר מכן את התאים הבזולטרליים. הטה את הצלחת כדי לראות את המשטח הבינוני בבירור. הימנעו משאיפה קרובה מדי לממברנה המיקרו-נקבובית בתא האפי כדי למנוע נזק למונולייר של התא.
(1)טבלה 2: המלצה לשינוי מדיה לתרביות אורגנואידיות. CMGF+ R/G משתנה בתא האפיקלי והבזולטרלי של הבארות כל יומיים בכל יום חלופי. תקופת התרבות הארוכה יותר בסוף השבוע דורשת נפח מוגבר של מדיום הן בתאים בסולטרליים והן בתאים אפיים, המיושם ביום שישי אחר הצהריים ומשתנה ביום שני. קיצורים: ROCK = קינאז הקשור ל-rho; GSKiβ = גליקוגן סינתאז קינאז בטא; CMGF + R/G = מדיום שלם עם גורמי גדילה משופרים עם מעכב ROCK ו- GSKiβ. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
3. פרוטוקול ניסוי חדירות
הערה: הסעיף הבא (שלבים 3.1-3.5) מתאר את פרוטוקול ניסוי החדירות. תהליך העבודה של פרוטוקול הניסוי למדידת חדירות ההאצנה של תרופה מסוכם באיור 5.
איור 5: זרימת העבודה של פרוטוקול הניסוי. יש לשנות את המדיום האורגנואידי מ-CMGF+ R/G ל-CMGF+ בין שמונה ל-12 יום לאחר זריעת התוספות, מה שמאפשר התמיינות תאית. לאחר שינוי המדיום (הן האפיקלי והן הבזולטרלי) ל-CMGF+, ערכי ה-TEER עדיין אמורים לגדול, כאשר ה-monolayer האורגנואידי הכלבי כמעט מגיע למפגש. לפחות ארבעה ימים לאחר שינוי המדיום ל- CMGF+, מוערך המוכנות של החד-שכבתיים. כאשר המונולייר נוצר לחלוטין, וערכי TEER מגיעים לשלב מישור (בדרך כלל בין 1,500 ל-2,500 Ω.ס"מ2), המדיום מוחלף במאגר התעבורה למשך 30 דקות כדי לאפשר למונולאייר להסתגל לסביבה החדשה. בזמן 0 דקות של הניסוי, מתבצעת בדיקת FITC-dextran, ונאסף דגימה בזולטרלית של 20 דקות. התוצאות מנותחות לאחר מכן בקורא צלחות. לאחר הניסוי, תוכן התא האפיקלי והבזולטרלי משתנה שוב ל-CMGF+, וקריאות ערכי TEER נלקחות. החד-שכבתיים מודגרים במשך 24 שעות, ותקינות החד-שכבתית מוערכת באמצעות מדידות TEER חוזרות ונשנות. קיצורים: TEER = התנגדות חשמלית טרנס-פיתלית; ROCK = קינאז הקשור ל-rho; GSKiβ = גליקוגן סינתאז קינאז בטא; CMGF + R/G = מדיום שלם עם גורמי גדילה משופרים עם מעכב ROCK ו- GSKiβ; CMGF+ = מדיום שלם עם גורמי גדילה אך ללא מעכב ROCK או GSKiβ; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט; F = פלואורסצנציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
- הערכת מוכנות אורגנואידית חד-שכבתית
הערה: שלב זה מתרחש 8-14 ימים לאחר הזריעה.- בדקו את החד-שכבתי לפחות אחת ליומיים תחת מיקרוסקופ האור (השתמשו בניגודי פאזה כדי להמחיש את שלמות החד-שכבתי). המשך לשלב הבא כאשר מונו-שכבת התא נוצרת במלואה ללא רווחים או סימנים נראים לעין של קרעים.
- שנה את המדיום האורגנואידי מ-CMGF+ R/G ל-CMGF+ (למעט מעכב ROCK ו-GSKiβ מהרכב הביניים). מומלץ להחליף את המדיום לפחות ארבעה ימים לפני הניסוי.
הערה: שלב זה יאפשר הבחנה נכונה של monolayer אורגנואידי. - המשך למדוד ערכי TEER בערך כל יומיים. כאשר ערכי TEER מתחילים להגיע לרמה של כ-1,500 עד 2,000 Ω ×-cm² (איור 6), מדוד את ערכי ה-TEER מדי יום.
הערה: ניתן לשמור על מצב יציב זה במשך כ-2-3 ימים, שהוא חלון הזמן האופטימלי לביצוע בדיקות חדירות (בדרך כלל בימים 11 עד 13). ערכי ה-TEER של הרמה עשויים להתנודד מעט בהתבסס על לוקליזציה של המעיים של האורגנואידים, טמפרטורת המדידה, הגזע, הגיל ומצב המחלה של הכלב. - תזמן את בדיקת חדירות התרופה באופן מיידי כדי למנוע ירידה מהירה בערכי TEER או צמיחת יתר של שכבת האורגנואידים לשכבות תאים מרובות.
- הכנה לניסוי
הערה: ניתן להשתמש בשייקרים של אינקובטור במהלך הניסוי כדי למנוע את ההשפעות של שכבת המים הלא יציבה. מדוד ערכי TEER בטמפרטורות עקביות.- ביום הניסוי, מדוד את ערכי TEER ואשר שהערכים הגיעו למצב יציב ואינם יורדים במהירות.
- בחר את המונוליירים הטובים ביותר (באמצעות מיקרוסקופיית אור וערכי TEER) מתוך עודף של 20% תוספות לביצוע הניסוי.
- התבוננו במונוליירים מתחת למיקרוסקופ אור ושללו מונו-שכבות אורגנואידיות לא שלמות, קרועות או מגודלות.
- הכן את מאגר ההובלה והתאם את ה- pH שלו לערכים הרצויים.
הערה: הרכב המאגר הניסיוני שונה בהתאם למערך הניסוי. מאגר הנמצא בשימוש תכוף מורכב מתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS), גלוקוז (12.5 mM) ו-4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזין אתאנסולפוניק (HEPES, 25 mM). הרכב זה מבטיח את הכדאיות של תרבית אורגנואידים במהלך ניסוי. - שאפו בזהירות את המדיום מהתאים האפיקליים והבזולטרליים של הבארות שנבחרו.
- הוסף 200 μL של חיץ הובלה לתא האפיקלי ו- 800 μL לתא הבזולטרלי.
הערה: יש להוסיף תחילה חיץ הובלה לתא האפי ולאחר מכן לתא הבזולטרלי כדי למנוע ניתוק של החד-שכבתי מהממברנה המיקרו-נקבובית. - הניחו את הצלחת באינקובטור (37 מעלות צלזיוס; 5% אטמוספירה של CO2 ) למשך 30 דקות כדי להתיישב.
הערה: החמוצים האורגנואידים הכלביים מוכנים כעת לניסוי חדירות התרופה.
- פריסה ניסיונית טיפוסית - פתרון ריכוז IgY
הערה: התכנון והפריסה של הניסוי עשויים להשתנות בהתאם לשאלת המחקר. החדירות של אימונוגלובולין Y (IgY) באמצעות מונולאייר אורגנואידי משמשת בפרוטוקול כדוגמה וניתנת לשינוי. המונח תא תורמים מתייחס לחדר שבו התרופה מיושמת בתחילה, בעוד שהתא המקבל מתייחס לחדר המקבל את התרופה מתא התורם. ניסוי טיפוסי אוסף דגימות בתאי המקלט במשך 2 שעות (למשל, 15, 30, 60, 90, 120 דקות).- הכן את תמיסת ה- IgY (תרופה או מומס לפי בחירה) על ידי המסתו במאגר ההובלה לריכוז הסופי הרצוי. הכינו יותר תמיסות תרופתיות מהנדרש.
הערה: תרופות עם מסיסות מימית נמוכה עשויות להיות מומסות תחילה בממס אורגני (למשל, אתנול, DMSO) לפני הוספתן למאגר. הריכוז הסופי של הממס צריך להיות פחות מ -1% כדי לא לפגוע במונולייר התא. - הסר את החיץ מתא התורם (תא אפיקלי או בזולטרלי) של כל באר.
- הוסף את תמיסת IgY (פתרון התרופה) לכל תאי התורמים. השתמש בתמיסה הנותרת כפתרון התורם בזמן 0 למדידת ריכוז התרופה הראשוני.
- בנקודות הזמן הנדרשות, הסר 50 μL מתא הקבלה והנח אותו בצינור מסומן. בנקודת הזמן האחרונה, הסר דגימה מתא התורם. בסוף הניסוי, העבירו את התורם ואת האליקוטים של המקבל למקפיא של -20 מעלות צלזיוס.
הערה: אם יש צורך בנקודות זמן רבות, ניתן לבצע החלפת מאגר בתא הקבלה, אך יש לקחת אותה בחשבון בחישוב החדירות הנראית לעין. הריכוז בתא המקלט לא צריך להגיע ליותר מ -10% מחדר התורם בסוף הניסוי כדי לשמור על תנאי הכיור44.
- הכן את תמיסת ה- IgY (תרופה או מומס לפי בחירה) על ידי המסתו במאגר ההובלה לריכוז הסופי הרצוי. הכינו יותר תמיסות תרופתיות מהנדרש.
- בקרת איכות חד-שכבתית של תאים אורגנואידים
הערה: ניתן להשתמש בתמיסת FITC-dextran כדי לאשר את שלמות החד-שכבתית במהלך הניסוי. FITC-dextran משמש כדוגמה לבדיקת שלמות חד-שכבתית. אחרים כוללים לוציפר צהוב, PEG-4000, מניטול עם תווית רדיו ואינולין44.- בזמן של 0 דקות, שאפו את תכולת התא האפיקלי והחליפו ב-250 μL של תמיסת FITC-dextran (5 מ"ג/מ"ל, 4 kDa) במשולש עבור כל קבוצת ניסוי.
הערה: אל תחשוף את FITC-dextran לאור. - לאחר 20 דקות, הסר את החיץ מהתא הבזולטרלי.
- מדוד את עוצמת הפלואורסצנציה של הדגימה הבזולטרלית באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטיים (השתמש בעקומת כיול; עירור שנקבע על 485 ננומטר וערך פליטה של 528 ננומטר).
הערה: ניתן לחשבאת אפליקציית P של FITC גם בשיטה המתוארת בדיון. - לאחר שהניסוי יסתיים, שאפו בזהירות למאגר עודף מהתאים האפיים והבזולטרליים.
- הוסף 200 μL של CMGF+ בתא האפיקלי ו- 700 μL לתא הבזולטרלי.
- מדוד ערכי TEER בבארות הבודדות.
- מניחים את הצלחת באינקובטור (37 מעלות צלזיוס; 5% אטמוספירת CO2 ) למשך 24 שעות.
- אם רלוונטי, לאחר 24 שעות, מדוד ערכי TEER כדי להעריך נזק אפשרי למונולאייר במהלך חלק בקרת האיכות של הניסוי. השתמש במיקרוסקופיה קלה כדי להמחיש את שלמותו של החד-שכבתי האורגנואידי הכלבי.
- בזמן של 0 דקות, שאפו את תכולת התא האפיקלי והחליפו ב-250 μL של תמיסת FITC-dextran (5 מ"ג/מ"ל, 4 kDa) במשולש עבור כל קבוצת ניסוי.
- תיקון חד-שכבתיים של תאים לניתוח במורד הזרם
- הכן תמיסת פורמלין-חומצה אצטית-אלכוהול (FAA, הרכב בטבלה 1).
- הסר את מאגר ההובלה או CMGF+ מהתאים האפיקליים והבזולטרליים באמצעות פיפטת P1000 או צינורות פסטר חד פעמיים סטריליים בגודל 9 אינץ' ושואף ואקום.
- מלאו את התאים האפיקליים והבסיסיים ב-FAA.
- לאחר 24 שעות, שאפו ל-FAA והחליפו אותו ב-70% אתנול.
- עוטפים את הצלחת בסרט מעבדה גמיש כדי למנוע אידוי וממשיכים לחסום את ההכנה.
איור 6: ערכי TEER בקבוצות ניסוי שונות. ערכי TEER נמדדו בחמש קבוצות של חד-שכבתיים אורגנואידים במעיים של כלבים. שלוש קבוצות הורכבו מאנטרואידים כלביים, ושתי קבוצות כללו קולונואידים. כל קבוצה כללה 12 עד 22 העתקים. ערכי TEER עבור תרביות אנטרואידיות ג'ג'ונאליות מוצגים מיום 4 עד יום 14, ותרביות קולונואידים מוצגות מיום 4 עד יום 12 (המדידות הסתיימו כאשר המונולייר האורגנואידי הגיע לערכי מצב יציב, מה שמעיד על כך שהמונולאייר היה מוכן לשימוש ניסיוני). פסי שגיאה מבטאים SEM של המדידות. קיצור: TEER = התנגדות חשמלית טרנס-פיתלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Representative Results
נהלי הפעלה סטנדרטיים לתרבית האורגנואידים הכלביים תוארו בעבר33, וגם פרוטוקול האורגנואידים של הכלבים נדון בפירוט בגיליון מיוחד זה38. אורגנואידים של מעיים כלביים בתרבית על תמיכות חדירות תוקנו והוטמעו בפרפין כדי לבחון את המיקרואנטומיה של המונולייר ואת אוכלוסיות התאים. תהליך הטמעת הפרפין נדון בעבר על ידי Gabriel et al.38. בוצעו צביעה שגרתית (המטוקסילין ואוזין), וטכניקת הכתם הכחולה האלקיאנית שימשה לאיתור תאי גביע במונולייר האורגנואידי הכלבי (ראו איור 7).
איור 7: צביעה חד-שכבתית אורגנואידית במעיים של כלבים. אורגנואידים של מעיים כלביים שמקורם במעי הגס בתמיכה החדירה הוטמעו בפרפין והוכתמו ב-H&E וב-AB. תמונות מייצגות צולמו באמצעות מיקרוסקופיה קלה בהגדלה של פי 40 (A) ו-60x (B). צביעת H&E חושפת חד-שכבת אפיתל טורית, וניתן לראות את המיקרוווילי בחלק האפיקלי של התאים בהגדלה של פי 60. צביעת AB חושפת עוד יותר את נוכחותם של תאי גביע (כחול כהה) במונולייה האורגנואידית של המעי הכלבי. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר (A), 50 מיקרומטר (B). קיצורים: H&E = המטוקסילין ואוזין; AB = כחול אלקי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
יש להגדיל את תרבית האורגנואידים על התמיכה החדירה למשך 10 עד 14 יום כדי להיות מוכנים לניסוי חדירות. מיקרוסקופיית אור משמשת בשילוב עם מדידות ערך TEER כדי לאשר את המוכנות של תרבית האורגנואידים לבדיקת חדירות של מועמדים לתרופות. איור 8 מוצגות תמונות מיקרוסקופיות קלות מייצגות של מונו-שכבות אורגנואידיות שונות במעיים כלביים מבעלי חיים בריאים וחולים.
איור 8: מיקרוסקופיה חד-שכבתית אורגנואידית של מעיים כלביים. תמונות של חד-שכבתיים גדלים כפי שהם נראים תחת מיקרוסקופיית אור. מונו-שכבות אורגנואידיות שמקורן בתורמים בריאים מיוצגות על ידי תרביות אנטרואידיות (10x; 40x) וקולונואידים (20x; 40x). מונו-שכבות אורגנואידיות של תורמים חולים מיוצגות על ידי תריסריון (5x; 10x) ואיליאל (5x; 10x) אנטרואידים שמקורם בחולה כלבים המאובחן עם PLE. שתי תרביות האורגנואידים של PLE הן דוגמאות לבידוד תאים לא תקין במהלך זריעת אורגנואידים, ותרביות אלה לא יכלו לשמש לבדיקות חדירות סמים בגלל נוכחותם של אורגנואידים תלת-ממדיים. דוגמאות לסטיות מהיווצרות חד-שכבתית תקינה, כגון קרעים חד-שכבתיים (5x), נגרמות על ידי מניפולציה לא אכפתית של הדגימות הביולוגיות. התרבית הממושכת של האורגנואידים (10x; 20x) נגרמת על ידי תחזוקה ארוכה של האורגנואידים על התוספת כאשר האורגנואידים מתחילים להידמות למבנה התלת-ממדי המקורי שלהם. לשם השוואה, מוצגות תמונות של קווי תאים דו-ממדיים מסורתיים על התמיכות החדירות המשמשות בדרך כלל למחקרי חדירות תרופות (MDCK-10x; 40x, ו- Caco-2-10x; 20x). קיצורים: PLE = אנטרופתיה מאבדת חלבון; MDCK = הכליה הכלבית מאדין-דארבי. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר (5x), 200 מיקרומטר (10x), 100 מיקרומטר (20x), 50 מיקרומטר (40x). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
מונו-שכבות אורגנואידיות תוקנו גם ב-3% פרפורמלדהיד-3% גלוטראלדהיד במי מלח עם מאגר פוספט (PBS). מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה (TEM) שימשה לאפיון מבנה האולטרה-מבנה של תרבית האורגנואידים על התמיכות החדירות. מבנים מיקרואנטומיים של מיקרוווילי וצמתים הדוקים ניתן לראות באיור 9.
איור 9: תמונות TEM של חד-שכבתיים אורגנואידים בריאים במעיים של כלבים. TEM שימש לחשיפת המיקרו-ארכיטקטורה התאית של חד-שכבתיים אורגנואידים ג'ג'ונאליים (A), איליאליים (B) וקולוניים (C). הממברנה המיקרו-נקבובית של תוסף התמיכה החדיר מסומנת בחץ צהוב. נוכחותם של מיקרוווילי (חץ כחול) וצמתים הדוקים (חץ אדום) מסומנת בתמונות. קיצור: TEM = מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. סרגלי קנה מידה = 5 מיקרומטר (A), 2 מיקרומטר (B, C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
יש לבצע הן מדידות TEER והן מיקרוסקופיית אור כדי להבטיח שהמערכת מוכנה לבדיקת חדירות. הבדיקה מוכנה לשימוש כאשר TEER מגיע למצב יציב, בעוד שמיקרוסקופיה קלה תסייע למנוע נזק או צמיחת יתר של האורגנואידים. סיכום של מדידות TEER טיפוסיות של חמש קבוצות המורכבות מאנטרואידים כלביים וקולונואידים מוצג באיור 6.
טבלה 1: הרכב המדיה האורגנואידית וה-FAA. ההרכב המלא של CMGF+, CMGF+ R/G ו-FAA מסוכמים בטבלה זו. קיצורים: ROCK = קינאז הקשור ל-rho; GSKiβ = גליקוגן סינתאז קינאז בטא; CMGF + R/G = מדיום שלם עם גורמי גדילה משופרים עם מעכב ROCK ו- GSKiβ; CMGF+ = מדיום שלם עם גורמי גדילה אך ללא מעכב ROCK או GSKiβ; FAA = פורמלין-חומצה אצטית-אלכוהול; EGF =גורם גדילה אפידרמלי. טבלה זו מותאמת מ-38. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה משלימה 1: טבלה לרישום הערות על אורגנואיד כלבים מערכת התמיכה החדירה. קיצורים: TEER = התנגדות חשמלית טרנס-פיתלית; ROCK = קינאז הקשור ל-rho; GSKiβ = גליקוגן סינתאז קינאז בטא; CMGF + R/G = מדיום שלם עם גורמי גדילה משופרים עם מעכב ROCK ו- GSKiβ; CMGF+ = מדיום שלם עם גורמי גדילה אך ללא מעכב ROCK או GSKiβ. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Discussion
תרביות אורגנואידים של מעיים כלביות במנגנון התמיכה החדיר הן מושג ייחודי המחבר בין מבחני חדירות סמים מסורתיים40 לבין מודל חדשני של כלבי מבחנה 41. ניתן להשתמש ולהעריך סוגים שונים של אורגנואידים במעיים כלבים על סמך מטרת הניסוי עם התאמות מינימליות. מומלץ לבדוק ריכוזים מרובים של התרופה המעניינת 3-4 בארות לכל קבוצה. הריכוזים עשויים להתבסס על ריכוז המעיים הצפוי של התרופה. יתר על כן, שימוש במחקרים קודמים עשוי לסייע בקביעת נקודות זמן מתאימות לתכנון המחקר. יש לבצע תיעוד מתאים של תכנון המחקר כדי להגביר את השכפול ולסייע בפתרון בעיות.
לטכנולוגיה זו יש מספר מגבלות בשל החידוש של השיטה42, בעיקר בשל היעדר סטנדרטיזציה בתכנון הניסוי ובביצוע הפרוטוקול במעבדות שונות. חוסר סטנדרטיזציה זה הוכר על ידי קבוצות אחרות43, ופרוטוקולי האורגנואידים Monolayer של הכלבים 3D יובילו לשכפול בין-שכבתי ויכניסו סטנדרטיזציה למערכת זו. גישות סטנדרטיות לניתוח נתונים משפרות את השכפול ויכולות לחזק את התוצאות של בדיקות סמים ראשוניות באמצעות האורגנואידים הכלביים במערכת התמיכה החדירה במעבדות שונות. המודל האורגנואידי התלת-ממדי של הכלב חסר גם מערכי נתונים המשווים בין ערכיאפליקציית In vitro P של תרופות מודל לספיגת מעיים אנושית או כלבית in vivo הידועה שלהן, בדומה לתאי Caco-2 44,45,46. לאחר שנתונים כאלה נוצרו, ניתן להשתמש במודל האורגנואידים הכלבי הזה כדי להעריך את חדירות המעיים במהלך פיתוח תרופות.
חשוב מאוד להיזהר בעת זריעת האורגנואידים על מערכת התמיכה החדירה כדי לזרוע צפיפות גבוהה מספיק של תאים מנותקים כראוי. ערכי ה- TEER של המערכת אמינים יותר וניתנים לשחזור כאשר הם גדלים בשכבות חד-שכבתיות קפדניות. תרבית ממושכת של החד-שכבתיים יכולה להוביל לעלייה אקספוננציאלית בערכי TEER המגיעים רחוק יותר מהערכים הפיזיולוגיים של המעי. מקטעי H&E של מבנים תלת-ממדיים כאלה מראים מספר שכבות של תאים זה מעל זה עם מבנים משתנים של אנטרוציטים הקרובים יותר לממברנה.
לאחר הרחבה מוצלחת של מונולאייר האורגנואידי של מעי הכלבים, ניתן לנתח את התוצאות באותו אופן כמו מבחני תאים דו-ממדיים מסורתיים על ידי חישוב מקדם החדירות לכאורה של התרופה (P app) פורמולה44. ערךאפליקציית P (ראה Eq (2)) מתאר את קצב ההובלה על פני החד-שכבתי התאי47.
(2)
זהו 
השיפוע ההתחלתי של הריכוז לעומת עקומת הזמן (למשל, nmol/s). A הוא שטח התוספת (ס"מ2), ו - C0 הוא הריכוז הראשוני של התרופה או התרכובת בתא התורם37. הכרה אמינה בשלמות החד-שכבתית היא חלק מכריע בבדיקת החדירות הדורשת סטנדרטיזציה. מיקרוסקופיית אור ומדידות TEER מומלצות כדי להעריך אורגנואידים של כלבים במערכת תמיכה חדירה ולסייע בקביעת התזמון הנכון של הניסוי. בנוסף, סמני חדירות מולקולרית אפסיים (למשל, FITC-dextran, לוציפר צהוב, PEG-400) יכולים לשמש להערכה פונקציונלית של שלמות חד-שכבתית אורגנואידית. יש לשים לב אם התרכובת שנבדקה מושפעת על ידי טרנספורטר. P-גליקופרוטאין (P-gp) משמש כדוגמה נפוצה למשאבת efflux. יש ליצור יחס efflux (אפליקציית P, אפליקציית BL-AP/P, AP-BL) בהשוואה למצע בדיקה P-gp ידוע.
מיקרוסקופיית אור (רגילה או משופרת עם ניגודיות פאזה) היא שיטה שלא תסולא בפז לבדוק את שלמות השכבה הדו-ממדית או התלת-ממדית ואת תוספת המסנן תוך הערכת צמיחת יתר תאית אפשרית. איור 7 יכול לשמש כמדריך לזיהוי תרביות תאי אורגנואידים בריאים של מעיים כלביים. ערכי TEER הם מדד חשוב להיווצרותם של צמתים בין-תאיים ולהבחנה של תרביות האורגנואידים לאפיתל מעיים שלם. האורגנואידים של המעי הכלבי מתמיינים לאנטרוציטים ולתאי גביע (איור 6). תאים אלה המייצרים ריר מאפשרים לחקור אינטראקציות בין תרופות לליחה, דבר שהיה קשה להשיג באמצעות תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות48. נוכחותם של תאים אנטרואנדוקריניים אושרה בעבר באורגנואידים של מעיים כלביים על ידי Chandra et al.33.
ניתן אפיון נוסף של מונו-שכבות האורגנואידים הכלביים שמקורם באורגנואידים ג'ונאליים, איליאליים ומעי גסים באמצעות TEM. תמונות TEM מראות מיקרו-ארכיטקטורה תאית, כולל צמתים הדוקים והיווצרות מיקרוווילי, מה שממחיש עוד יותר את המורכבות והתועלת של מודלים אורגנואידיים אלה ברפואה תרגומית. בהתבסס על תוצאות הניסוי, תרביות האורגנואידים על התמיכה החדירה היו מוכנות לניסויים בין הימים ה-11 ליום ה-13 לאחר הזריעה (איור 9). ערכי TEER בנקודת זמן זו נעו בין 1,500 ל- 2,500 Ω.cm2. שלב המישור של ערכי TEER נמשך לחלון זמן מוגבל מאוד שבו יש להתחיל בניסוי לפני שערכי TEER מתחילים לרדת לאט. ערכי TEER יכולים גם להיות חלק מכריע בהצגת תוצאות ניסוי חשובות מכיוון שתרופות מסוימות או תוצרי תרופות עשויים לקיים אינטראקציה עם החד-שכבתי (למשל, צמתים הדוקים), מה שיכול להשפיע מאוד על קריאות הערך של TEER. זה לבדו יכול לשמש כנתונים לניסוי.
ניתן ליישם אורגנואידים של מעיים כלביים במנגנון תרבית תאים דו-תאיים בתחומים שאינם חדירות תרופה דרך הפה בשל הארכיטקטורה הייחודית של חד שכבת התא המתקבלת. לדוגמה, ניתן להשתמש בהם במחקר מיקרוביולוגי (למשל, ההשפעה של שינוי הצומח המיקרוביאלי של מערכת העיכול), במחקרי ספיגה של נגיפים, באינטראקציות בין תרופות לתרופות ובמנגנוני הובלת תרופות49. תא התורם מלא בדרך כלל בתרופת הבדיקה או בתרכובת המועדפת, ואליקוטים מתא המקלט נלקחים בנקודות זמן שונות. ניתן לנתח את האליקוטים הללו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, ספקטרומטריית מסה, בדיקה חיסונית הקשורה לאנזים, או טכניקות אחרות כדי לקבוע את הכמות והמהירות שבה המומס מחלחל דרך המומס דרך החד-שכבתי.
מחקרים אלה דורשים מונו-שכבתי שלם כדי להעריך במדויק את חדירות התרופות. זה בדרך כלל דורש גידול מונו-שכבות העולה על אלה הדרושות כדי להסביר בארות שאינן שמישות. מונו-שכבות של תאים אורגנואידים יכולות לשמש גם למדידת ספיגה נגיפית מהצד האפיקלי או הבסיסי של מונולאייר, עם קריאות הכוללות נוגדנים המשתמשים בבדיקות אימונופלואורסצנטיות כדי לזהות את הספיגה התאית של הנגיף. לבסוף, ניתן ליישם מספר תרופות (כלומר, מצע ומעכב) על תא התורם כדי לזהות אינטראקציות בין תרופות לתרופות טרנספורטר.
בהתבסס על התצפיות הנוכחיות, שיטות אלה לא רק יחולו על אורגנואידים של כלבים בתוספות תרבית, אלא גם יתאימו למינים וטרינריים אחרים ולמערכות איברים, עם שינויים קלים הדרושים כדי להתאים בצורה הטובה ביותר למין או למודל האיברים המועדף. היה צורך להתאים את הפרוטוקולים לצמיחת האורגנואידים של המעי הכלבי על סמך התכונות הייחודיות של התרבית. לפיכך, ניתן להתאים את הפרוטוקול למין אחר אך ידרוש שינויים עדינים בפרוטוקול. שינויים עשויים להתחיל בשינויים בצפיפות זריעת התאים ולהתרחב לשינויים בהרכב המדיה כדי להבדיל כראוי בין האורגנואידים המעניינים.
הסטנדרטיזציה, התיעוד המפורט של ההליכים הניסוייים והניטור העקבי של חד-שכבתי התאים הם פרקטיקות חיוניות הדרושות במבחני התמיכה החדירים ואינם מוגבלים למערכת הכלבים. מינים אפשריים אלה או שינויים באיברים הם קריטיים לתיעוד ולדיווח על התקדמות נוספת בתחום. למודל זה יש מספר מגבלות, לדוגמה, דרישות העלות שלו, השתנות בין-שכבתית ונתונים מוגבלים על היכולת לחזות את ספיגת המעיים in vivo. לכלבים, במקרים מסוימים, יש מובילי סמים שונים ואנזימים מטבוליים מאשר בני אדם50.
יתר על כן, יש לבדוק את המערכת האורגנואידית הכלבית על מגוון מנגנונים דו-תאיים אחרים מיצרנים אחרים כדי לקבוע את התאמתו של דגם כזה (למשל, יש לקבוע את ההתאמה של הרכבי ממברנות מסנן שונים). חיסרון נוסף הוא שהחלק של ניסוי חדירות התרופה בכתב היד הוא פחות תיאורי מהחלקים הקודמים. זה נגרם על ידי עודף של מידע בתחום זה. המטרה של חלק זה של כתב היד הייתה לתאר את השיטות הללו בצורה ניתנת לשינוי, מבלי לחתוך את קצוות אבני היסוד של ניסויים אלה. מידע מפורט יותר על ניסויי חדירות נאסף על ידי Hubatsch et al.37. בנוסף, ניתן להשתמש בתוספות חדירות בקוקולטורה, נדידת תאים וניסויי בדיקת פלישה4.
לסיכום, לאורגנואידים של המעיים הכלביים במנגנוני תרבית דו-תאיים יש פוטנציאל לשמש במגוון רחב של יישומים, כולל תחומים ביו-רפואיים ורפואה תרגומית, בין היתר. הפרוטוקולים יוצרים מספר אסטרטגיות לתכנון ניסוי ולקידום מהימנות נתונים בין-שכבתית עבור מודלים אורגנואידים ברחבי תחום הביולוגיה.
Disclosures
ק. אלנספאך הוא מייסד שותף של LifEngine Animal Health ופתרונות בריאות בתלת-ממד. היא משמשת כיועצת ל-Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics ו-Mars. J.P. Mochel הוא מייסד שותף של LifEngine Animal Health ופתרונות בריאות 3D ומשמש כיועץ לבריאות בעלי חיים של Ceva ולבריאות בעלי חיים אתוס. מאמר זה משקף את דעותיהם של המחברים ואין לפרשו כמייצג את התמיכה, ההשקפה או המדיניות של מנהל המזון והתרופות האמריקאי. למחברים אחרים אין כל ניגוד עניינים להצהיר עליו.
Acknowledgments
אנו רוצים להביע תודה למעבדה לאבחון וטרינרי של עובדי אוניברסיטת איווה סטייט, כלומר היילי למברט, אמילי רהה, רוזלין בראנמן, ויקטוריה גרין וג'ניפר גרואלץ-ת'ראש, על העיבוד בזמן של דגימות. אנו רוצים גם להודות לג'ודי סמית' ובת'אן ולנטיין על שסיפקו חומר לניסויי החדירות. אנו רוצים גם להודות לדוד דיאז-רגנון על עזרתו באיור 9. למעט איור 6, כל הדמויות נוצרו BioRender.com. המחברים מבקשים להודות לתמיכה של סטארט-אפ הפקולטה, פרס ISU VPR Miller, פרס ISU VPR Miller, ו- NSF SBIR תת-מחלקה ל- ISU # 1912948.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organoid media | |||
| ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| FBS | Corning | 35-010-CV | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute |
| HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
| Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
| TMS (trimethoprim sulfate) | Sigma | T7883-5G | |
| Reagents | |||
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
| alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous | Acros Organics | 170080010 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
| FITC-CM-Dextran | Millipore Sigma | 68059-1G | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14025-076 | |
| Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
| PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
| Materials and Equipment | |||
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 9" Pasteur Pipets | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning | 3470 | Permeable Support |
| Millicell ERS (Probes) | Millipore Sigma | MERSSTX01 | |
| Millicell ERS-2 Voltohmmeter | Millipore Sigma | MERS00002 | |
| Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
| Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Flexible Laboratory Film |
| Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |
References
- Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments JoVE. (80), e50638 (2013).
- Youhanna, S., Lauschke, V. M. The Past, present and future of intestinal in vitro cell systems for drug absorption studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (1), 50-65 (2021).
- Belic, S., et al. Comparative analysis of inflammatory cytokine release and alveolar epithelial barrier invasion in a transwell®bilayer model of mucormycosis. Frontiers in Microbiology. 3204, 3204 (2019).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51046 (2014).
- Rönkkö, S., Vellonen, K. S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Dahlgren, D., Lennernäs, H. Intestinal permeability and drug absorption: predictive experimental, computational and in vivo approaches. Pharmaceutics. 11 (8), 411 (2019).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
- Natoli, M., Leoni, B. D., D’Agnano, I., Zucco, F., Felsani, A. Good Caco-2 cell culture practices. Toxicology in Vitro. 26 (8), 1243-1246 (2012).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Chandler, M., et al. Obesity and associated comorbidities in people and companion animals: a One Health perspective. Journal of Comparative Pathology. 156 (4), 296-309 (2017).
- Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. Microbiome. 6 (1), 72 (2018).
- Galeta, P., Lázničková-Galetová, M., Sablin, M., Germonpré, M. Morphological evidence for early dog domestication in the European Pleistocene: New evidence from a randomization approach to group differences. Anatomical Record. 304 (1), 42-62 (2021).
- Kleinert, M., et al. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nature Reviews Endocrinology. 14 (3), 140-162 (2018).
- Allenspach, K., Wieland, B., Gröne, A., Gaschen, F. Chronic enteropathies in dogs: Evaluation of risk factors for negative outcome. Journal of Veterinary Internal Medicine. 21 (4), 700-708 (2007).
- Wang, J., et al. Proliferative and invasive colorectal tumors in pet dogs provide unique insights into human colorectal cancer. Cancers. 10 (9), 330 (2018).
- Gillespie, V., Baer, K., Farrelly, J., Craft, D., Luong, R. Canine gastrointestinal stromal tumors: Immunohistochemical expression of CD34 and examination of prognostic indicators including proliferation markers Ki67 and AgNOR. Veterinary Pathology. 48 (1), 283-291 (2011).
- Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).
- Schneider, B., et al. Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: the One Health initiative. CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).
- Artursson, P., Palm, K., Luthman, K. Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 22 (1-2), 67-84 (1996).
- Balimane, P. V., Han, Y. H., Chong, S. Current industrial practices of assessing permeability and P-glycoprotein interaction. AAPS Journal. 8 (1), 1-13 (2006).
- Sambuy, Y., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Calcagno, A. M., Ludwig, J. A., Fostel, J. M., Gottesman, M. M., Ambudkar, S. V. Comparison of drug transporter levels in normal colon, colon cancer, and caco-2 cells: Impact on drug disposition and discovery. Molecular Pharmaceutics. 3 (1), 87-93 (2006).
- Hilgendorf, C., et al. Expression of thirty-six drug transporter genes in human intestine, liver, kidney, and organotypic cell lines. Drug Metabolism and Disposition. 35 (8), 1333 (2007).
- Seithel, A., Karlsson, J., Hilgendorf, C., Björquist, A., Ungell, A. L. Variability in mRNA expression of ABC- and SLC-transporters in human intestinal cells: Comparison between human segments and Caco-2 cells. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (4), 291-299 (2006).
- Volpe, D. A. Transporter assays as useful in vitro tools in drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 11 (1), 91-103 (2016).
- Hoffmann, P., et al. Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells as a model for studying physiological properties and toxin-induced effects on intestinal cells. PLoS ONE. 16 (10), 257824 (2021).
- Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Thummel, K. E., et al. Transcriptional control of intestinal cytochrome P-4503A by 1α,25-dihydroxy vitamin D3. Molecular Pharmacology. 60 (6), 1399-1406 (2001).
- Kodama, N., et al. Characteristic analysis of intestinal transport in enterocyte-like cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. Drug Metabolism and Disposition. 44 (10), 1662-1667 (2016).
- Akazawa, T., et al. Application of intestinal epithelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells for studies of prodrug hydrolysis and drug absorption in the small intestine. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 46 (11), 1497-1506 (2018).
- Lo, B., Parham, L. Ethical issues in stem cell research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
- Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).
- Zdyrski, C., et al. Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation. Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).
- Nantasanti, S., et al. Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids. Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Gabriel, V., et al. Standardization and maintenance of 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (179), e63515 (2022).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
- van Breemen, R. B., Li, Y. Caco-2 cell permeability assays to measure drug absorption. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 1 (2), 175-185 (2005).
- Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-Arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Olivatti, T. O. F., Alcantara, G. P., Lemos, A. C. C. E., Silva, M. G., Miot, H. A. Standardization of organoid culture for evaluation of melanogenesis induced by UVB, UVA and visible light. Anais Brasileiros de Dermatologia. 95 (1), 46-51 (2020).
- Volpe, D. A., et al. Classification of drug permeability with a Caco-2 cell monolayer assay. Clinical Research and Regulatory Affairs. 24 (1), 39-47 (2007).
- Chen, C., Ma, M. G., Fullenwider, C. L., Chen, W. G., Sadeque, A. J. M. Biopharmaceutics permeability classification of lorcaserin, a selective 5-hydroxytryptamine 2C agonist: Method suitability and permeability class membership. Molecular Pharmaceutics. 10 (12), 4739-4745 (2013).
- Jarc, T., et al. Demonstrating suitability of the Caco-2 cell model for BCS-based biowaiver according to the recent FDA and ICH harmonised guidelines. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 71 (8), 1231-1242 (2019).
- Newby, D., Freitas, A. A., Ghafourian, T. Decision trees to characterise the roles of permeability and solubility on the prediction of oral absorption. European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 751-765 (2015).
- Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS ONE. 8 (7), 68761 (2013).
- Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
- Martinez, M. N., Mochel, J. P., Neuhoff, S., Pade, D. Comparison of canine and human physiological factors: understanding interspecies differences that impact drug pharmacokinetics. The AAPS Journal. 23 (3), 59 (2021).
