Summary
Her presenterer vi en protokoll som beskriver kulturen til hundens tarmorganoider i et dobbeltkammer, gjennomtrengelig støttesystem. Organoidsåing i de permeable støttene, monolagsvedlikeholdet og påfølgende legemiddelpermeabilitetseksperimenter er beskrevet.
Abstract
Det gjennomtrengelige støttesystemet brukes vanligvis sammen med tradisjonelle todimensjonale (2D) cellelinjer som et in vitro-verktøy for å evaluere den orale permeabiliteten til nye terapeutiske legemiddelkandidater. Imidlertid har bruken av disse konvensjonelle cellelinjene begrensninger, for eksempel endret uttrykk for tette kryss, delvis celledifferensiering og fravær av viktige nukleare reseptorer. Til tross for disse manglene er Caco-2- og MDCK-modellene allment akseptert og validert for prediksjon av human in vivo oral permeabilitet.
Hunder er en relevant translasjonsmodell for biomedisinsk forskning på grunn av deres likheter i gastrointestinal anatomi og tarmmikroflora med mennesker. Følgelig, og til støtte for parallell legemiddelutvikling, er utarbeidelsen av et effektivt og nøyaktig in vitro-verktøy for å forutsi in vivo legemiddelpermeabilitetsegenskaper både hos hunder og mennesker svært ønskelig. Et slikt verktøy kan være hundens tarmorganoidsystem, preget av tredimensjonale (3D), selvmonterte epitelstrukturer avledet fra voksne stamceller.
(1) Permeable Support Seeding Protocol beskriver eksperimentelle metoder for dissosiering og såing av hundeorganoider i innsatsene. Organoid isolering, kultur og innhøsting av hunder er tidligere beskrevet i et eget sett med protokoller i dette spesialnummeret. Metoder for generell vedlikehold av hundens intestinale organoid monolag er grundig omtalt i (2) Monolayer Maintenance Protocol. I tillegg beskriver denne protokollen metoder for å vurdere monolagets strukturelle integritet via transepitelial elektrisk motstand (TEER) målinger og lysmikroskopi. Til slutt beskriver (3) Permeability Experimental Protocol oppgavene direkte før et eksperiment, inkludert in vitro validering av eksperimentelle resultater.
Samlet sett overvinner hundens organoidmodell, kombinert med en tokammercellekulturteknologi, begrensninger forbundet med 2D-eksperimentelle modeller, og forbedrer dermed påliteligheten av spådommer om den tilsynelatende orale permeabiliteten til terapeutiske legemiddelkandidater både hos hunden og den menneskelige pasienten.
Introduction
Permeable støttesystemer brukes vanligvis til å bestemme den tilsynelatende permeabiliteten til terapeutiske legemiddelkandidater gjennom tarmepitelbarrieren 1,2. De kan også brukes til å vurdere cellulær sekresjon3, cellemigrasjon4 og legemiddeltoksisitet5. In vitro orale legemiddelpermeabilitetsanalyser er et sentralt trinn i legemiddeloppdagelses- og utviklingsprosessen2, med individuelle legemiddelkandidater som testes i det tidlige stadiet av stoffets FoU-livssyklus6. Det permeable støttesystemet er et dobbeltkammercellekulturapparat bestående av en innsats med en semiporøs membran plassert i en multiwell plate. Dette systemet gir direkte tilgang til de apikale og basolaterale sidene av et cellemonolag dyrket i innsatsen7. Monolaget som brukes i disse systemene er vanligvis avledet fra gastrointestinale epitelceller (f.eks. Human kolorektal adenokarsinom Caco-2 cellelinje)8. Cellekulturer vokser i en polarisert tilstand som etterligner den naturlige mikroarkitekturen til tarmepitelceller, noe som muliggjør ytterligere cellulær differensiering, lignende mikroanatomi og funksjon7. Detaljer om det gjennomtrengelige støtteinnlegget finner du i figur 1. Såingen av innsatsene med 2D-cellekulturer, tradisjonelt brukt til å vurdere intestinal legemiddelpermeabilitet, er relativt rimelig og lett å dyrke9. Disse systemene presenterer flere store begrensninger, inkludert deres begrensede kapasitet til å forutsi tarmmetabolismen til terapeutiske legemiddelkandidater10,11. Dette gjelder for alle mekanismer for legemiddelabsorpsjon, det være seg passiv absorpsjon gjennom de tette kryssene mellom epitelceller, aktiv transepitelial absorpsjon gjennom effluks eller opptakstransportører (f.eks. P-glykoprotein, monokarboksylattransportør 1) og legemidler som metaboliseres av enterocytter.
Hunder deler et felles miljø og kosthold med mennesker12. Hundens tarmanatomi og mikrobiomsammensetning ligner på mennesker13, som har blitt tilskrevet domestisering og delte dietter de siste 36 000 årene14. Dessverre kan disse likhetene også være vanlige årsaker /utløsere for sykdomsutvikling. Hunder utvikler lignende kroniske sykeligheter som mennesker, som fedme15, inflammatorisk tarmsykdom16, kolorektal adenokarsinom17, gastrointestinal stromal tumor (GIST)18 og forskjellige andre patologier assosiert med deres relative levetid19. Følgelig kan hundeorganoider med hell brukes til omvendt translasjonsforskning av disse kroniske multifaktorielle sykdommene i ånden av One Health Initiative20.
Caco-2-celler er de mest brukte cellelinjene for legemiddel oral absorpsjonsanalyser21. Disse cellene regnes for tiden som "gullstandard" -modellen for in vitro intestinal permeabilitetsanalyser 2,22,23. Caco-2-cellelinjen uttrykker effluks- og opptakstransportører som finnes i menneskets tarmkanal, men på forskjellige uttrykksnivåer 24,25,26. Caco-2-celler er også mye brukt som modeller for å avgjøre om et stoff er et substrat eller en hemmer av intestinale efflukstransportører22,27. Selv om Caco-2-cellene er av kolon opprinnelse, etterligner de en enterocytcelle. Dessverre representerer Caco-2-celler bare en celletype fra epitellaget i tynntarmen9, som ikke klarer å rekapitulere den komplekse tarmepitelcelletypesammensetningen nøyaktig. For eksempel er begerceller dedikert til slimproduksjon fraværende fra Caco-2-kulturer slik at slim-legemiddelinteraksjoner ikke kan vurderes uten kokultur med andre cellelinjer28. Videre uttrykker ikke Caco-2-kulturer flere av de viktige nukleære reseptorene som vanligvis er tilstede i tarmen, for eksempel pregnane X-reseptor (PXR), steroid X-reseptor (SXR) og konstitutiv androstanreseptor (CAR)29. Følgelig klarer ikke Caco-2-kulturer å modellere induksjonen av legemiddeltransportører og enzymer av visse legemidler som er induktorer av disse reseptorene (f.eks. rifampin)30.
3D intestinal organoid-teknologien adresserer noen av disse begrensningene19. Organoider er selvmonterte konstruksjoner avledet fra voksne stamceller som kan etableres fra vevsprøver høstet ved hjelp av mikroinvasive teknikker20. Menneskeinduserte pluripotente stamceller brukes til intestinale permeabilitetsmodeller31,32. Hundeorganoider gir et relevant alternativ til menneskelige organoider fordi menneskelig stamcelleforskning er begrenset av etiske problemstillinger33. Videre gir hundeorganoider et in vitro-system for å utforske hundens legemiddelpermeabilitet, metabolisme, aktiv transport og legemiddelinteraksjoner. For å løse dette teknologigapet er den konsistente og pålitelige veksten av hundens tarmorganoider i et gjennomtrengelig støttesystem beskrevet34. En permeabilitetsanalyse med hundens tarmorganoider kan potensielt forutsi hundens tarmpermeabilitet og metabolisme av små legemiddelmolekyler sammenlignet med nåværende analyser (Caco-2). Bekreftelse av disse sentrale egenskapene gir dette nye in vitro-systemet til fremtidig arbeid med å utforske den potensielle effekten av induktorer på intracellulær metabolisme og aktiv transport.
Canine organoider består av alle celletyper som vanligvis er tilstede i epitellaget i tarmen. Fra et funksjonelt og mikroanatomisk syn replikerer de pålitelig miljøet i epitellaget av hundens tarm19,35. Videre er tilstedeværelsen av slim, hundespesifikke legemiddeltransportører og enzymer, og generell cellulær differensiering i hundens tarmorganoider sammenlignbar med det som ses in vivo hos hunder34. Dermed kan organoider isoleres fra syke veterinærpasienter og brukes til å modellere effekten av ulike sykdomsprosesser (f.eks. Kronisk tarmbetennelse) på hundens orale legemiddelpermeabilitet19,36. Hundens tarmorganoidsystem kan også brukes i andre innstillinger enn eksperimenter med legemiddelpermeabilitet. Disse 3D-strukturene kan også isoleres fra syke pasienter som tidligere beskrevet av Chandra et al. for inflammatorisk tarmsykdom, kolorektal adenokarsinom og gastrointestinal stromal tumor19.
Permeable Support Seeding Protocol beskriver metoder for å etablere tarmorganoidkulturer hos hunder i innleggene. Denne første protokollen skisserer metoder for å dissosiere etablerte hundeorganoidkulturer belagt i den ekstracellulære membranmatrisen. Videre diskuteres forfyllingen av innsatsene med kollagen I og den ekstracellulære membranmatrisen i denne protokollen. Innebygging av hundeorganoider i de permeable støtteinnsatsene er også beskrevet i detalj.
Den andre protokollen er Monolayer Maintenance Protocol, som inkluderer generell vedlikehold av hundens 3D-organoider belagt i et innlegg. Frekvensen og volumene av organoidmediet som brukes til å oppdatere kulturen, og måter å forhindre cellekulturskader på, presenteres i denne andre protokollen, sammen med eksperimentelle metoder for å vurdere sammenløpet av epitelmonolaget.
Endelig fokuserer permeabilitetseksperimentell protokoll på måter å avgjøre om hundens intestinale 3D-organoider i en permeabilitetsanalyse er klare for eksperimentell bruk og verifikasjonstrinnene som trengs før du utfører et eksperiment. Denne delen beskriver også oppsettet og vellykket gjennomføring av et permeabilitetseksperiment, sammen med inkubasjon og prøvetaking av terapeutiske legemiddelkandidater i kamrene i monolagskulturen. Bruken av fluoresceinisotiocyanat med lav permeabilitet (FITC-dextran) for å overvåke monolagsintegritet diskuteres også. Til slutt beskrives en in vitro evalueringsmetode for validering av resultatene etter avslutningen av et eksperiment. Permeabilitetseksperimenter er et ekstremt stort tema og er veldig godt oppsummert av Hubatsch et al.37. Arbeidsflyten til protokollene er oppsummert i figur 2.
Figur 1: Tarmorganoider hos hunder på et gjennomtrengelig støttesystem. Den permeable støtteinnsatsen er plassert i en brønn på en 24-brønns plate. Den mikroporøse membranen tillater såing av dissosierte tarmorganoider hos hunder, og disse cellene vil til slutt danne et organoid 2D-monolag. Denne teknologien gir tilgang til både AP- og BL-sidene av monolaget. Organoid medium er introdusert i både AP- og BL-kamrene i den gjennomtrengelige støtten. Absorpsjonen (AP→BL) og sekresjonen (BL→AP) av legemiddelkandidaten er illustrert, samt to mulige former for narkotikatransport. Forkortelser: AP = apikal; BL = basolateral. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Arbeidsflyt for hundeorganoidpermeable støtteprotokoller. Den permeable støtteinnsatsen er forbelagt med en blanding av den ekstracellulære membranmatrisen og kollagen I og inkuberes i 1 time. Under inkubasjonsprosessen dissosieres organoidkulturen. Individuelle organoidceller blir sådd i innsatsen, medium i basolateralt kammer tilsettes umiddelbart etter såing, mens medium til apikalt kammer tilsettes 24 timer etter at såprosessen er avsluttet. Vedlikehold og overvåking av organoider inkluderer regelmessige mediumendringer, TEER-verdimålinger og lysmikroskopi for å evaluere monolagets integritet. Før forsøket må organoidene differensieres ved å fjerne ROCK-hemmer og GSKiβ fra mediet. TEER-verdiene måles på forsøksdagen, og det organoide monolaget inspiseres via lysmikroskopi for skade på cellene. Medium byttes deretter ut med en passende buffer og inkuberes før eksperimentet. FITC-dextran-analysen brukes under intestinal permeabilitetseksperimenter39 som en markør for monolagsintegritet. TEER-målinger tas etter forsøket, og lysmikroskopi vil validere resultatene etter 24 timer. Forkortelser: TEER = transepitelial elektrisk motstand; ROCK = rho-assosiert kinase; GSKiβ = glykogensyntasekinase beta; F = fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Protocol
Forskningen ble godkjent og utført i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee of Iowa State University (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017). Følgende avsnitt (trinn 1.1-1.3) beskriver protokollen for såing av permeable støtte, og prosedyrene er oppsummert i figur 3.
Figur 3: Arbeidsflyt for den gjennomtrengelige støttesåingsprotokollen. De permeable støtteinnsatsene er forbelagt med en kombinasjon av CMGF + R / G, kollagen I og den ekstracellulære membranmatrisen og deretter inkubert. Media fra hundens organoidkultur aspireres og erstattes med en cellegjenopprettingsløsning, etterfulgt av en 30 minutters inkubasjon ved 4 ° C. Kulturen overføres deretter til et rør, og organoid dissosiasjon utføres ved bruk av trypsinlignende protease. Udissosierte organoider fjernes ved passasje gjennom en sil for å oppnå en enkeltcellesuspensjon, og cellekonsentrasjon bestemmes ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisert celleteller. Cellene sås på en permeabel støtteinnsats, og CMGF+ R/G tilsettes basolateralt kammer. Kulturen inkuberes deretter i 24 timer, og den gjenværende væsken fjernes fra apikalkammeret og erstattes med CMGF + R / G. Forkortelser: ROCK = rho-assosiert kinase; GSKiβ = glykogensyntasekinase beta; CMGF + R/ G = Komplett medium med vekstfaktorer forbedret med ROCK-hemmer og GSKiβ. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Gjennomtrengelig støtte seeding protokoll
- Forfylling av de permeable støtteinnsatsene
- Klargjør Komplett medium med vekstfaktorer forbedret med Rho-assosiert proteinkinasehemmer (ROCK) og glykogensyntasekinase-betahemmer (GSKiβ) (CMGF + R/G) i henhold til informasjonen i tabell 1.
- Forbered en isbøtte og begynn å tine den ekstracellulære membranmatrisen på is. Plasser en 24-brønns plate som inneholder det nødvendige antall innsatser i inkubatoren til forvarm. Samle kollagen fra rottehalen I (3 mg/ml) og legg det på is mens du beskytter mot lys. Samle CMGF + R / G og legg den på is.
- Beregn totalt antall innlegg og emner som kreves for eksperimentet, og hold til side 100 μL av beleggløsningen for hver innsats.
MERK: Forbered mer beleggløsning enn nødvendig; det anbefales å forberede minst 15% mer enn nødvendig. - I et rør på 15 ml blandes CMGF+ R/G med den ekstracellulære membranmatrisen (1 %) og kollagen I (1 %) og blandes forsiktig.
- Belegg hver polyesterinnsats med 100 μL av beleggløsningen og plasser innsatsene i inkubatoren (37 °C; 5 % CO2 atmosfære) i 1 time.
- Etter inkubasjonen aspirerer du forsiktig beleggoppløsningen av hver innsats ved hjelp av en vakuumaspirator eller en P1000 pipette, og vær forsiktig så du ikke forstyrrer innsatsfilteret. Plasser en forkjølt plate i inkubatoren for å holde varmen.
- Canine organoid dissosiasjon
MERK: Bruk hundeorganoider som har blitt dyrket i minst fire dager. Før du begynner dissosiasjon, se Gabriel et al.38 for å bestemme når en prøve er sunn, tett og tilstrekkelig for eksperimentering. Det anbefales å dissosiere en ekstra brønn med organoider for hver brønnbeleggprosedyre. Videre anbefales det å øke ønsket antall innlegg med ~ 20% for å ta hensyn til ujevn organoidvekst eller skade forårsaket av feil manipulasjon. Hvis du planlegger å bruke FITC-dextran, må du forberede ekstra brønner.- Klargjør en isbøtte og et hetteglass med kaldt 1x Advanced DMEM/F12 lager i biosikkerhetsskapet.
- Plasser den ekstracellulære membranmatrisen på is for å begynne å tine, senk den i is for å beskytte mot rask tining og unngå størkning. Plasser en eske med pipettespisser (P200) i fryseren for plettering av den ekstracellulære membranmatrisen.
- Prechill en nedkjølt sentrifuge til 4 °C.
- Flytt CMGF+ R/G fra fryseren/kjøleskapet til et vannbad på 37 °C. Unngå direkte lyseksponering når det er mulig.
- Fjern alt medium fra 24-brønns plate med organoidkultur for et passende antall brønner (1 brønn av en 24-brønns plate per 2-4 innsatser) mens du passer på å ikke forstyrre den ekstracellulære membranmatrisen.
MERK: Volumet kan variere avhengig av celletellingssystemet som brukes. - Tilsett 0,5 ml prekjølt cellegjenvinningsløsning per brønn for å løse opp de ekstracellulære membranmatrisekuplene.
- Inkuber platen i kjøleskapet (4 °C) i 30 minutter.
- Pipetter suspensjonen, samle alle organoider og oppløst ekstracellulær membranmatrise, og overfør dem til et 15 ml rør.
- Sentrifuge (700 × g i 5 min ved 4 °C) og fjern supernatanten til nivået når 0,5 ml merket, pass på at du ikke forstyrrer pelleten.
- Tilsett 1 ml trypsinlignende protease og rug i vannbadet på 37 °C i 8 minutter. Flick røret flere ganger i inkubasjonsperioden for å blande cellene.
- Overfør røret med prøven tilbake til et biosikkerhetsskap og tilsett sakte 7 ml prekjølt avansert DMEM/F12 for å inaktivere den trypsinlignende proteasen og stoppe celledissosiasjonen.
- Prewet en 40 μm celle sil med 1 ml avansert DMEM / F12. Rør blandingen forsiktig og filtrer suspensjonen gjennom; pipette ekstra Avansert DMEM/F12 for å skylle silen.
- Sentrifuger tuben (700 × g i 5 min ved 4 °C) og fjern supernatanten. Ikke forstyrr pelleten.
- Resuspender cellepelleten i ~50-100 μL kulturmedium (CMGF+ R/G) for hver brønn av organoider som ble disassosiert.
- Tell en subsample av suspensjonen (~ 10 μL) ved hjelp av et hemocytometer eller passende maskin og bestem det totale celletallet i suspensjonen.
- Canine organoid såing
- Fortynn eller konsentrer cellesuspensjonen for å oppnå en cellekonsentrasjon på ~75 000 celler per ml.
- Frø 100 μL av suspensjonen i hver innsats ved hjelp av BSA (1%) forhåndsbelagte spisser for å unngå celleadhesjon under overføring. Legg til en belagt innsats som et cellefritt tomt uten at noen organoider vokser mens du fortsatt mottar regelmessige medieendringer.
- Virvle platen forsiktig i en sirkulær bevegelse i ~ 30 s for å spre de sådde cellene over innsatsen. Bekreft via lysmikroskopi jevn fordeling av celler.
- Tilsett 700 μL CMGF + R / G til basolateralkammeret og plasser platen i inkubatoren (37 ° C; 5% CO2 atmosfære) i 24 timer.
- Etter 24 timer, fjern forsiktig cellesuspensjonen fra apikalkammeret og erstatt den med 200 μL CMGF + R / G. Sett platen tilbake til inkubatoren.
2. Organoidcelle monolag vedlikeholdsprotokoll
MERK: Følgende avsnitt (trinn 2.1-2.2) beskriver vedlikeholdsprotokollen for organoidcellemonolag. Arbeidsflyten av prosedyrer presentert i denne protokollen er oppsummert i figur 4. En tabell for notattaking som kan hjelpe til med standardisering av TEER-verdimålinger er presentert i tilleggstabell 1.
Figur 4: Arbeidsflyt for vedlikehold av den gjennomtrengelige støttekulturen. TEER-verdier måles med elektroder (prober) og en volt/ohm-måler. Prober må steriliseres kjemisk med 70% alkohol før de settes inn i brønnene. De tomme og organoidcelleinnsatsene måles, og TEER-verdier beregnes. Medium oppdateres deretter i både apikale og basolaterale kamre, og hundens organoidkultur på innsatsen visualiseres ved hjelp av lysmikroskopi. Rifter i enten organoidkultur eller mikroporøs membran noteres og håndteres i henhold til protokollen. Forkortelse: TEER = transepitelial elektrisk motstand. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Måling av TEER-verdi
MERK: MÅLING AV TEER-verdi utføres ved hjelp av en epitelial volt/ ohm-måler med spisepinnefeste. Se produsentens bruksanvisning. TEER-verdier gir informasjon om integriteten til hundens organoid monolag.- Ta TEER-verdimålinger på hver alternativ dag under cellekulturvekst.
- Flytt Epithelial Volt / Ohm Meter og dens elektroder til biosafety skapet. Steriliser elektrodene kjemisk i 70% alkohol før bruk. Sett funksjonen til Ohm. Vent minst ett minutt til elektrodene tørker.
- Før du tar den første målingen, sett trådelektroden inn i porten og slå på strømmen. Sørg for at måleren viser 1000 Ω med trådelektrodeinnsatsen i stedet for å måle spisepinner. Hvis dette ikke er tilfelle, juster enheten.
- Sett elektrodene inn i det apikale og basolaterale kammeret til den cellefrie innsatsen (blank), slik at det apikale kammeret inneholder den kortere elektroden, og det basolaterale kammeret inneholder den lengre elektroden (som vist i figur 4). Ikke berør membranen, men sørg samtidig for at elektrodene er nedsenket i mediet.
- Vent noen sekunder til verdien stabiliserer seg, og noter verdien i en laboratoriebok. Mål de resterende hundens organoide monolag, og sørg for å sterilisere elektrodene med 70% alkohol når du måler forskjellige prøver. Pass på at du ikke berører det organoide monolaget med elektroden.
- Etter at målinger er tatt, steriliser elektrodene med 70% alkohol for siste gang. Sørg for å beskytte dem mot skader forårsaket av upassende manipulasjon og oppbevar dem i henhold til produsentens instruksjoner.
- Beregn TEER-verdiene for hver brønn ved hjelp av Eq (1), derR-prøve ogR-blank er ohm-verdiene (Ω) fra henholdsvis monolag og blanke brønner, og arealet (cm²) er innsatsens.
(1)
- Vedlikehold av monolag
MERK: Gå gjennom anbefalt plan for middels endring i tabell 2.- Ved hjelp av sterile engangs 9 "Pasteur pipets og en vakuum aspirator, forsiktig aspirere mediet fra apikale og deretter basolaterale kamre. Vipp platen for å se mediets overflate tydelig. Unngå å aspirere for nær den mikroporøse membranen i apikalkammeret for å forhindre skade på cellemonolaget.
MERK: Bruk en ny Pasteur pipet når du flytter mellom prøver. Pipetter er også en mulig erstatning for denne prosedyren. - Tilsett CMGF+ R/G langsomt ved hjelp av P1000-pipetter som sikter mot en vegg i det apikale eller basolaterale kammeret. Utfør mediumendringen i apikalkammeret svært nøye for å unngå å skade monolaget.
- Kontroller brønnene annenhver dag under et lysmikroskop, vurder kulturens helse og se etter tårer i det organoide monolaget eller den mikroporøse membranen. Bruk fasekontrastmikroskopi for å markere detaljer om kulturen.
MERK: Når det gjelder hundens organoid monolag tårer, får monolaget tid til å gjenopprette og regrow. Ved mikroporøse membrantårer må brønnen utelukkes fra forsøket.
- Ved hjelp av sterile engangs 9 "Pasteur pipets og en vakuum aspirator, forsiktig aspirere mediet fra apikale og deretter basolaterale kamre. Vipp platen for å se mediets overflate tydelig. Unngå å aspirere for nær den mikroporøse membranen i apikalkammeret for å forhindre skade på cellemonolaget.
(1)Tabell 2: Anbefaling om medieendring for organoidkulturer. CMGF+ R/G skiftes i brønnenes apikale og basolaterale kammer annenhver dag annenhver dag. Den lengre kulturperioden i helgen krever et økt volum av medium i både basolaterale og apikale kamre, som påføres på en fredag ettermiddag og endres på mandag. Forkortelser: ROCK = rho-assosiert kinase; GSKiβ = glykogensyntasekinase beta; CMGF + R/ G = Komplett medium med vekstfaktorer forbedret med ROCK-hemmer og GSKiβ. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
3. Permeabilitet eksperimentell protokoll
MERK: Følgende avsnitt (trinn 3.1-3.5) beskriver permeabilitetseksperimentell protokoll. Arbeidsflyten for eksperimentell protokoll for å måle et legemiddels in vitro permeabilitet er oppsummert i figur 5.
Figur 5: Arbeidsflyt for eksperimentell protokoll. Organoidmedium må endres fra CMGF + R / G til CMGF + mellom åtte til tolv dager etter sådning av innsatsene, noe som muliggjør cellulær differensiering. Etter å ha endret mediet (både apikalt og basolateralt) til CMGF +, bør TEER-verdiene fortsatt øke, med hundens organoide monolag nesten når sammenløp. Minst fire dager etter at mediet er endret til CMGF+, evalueres monolagenes beredskap. Når monolaget er fullstendig dannet, og TEER-verdiene når en platåfase (vanligvis mellom 1,500 og 2,500 Ω.cm2), byttes mediet mot transportbufferen i 30 minutter for å la monolaget tilpasse seg det nye miljøet. På tidspunktet 0 min av forsøket utføres FITC-dextran-analysen, og den 20 min basolaterale prøven samles inn. Resultatene analyseres deretter på en plateleser. Etter forsøket endres innholdet i det apikale og basolaterale kammeret igjen til CMGF+, og TEER-verdiavlesninger tas. Monolagene inkuberes i 24 timer, og monolagets integritet vurderes gjennom gjentatte TEER-målinger. Forkortelser: TEER = transepitelial elektrisk motstand; ROCK = rho-assosiert kinase; GSKiβ = glykogensyntasekinase beta; CMGF + R / G = Komplett medium med vekstfaktorer forbedret med ROCK-hemmer og GSKiβ; CMGF+ = Komplett medium med vekstfaktorer, men uten ROCK-hemmer eller GSKiβ; FITC = fluoresceinisotiocyanat; F = fluorescens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Evaluering av organoid monolagsberedskap
MERK: Dette trinnet skjer 8-14 dager etter seeding.- Kontroller monolaget minst annenhver dag under lysmikroskopet (bruk fasekontrast for å visualisere monolagets integritet). Fortsett til neste trinn når cellemonolaget er fullt dannet uten hull eller tilsynelatende tegn på tårer.
- Endre organoidmediet fra CMGF + R / G til CMGF + (unntatt ROCK-hemmer og GSKiβ fra mediumsammensetningen). Det anbefales å bytte medium minst fire dager før eksperimentet.
MERK: Dette trinnet vil tillate riktig differensiering av organoid monolayer. - Fortsett å måle TEER-verdier omtrent annenhver dag. Når TEER-verdiene begynner å flate ut på omtrent 1 500 til 2 000 Ω × cm² (figur 6), måler du TEER-verdiene hver dag.
MERK: Denne stabile tilstanden kan opprettholdes i omtrent 2-3 dager, som er det optimale tidsvinduet for å utføre permeabilitetstesting (vanligvis på dag 11 til 13). Platåets TEER-verdier kan svinge litt basert på tarmlokaliseringen av organoider, måletemperatur, rase, alder og sykdomstilstand hos hunden. - Planlegg legemiddelpermeabilitetsanalysen umiddelbart for å unngå en rask reduksjon i TEER-verdier eller overvekst av organoidmonolaget til flere cellelag.
- Forbereder seg på eksperimentet
MERK: Inkubator shakers kan brukes under forsøket for å unngå effekten av det uberørte vannlaget. Mål TEER-verdier ved konsistente temperaturer.- På eksperimentets dag måler du TEER-verdier og bekrefter at verdiene nådde en stabil tilstand og ikke faller raskt.
- Velg de beste monolagene (via lysmikroskopi og TEER-verdier) fra over 20% innsatser for å utføre eksperimentet.
- Vær oppmerksom på monolagene under et lysmikroskop og ekskluder ufullstendige, revet eller overgrodde organoidmonolag.
- Forbered transportbufferen og juster pH-verdien til ønskede verdier.
MERK: Sammensetningen av den eksperimentelle bufferen er forskjellig basert på det eksperimentelle oppsettet. En ofte brukt buffer består av Hanks balanserte saltløsning (HBSS), glukose (12,5 mM) og 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineetansulfonsyre (HEPES, 25 mM). Denne sammensetningen sikrer levedyktigheten til organoidkultur under et eksperiment. - Aspirer forsiktig mediet fra de apikale og basolaterale kamrene til de valgte brønnene.
- Tilsett 200 μL transportbuffer til apikalkammeret og 800 μL til basolateralt kammer.
MERK: Transportbuffer bør først legges til apikalkammeret og deretter til basolateralt kammer for å unngå løsrivelse av monolaget fra den mikroporøse membranen. - Plasser platen i inkubatoren (37 ° C; 5% CO2 atmosfære) i 30 minutter for å likevekte.
MERK: Hundens organoid monolag er nå klare for legemiddelpermeabilitetseksperimentet.
- Typisk eksperimentell layout-IgY konsentrasjonsløsning
MERK: Det eksperimentelle designet og oppsettet kan endres avhengig av forskningsspørsmålet. Permeabiliteten til immunoglobulin Y (IgY) gjennom et organoid monolag brukes i protokollen som et eksempel og kan modifiseres. Begrepet donorkammer refererer til kammeret der stoffet opprinnelig brukes, mens mottakskammeret refererer til kammeret som aksepterer stoffet fra donorkammeret. Et typisk eksperiment samler prøver i mottakerkamrene over 2 timer (f.eks. 15, 30, 60, 90, 120 min).- Forbered IgY-løsningen (medikament eller oppløsning etter eget valg) ved å oppløse den i transportbufferen til ønsket sluttkonsentrasjon. Forbered mer stoffløsning enn nødvendig.
MERK: Legemidler med lav vandig oppløselighet kan først oppløses i et organisk løsningsmiddel (f.eks. Etanol, DMSO) før de tilsettes bufferen. Den endelige konsentrasjonen av løsningsmidlet skal være mindre enn 1% for ikke å skade cellemonolaget. - Fjern bufferen fra donorkammeret (enten apikalt eller basolateralt kammer) i hver brønn.
- Tilsett IgY-løsningen (legemiddelløsning) til alle donorkamrene. Bruk den gjenværende oppløsningen som tid 0 donorløsning for måling av den opprinnelige legemiddelkonsentrasjonen.
- Ved de nødvendige tidspunktene, fjern 50 μL fra mottakskammeret og legg det i et merket rør. På det siste tidspunktet, fjern en prøve fra donorkammeret. På slutten av forsøket overfører du donor og mottaker aliquots til en -20 ° C fryser.
MERK: Hvis det er behov for mange tidspunkter, kan utskifting av buffer i mottakskammeret gjøres, men må tas med i beregningen av den tilsynelatende permeabiliteten. Konsentrasjonen i mottakerkammeret bør ikke nå mer enn 10% av donorkammeret ved slutten av forsøket for å opprettholde synkeforholdene44.
- Forbered IgY-løsningen (medikament eller oppløsning etter eget valg) ved å oppløse den i transportbufferen til ønsket sluttkonsentrasjon. Forbered mer stoffløsning enn nødvendig.
- Organoid celle monolag kvalitetskontroll
MERK: FITC-dextran-løsningen kan brukes til å bekrefte monolagsintegritet under eksperimentet. FITC-dextran brukes som et eksempel på en monolagsintegritetsanalyse. Andre inkluderer Lucifer gul, PEG-4000, radiomerket mannitol og inulin44.- På tid 0 min, aspirer innholdet i apikalkammeret og erstatt med 250 μL FITC-dextran-oppløsning (5 mg / ml, 4 kDa) i tre eksemplarer for hver eksperimentell gruppe.
MERK: IKKE utsett FITC-dextran for lys. - Etter 20 minutter fjerner du bufferen fra basolateralkammeret.
- Mål fluorescensintensiteten til den basolaterale prøven ved hjelp av en fluorescensplateleser (bruk en kalibreringskurve, eksitasjon satt til 485 nm og utslippsverdi ved 528 nm).
MERK: Papp av FITC kan også beregnes ved hjelp av metoden beskrevet i diskusjonen. - Etter at forsøket er avsluttet, aspirerer forsiktig overflødig buffer fra apikale og basolaterale kamre.
- Tilsett 200 μL CMGF+ i apikalkammeret og 700 μL i basolateralt kammer.
- Måle TEER-verdier i de enkelte brønnene.
- Plasser platen i inkubatoren (37 ° C; 5% CO2 atmosfære) i 24 timer.
- Hvis det er aktuelt, etter 24 timer, må du måle TEER-verdier for å vurdere mulig skade på monolaget under kvalitetskontrolldelen av eksperimentet. Bruk lysmikroskopi for å visualisere integriteten til hundens organoid monolag.
- På tid 0 min, aspirer innholdet i apikalkammeret og erstatt med 250 μL FITC-dextran-oppløsning (5 mg / ml, 4 kDa) i tre eksemplarer for hver eksperimentell gruppe.
- Feste cellemonolag for analyse nedstrøms
- Forbered Formalin-eddiksyre-alkoholoppløsning (FAA, sammensetning i tabell 1).
- Fjern transportbufferen eller CMGF + fra apikale og basolaterale kamre ved hjelp av en P1000 pipet eller steril engangs 9 "Pasteur pipets og en vakuum aspirator.
- Fyll apikale og basale kamre med FAA.
- Etter 24 timer, aspirer FAA og erstatt den med 70% etanol.
- Pakk platen med fleksibel laboratoriefilm for å forhindre fordampning og fortsett å blokkere forberedelse.
Figur 6: TEER-verdier på tvers av eksperimentelle grupper. TEER-verdier ble målt i fem grupper av canine intestinal organoid monolayers. Tre grupper var sammensatt av hunden jejunal enteroider, og to grupper besto av kolonoider. Hver gruppe inkluderte 12 til 22 replikasjoner. TEER-verdiene for jejunale enteroidkulturer er vist fra dag 4 til dag 14, og kolonoidkulturer er vist fra dag 4 til dag 12 (målingene ble avsluttet da organoidmonolaget nådde steady state-verdier, noe som indikerer at monolaget var klart for eksperimentell bruk). Feilfelt uttrykker SEM av målingene. Forkortelse: TEER = transepitelial elektrisk motstand. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Representative Results
Standard operasjonsprosedyrer for kulturen av hundeorganoider ble tidligere beskrevet33, og Canine Organoid Protocol har også blitt diskutert i detalj i dette spesialnummeret38. Canine intestinal organoids dyrket på permeable støtter ble fast og paraffin-innebygd for å undersøke mikroanatomi av monolayer og cellepopulasjoner. Prosessen med innlemming av parafiner ble tidligere diskutert av Gabriel et al.38. Rutinemessig farging (hematoksylin og eosin) er utført, og Alcian Blue-fargeteknikken ble brukt til å påvise begerceller i hundens organoide monolag (se figur 7).
Figur 7: Farging av tarmorganoid monolag hos hunder. Canine intestinal organoider av kolon opprinnelse i permeabel støtte har blitt paraffin-embedded og farget med H &E og AB. Representative bilder ble tatt ved hjelp av lysmikroskopi ved 40x (A) og 60x (B) forstørrelse. H&E-farging avslører et søyleepitelialt monolag, og mikrovilli i den apikale delen av cellene kan observeres ved 60x forstørrelse. AB-farging avslører videre tilstedeværelsen av begerceller (mørk blå) i hundens tarmorganoid monolag. Skala barer = 20 μm (A), 50 μm (B). Forkortelser: H&E = hematoksylin og eosin; AB = Alcian Blå. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Organoidkulturen på den permeable støtten bør dyrkes i 10 til 14 dager for å være klar for et permeabilitetseksperiment. Lysmikroskopi brukes sammen med TEER-verdimålinger for å bekrefte organoidkulturens beredskap for permeabilitetstesting av legemiddelkandidater. Representative lysmikroskopiske bilder av forskjellige tarmorganoidmonotyper fra friske og syke dyr er presentert i figur 8.
Figur 8: Tarmorganoid monolagsmikroskopi hos hunder. Bilder av voksende monolag sett under lysmikroskopi. Organoid monolag avledet fra friske givere er representert av jejunal enteroid (10x; 40x) og colonoid (20x; 40x) kulturer. Organoide monolag av syke donorer er representert av duodenale (5x; 10x) og ileale (5x; 10x) enteroider avledet fra en hundepasient diagnostisert med PLE. Begge PLE organoidkulturer er eksempler på feil celleisolering under såing av organoider, og disse kulturene kunne ikke brukes til legemiddelpermeabilitetsanalyser på grunn av tilstedeværelsen av 3D-organoider. Eksempler på avvik fra riktig monolagsdannelse, som monolagstårer (5x), er forårsaket av uforsiktig manipulering av de biologiske prøvene. Den langvarige kulturen av organoider (10x; 20x) er forårsaket av det lange vedlikeholdet av organoider på innsatsen når organoider begynner å ligne sin opprinnelige 3D-struktur. Til sammenligning presenteres bilder av tradisjonelle 2D-cellelinjer på de permeable støttene som vanligvis brukes til legemiddelpermeabilitetsstudier (MDCK-10x; 40x og Caco-2-10x; 20x). Forkortelser: PLE = proteintapende enteropati; MDCK = Madin-Darby hjørnetann nyre. Skala barer = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Organoid monolag ble også fiksert i 3% Paraformaldehyd-3% Glutaraldehyd i fosfatbufret saltvann (PBS). Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) ble brukt til å karakterisere ultrastrukturen til organoidkulturen på de gjennomtrengelige støttene. Mikroanatomiske strukturer av mikrovilli og tette kryss kan ses i figur 9.
Figur 9 TEM-bilder av friske tarmorganoide monolag hos hunder. TEM ble brukt til å avsløre den cellulære mikroarkitekturen til jejunal (A), ileal (B) og colonic (C) organoid monolag. Den mikroporøse membranen til den permeable støtteinnsatsen er merket med en gul pil. Tilstedeværelsen av microvilli (blå pil) og tette kryss (rød pil) er avgrenset i bildene. Forkortelse: TEM = Transmisjonselektronmikroskopi. Skala barer = 5 μm (A), 2 μm (B, C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Både TEER-målinger og lysmikroskopi bør utføres for å sikre at systemet er klart for permeabilitetstesting. Analysen er klar til bruk når TEER når en stabil tilstand, mens lysmikroskopi vil bidra til å utelukke skade eller overvekst av organoider. Et sammendrag av typiske TEER-målinger av fem grupper bestående av jejunale enteroider og kolonoider er presentert i figur 6.
Tabell 1: Sammensetning av organoidmedier og FAA. Den komplette sammensetningen av CMGF+, CMGF+ R/G og FAA er oppsummert i denne tabellen. Forkortelser: ROCK = rho-assosiert kinase; GSKiβ = glykogensyntasekinase beta; CMGF + R / G = Komplett medium med vekstfaktorer forbedret med ROCK-hemmer og GSKiβ; CMGF+ = Komplett medium med vekstfaktorer, men uten ROCK-hemmer eller GSKiβ; FAA = formalin-eddiksyre-alkohol; EGF =epidermal vekstfaktor. Denne tabellen er tilpasset fra 38. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggstabell 1: Tabell for notatskriving på hundeorganoid det permeable støttesystemet. Forkortelser: TEER = transepitelial elektrisk motstand; ROCK = rho-assosiert kinase; GSKiβ = glykogensyntasekinase beta; CMGF + R / G = Komplett medium med vekstfaktorer forbedret med ROCK-hemmer og GSKiβ; CMGF+ = Komplett medium med vekstfaktorer, men uten ROCK-hemmer eller GSKiβ. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
Canine intestinal organoid kulturer i det gjennomtrengelige støtteapparatet er et unikt konsept som forbinder tradisjonelle legemiddelpermeabilitetsanalyser40 med en ny in vitro hundemodell41. Ulike typer tarmorganoider fra hunder kan brukes og evalueres basert på målet med forsøket med minimale justeringer. Det anbefales å teste flere konsentrasjoner av stoffet av interesse i 3-4 brønner per gruppe. Konsentrasjonene kan være basert på forventet tarmkonsentrasjon av legemidlet. Videre kan bruk av tidligere forskning bidra til å bestemme passende tidspunkter for studiedesignet. Passende dokumentasjon av studiedesign bør gjøres for å øke replikerbarheten og bistå i feilsøking.
Denne teknologien har flere begrensninger på grunn av nyheten av metoden42, hovedsakelig på grunn av mangel på standardisering i eksperimentell design og utførelse av protokollen på tvers av laboratorier. Denne mangelen på standardisering har blitt anerkjent av andre grupper43, og Canine 3D Organoid Monolayer Protocols vil føre til interlaboratorisk reproduserbarhet og introdusere standardisering til dette systemet. Standardiserte tilnærminger til dataanalyse forbedrer replikerbarheten og kan styrke resultatene av foreløpig narkotikatesting ved bruk av hundeorganoider i det gjennomtrengelige støttesystemet på tvers av forskjellige laboratorier. Hundens 3D-organoidmodell mangler også datasett som sammenligner in vitro Papp-verdier av modellmedikamenter med deres kjente humane eller hund in vivo intestinal absorpsjon, omtrent som Caco-2-celler 44,45,46. Når slike data er generert, kan denne hundeorganoidmodellen brukes til å vurdere intestinal permeabilitet under legemiddelutvikling.
Det er avgjørende at det tas hensyn når man sår organoider på det permeable støttesystemet for å frø en høy nok tetthet av passende dissosierte celler. TEER-verdiene til systemet er mer pålitelige og reproduserbare når de dyrkes i strenge monolag. Langvarig kultur av monolagene kan føre til en eksponentiell økning i TEER-verdier som når videre fra tarmens fysiologiske verdier. H&E-seksjoner av slike 3D-strukturer viser deretter flere lag med celler over hverandre med endrede strukturer av enterocytter nærmere membranen.
Etter vellykket utvidelse av hundens intestinale organoid monolag, kan resultatene analyseres på samme måte som tradisjonelle 2D-celleanalyser ved å beregne et legemiddels tilsynelatende permeabilitetskoeffisient (Papp) formel44. P-appverdien (se Eq (2)) beskriver transporthastigheten over mobilmonolaget47.
(2)
Det 
er den første helningen av konsentrasjonen versus tidskurven (f.eks. nmol / s). A er innsatsområdet (cm2), og C0 er den opprinnelige konsentrasjonen av legemidlet eller forbindelsen i donorkammeret37. Pålitelig anerkjennelse av monolagsintegritet er en avgjørende del av permeabilitetsanalysen som krever standardisering. Lysmikroskopi og TEER-målinger anbefales for å vurdere hundeorganoider i et gjennomtrengelig støttesystem og bidra til å bestemme riktig tidspunkt for forsøket. I tillegg kan nullmolekylære permeabilitetsmarkører (f.eks. FITC-dextran, Lucifer gul, PEG-400) brukes til å funksjonelt evaluere organoid monolagsintegritet. Det må tas hensyn til om forbindelsen som testes påvirkes av en transportør. P-glykoprotein (P-gp) brukes som et vanlig eksempel på efflukspumpe. Det må genereres et effluksforhold (Papp,BL-AP/Papp,AP-BL) sammenlignet med et velkjent P-gp sondesubstrat.
Lysmikroskopi (vanlig eller forbedret med fasekontrast) er en uvurderlig metode for å kontrollere integriteten til 2D- eller 3D-monolaget og filterinnsatsen mens du vurderer mulig cellulær gjengroing. Figur 7 kan tjene som en veiledning for å gjenkjenne sunne tarmorganoidcellekulturer hos hunder. TEER-verdier er et viktig mål på dannelsen av intercellulære veikryss og differensiering av organoidkulturene til et intakt tarmepitel. Hundens tarmorganoider skiller seg ut i enterocytter og begerceller (figur 6). Disse slimproduserende cellene tillater studier av legemiddel-slim-interaksjoner, noe som har vært vanskelig å oppnå ved bruk av tradisjonelle 2D-cellekulturer48. Tilstedeværelsen av enteroendokrine celler har tidligere blitt bekreftet i hundens tarmorganoider av Chandra et al.33.
Ytterligere karakterisering av hundens organoid monolag avledet fra jejunal-, ileal- og kolonorganoider ved bruk av TEM er gitt. TEM-bilder viser cellulær mikroarkitektur, inkludert tette kryss og mikrovillidannelse, noe som ytterligere illustrerer kompleksiteten og nytten av disse organoidmodellene i translasjonsmedisin. Basert på de eksperimentelle resultatene var organoidkulturene på den permeable støtten klare for eksperimentering mellom dag 11 og dag 13 etter såing (figur 9). TEER-verdiene på dette tidspunktet varierte mellom 1 500 og 2 500 Ω,cm2. Platåfasen med TEER-verdier varer i et svært begrenset tidsvindu der eksperimentet må startes før TEER-verdiene begynner å avta sakte. TEER-verdier kan også være en avgjørende del av å vise viktige eksperimentelle resultater, da noen stoffer eller hjelpestoffer kan interagere med monolaget (f.eks. Tette kryss), noe som i stor grad kan påvirke TEER-verdiavlesningene. Dette alene kan tjene som data for et eksperiment.
Canine intestinal organoider i et dobbeltkammercellekulturapparat kan brukes på andre felt enn oral legemiddelpermeabilitet på grunn av den unike arkitekturen til det resulterende cellemonolaget. For eksempel kan de brukes i mikrobiologisk forskning (f.eks. Virkningen av å endre GI mikrobiell flora), virale opptaksstudier, legemiddelinteraksjoner og narkotikatransportmekanismer49. Donorkammeret er vanligvis fylt med testmedikamentet eller forbindelsen av valg, og aliquots fra mottakerkammeret tas på forskjellige tidspunkter. Disse aliquotene kan analyseres ved hjelp av høyytelses væskekromatografi, massespektrometri, enzymbundet immunosorbentanalyse eller andre teknikker for å bestemme mengden og hastigheten som løsningsmidlet gjennomsyrer gjennom monolaget.
Disse studiene krever et intakt monolag for å vurdere legemiddelpermeabilitet nøyaktig. Dette krever vanligvis voksende monolag som overstiger de som trengs for å ta hensyn til ubrukelige brønner. Organoidcellemonolag kan også brukes til å måle viralt opptak enten fra apikal eller basal side av et monolag, med avlesninger inkludert immunfluorescensanalyser - ved bruk av antistoffer for å oppdage virusets cellulære opptak. Endelig kan flere legemidler (dvs. substrat og inhibitor) påføres donorkammeret for å identifisere transportørbaserte legemiddelinteraksjoner.
Basert på de nåværende observasjonene, vil disse metodene ikke bare være anvendelige for hundeorganoider i kulturinnsatser, men vil også være egnet for andre veterinære arter og organsystemer, med mindre modifikasjoner som trengs for å passe best til den valgte arten eller organmodellen. Protokoller for vekst av tarmorganoider hos hunder måtte justeres basert på kulturens unike egenskaper. Dermed kan protokollen justeres til en annen art, men vil kreve subtile endringer i protokollen. Modifikasjoner kan begynne med endringer i cellesåingstettheten og utvides til endringer i mediesammensetningen for å skille organoider av interesse på riktig måte.
Standardisering, detaljert dokumentasjon av eksperimentelle prosedyrer og konsekvent overvåking av cellemonolagene er avgjørende praksis som trengs på tvers av de gjennomtrengelige støtteanalysene og er ikke begrenset til hundesystemet. Disse mulige artene eller organmodifikasjonene er avgjørende for å dokumentere og rapportere for videre fremskritt på feltet. Denne modellen har flere begrensninger, for eksempel kostnadskrav, interlaboratorisk variabilitet og begrensede data om evnen til å forutsi intestinal absorpsjon in vivo. Hunder har i noen tilfeller forskjellige stofftransportører og metaboliserende enzymer enn mennesker50.
Videre må hundens organoidsystem testes på en rekke andre dobbeltkammerapparater fra andre produsenter for å bestemme egnetheten til en slik modell (f.eks. Egnetheten til forskjellige filtermembransammensetninger må bestemmes). En annen ulempe er at legemiddelpermeabilitetseksperimentets del av manuskriptet er mindre beskrivende enn de foregående delene. Dette skyldes et overskudd av informasjon på dette feltet. Målet for denne delen av manuskriptet var å beskrive disse metodene på en modifiserbar måte uten å kutte kantene på hjørnesteinene i disse eksperimentene. Mer detaljert informasjon om permeabilitetseksperimenter er samlet inn av Hubatsch et al.37. I tillegg kan permeable innsatser brukes i kokultur, cellemigrasjon og invasjonsanalyseeksperimenter4.
Avslutningsvis har hundens tarmorganoider i tokammerkulturapparater potensial til å bli brukt i et bredt spekter av applikasjoner, inkludert biomedisinske felt og translasjonsmedisin, for å nevne noen. Protokollene skaper flere strategier for å planlegge et eksperiment og fremme interlaboratorisk dataavhengighet for organoidmodeller på tvers av biologifeltet.
Disclosures
K. Allenspach er en av grunnleggerne av LifEngine Animal Health og 3D Health Solutions. Hun fungerer som konsulent for Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics og Mars. JP Mochel er medstifter av LifEngine Animal Health og 3D Health Solutions og fungerer som konsulent for Ceva Animal Health og Ethos Animal Health. Denne artikkelen gjenspeiler synspunktene til forfatterne og bør ikke tolkes til å representere Food and Drug Administrations godkjenning, syn eller politikk. Andre forfattere har ingen interessekonflikt å oppgi.
Acknowledgments
Vi ønsker å uttrykke takknemlighet til Veterinær Diagnostic Laboratory of Iowa State University ansatte, nemlig Haley Lambert, Emily Rahe, Rosalyn Branaman, Victoria Green, og Jennifer Groeltz-Thrush, for rettidig behandling av prøver. Vi vil også takke Jodi Smith og Bethann Valentine for å gi materiale til permeabilitetseksperimentene. Vi vil også takke David Diaz-Reganon for hans hjelp med figur 9. Med unntak av figur 6 er alle figurer laget i BioRender.com. Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra fakultetet Oppstart, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award, og NSF SBIR subaward til ISU # 1912948.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organoid media | |||
| ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| FBS | Corning | 35-010-CV | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute |
| HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
| Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
| TMS (trimethoprim sulfate) | Sigma | T7883-5G | |
| Reagents | |||
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
| alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous | Acros Organics | 170080010 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
| FITC-CM-Dextran | Millipore Sigma | 68059-1G | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14025-076 | |
| Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
| PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
| Materials and Equipment | |||
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430766 | |
| 9" Pasteur Pipets | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile | Corning | 3470 | Permeable Support |
| Millicell ERS (Probes) | Millipore Sigma | MERSSTX01 | |
| Millicell ERS-2 Voltohmmeter | Millipore Sigma | MERS00002 | |
| Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
| Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Flexible Laboratory Film |
| Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |
References
- Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments JoVE. (80), e50638 (2013).
- Youhanna, S., Lauschke, V. M. The Past, present and future of intestinal in vitro cell systems for drug absorption studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (1), 50-65 (2021).
- Belic, S., et al. Comparative analysis of inflammatory cytokine release and alveolar epithelial barrier invasion in a transwell®bilayer model of mucormycosis. Frontiers in Microbiology. 3204, 3204 (2019).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51046 (2014).
- Rönkkö, S., Vellonen, K. S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Dahlgren, D., Lennernäs, H. Intestinal permeability and drug absorption: predictive experimental, computational and in vivo approaches. Pharmaceutics. 11 (8), 411 (2019).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
- Natoli, M., Leoni, B. D., D’Agnano, I., Zucco, F., Felsani, A. Good Caco-2 cell culture practices. Toxicology in Vitro. 26 (8), 1243-1246 (2012).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Chandler, M., et al. Obesity and associated comorbidities in people and companion animals: a One Health perspective. Journal of Comparative Pathology. 156 (4), 296-309 (2017).
- Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. Microbiome. 6 (1), 72 (2018).
- Galeta, P., Lázničková-Galetová, M., Sablin, M., Germonpré, M. Morphological evidence for early dog domestication in the European Pleistocene: New evidence from a randomization approach to group differences. Anatomical Record. 304 (1), 42-62 (2021).
- Kleinert, M., et al. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nature Reviews Endocrinology. 14 (3), 140-162 (2018).
- Allenspach, K., Wieland, B., Gröne, A., Gaschen, F. Chronic enteropathies in dogs: Evaluation of risk factors for negative outcome. Journal of Veterinary Internal Medicine. 21 (4), 700-708 (2007).
- Wang, J., et al. Proliferative and invasive colorectal tumors in pet dogs provide unique insights into human colorectal cancer. Cancers. 10 (9), 330 (2018).
- Gillespie, V., Baer, K., Farrelly, J., Craft, D., Luong, R. Canine gastrointestinal stromal tumors: Immunohistochemical expression of CD34 and examination of prognostic indicators including proliferation markers Ki67 and AgNOR. Veterinary Pathology. 48 (1), 283-291 (2011).
- Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).
- Schneider, B., et al. Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: the One Health initiative. CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).
- Artursson, P., Palm, K., Luthman, K. Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 22 (1-2), 67-84 (1996).
- Balimane, P. V., Han, Y. H., Chong, S. Current industrial practices of assessing permeability and P-glycoprotein interaction. AAPS Journal. 8 (1), 1-13 (2006).
- Sambuy, Y., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Calcagno, A. M., Ludwig, J. A., Fostel, J. M., Gottesman, M. M., Ambudkar, S. V. Comparison of drug transporter levels in normal colon, colon cancer, and caco-2 cells: Impact on drug disposition and discovery. Molecular Pharmaceutics. 3 (1), 87-93 (2006).
- Hilgendorf, C., et al. Expression of thirty-six drug transporter genes in human intestine, liver, kidney, and organotypic cell lines. Drug Metabolism and Disposition. 35 (8), 1333 (2007).
- Seithel, A., Karlsson, J., Hilgendorf, C., Björquist, A., Ungell, A. L. Variability in mRNA expression of ABC- and SLC-transporters in human intestinal cells: Comparison between human segments and Caco-2 cells. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (4), 291-299 (2006).
- Volpe, D. A. Transporter assays as useful in vitro tools in drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 11 (1), 91-103 (2016).
- Hoffmann, P., et al. Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells as a model for studying physiological properties and toxin-induced effects on intestinal cells. PLoS ONE. 16 (10), 257824 (2021).
- Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
- Thummel, K. E., et al. Transcriptional control of intestinal cytochrome P-4503A by 1α,25-dihydroxy vitamin D3. Molecular Pharmacology. 60 (6), 1399-1406 (2001).
- Kodama, N., et al. Characteristic analysis of intestinal transport in enterocyte-like cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. Drug Metabolism and Disposition. 44 (10), 1662-1667 (2016).
- Akazawa, T., et al. Application of intestinal epithelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells for studies of prodrug hydrolysis and drug absorption in the small intestine. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 46 (11), 1497-1506 (2018).
- Lo, B., Parham, L. Ethical issues in stem cell research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
- Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).
- Zdyrski, C., et al. Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation. Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).
- Nantasanti, S., et al. Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids. Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
- Gabriel, V., et al. Standardization and maintenance of 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (179), e63515 (2022).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
- van Breemen, R. B., Li, Y. Caco-2 cell permeability assays to measure drug absorption. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 1 (2), 175-185 (2005).
- Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-Arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Olivatti, T. O. F., Alcantara, G. P., Lemos, A. C. C. E., Silva, M. G., Miot, H. A. Standardization of organoid culture for evaluation of melanogenesis induced by UVB, UVA and visible light. Anais Brasileiros de Dermatologia. 95 (1), 46-51 (2020).
- Volpe, D. A., et al. Classification of drug permeability with a Caco-2 cell monolayer assay. Clinical Research and Regulatory Affairs. 24 (1), 39-47 (2007).
- Chen, C., Ma, M. G., Fullenwider, C. L., Chen, W. G., Sadeque, A. J. M. Biopharmaceutics permeability classification of lorcaserin, a selective 5-hydroxytryptamine 2C agonist: Method suitability and permeability class membership. Molecular Pharmaceutics. 10 (12), 4739-4745 (2013).
- Jarc, T., et al. Demonstrating suitability of the Caco-2 cell model for BCS-based biowaiver according to the recent FDA and ICH harmonised guidelines. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 71 (8), 1231-1242 (2019).
- Newby, D., Freitas, A. A., Ghafourian, T. Decision trees to characterise the roles of permeability and solubility on the prediction of oral absorption. European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 751-765 (2015).
- Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS ONE. 8 (7), 68761 (2013).
- Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
- Martinez, M. N., Mochel, J. P., Neuhoff, S., Pade, D. Comparison of canine and human physiological factors: understanding interspecies differences that impact drug pharmacokinetics. The AAPS Journal. 23 (3), 59 (2021).
