توفر هذه الدراسة إجراء محسنا بشكل منهجي للبناء القائم على الريبونوكلياز CRISPR / Cas9 لمتحولات الجراد متماثل الزيجوت بالإضافة إلى طريقة مفصلة للحفظ بالتبريد وإنعاش بيض الجراد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
بناء طفرات متماثلة الزيجوت من الجراد المهاجر باستخدام تقنية كريسبر / كاس 9
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الجراد المهاجر ، Locusta migratoria ، ليس فقط أحد جراد الطاعون في جميع أنحاء العالم الذي تسبب في خسائر اقتصادية هائلة للبشر ولكنه أيضا نموذج بحثي مهم لتحول الحشرات. يمكن لنظام CRISPR / Cas9 تحديد موقع دقيق في موضع معين من الحمض النووي والالتصاق داخل الموقع المستهدف ، مما يؤدي بكفاءة إلى إدخال فواصل مزدوجة الخيوط للحث على خروج الضربة القاضية للجين المستهدف أو دمج شظايا جينية جديدة في موضع معين. يعد تحرير الجينوم بوساطة كريسبر / كاس 9 أداة قوية لمعالجة الأسئلة التي تتم مواجهتها في أبحاث الجراد بالإضافة إلى تقنية واعدة لمكافحة الجراد. توفر هذه الدراسة بروتوكولا منهجيا للضربة القاضية الجينية بوساطة كريسبر / كاس 9 مع مركب بروتين Cas9 والحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNAs) في الجراد المهاجر. يتم وصف اختيار المواقع المستهدفة وتصميم sgRNA بالتفصيل ، يليه التوليف في المختبر والتحقق من sgRNAs. تشمل الإجراءات اللاحقة جمع طوف البيض وفصل البيض المدبوغ لتحقيق الحقن المجهري الناجح مع معدل وفيات منخفض ، وزراعة البيض ، والتقدير الأولي لمعدل الطفرة ، وتكاثر الجراد ، وكذلك اكتشاف وحفظ ومرور الطفرات لضمان استقرار أعداد الجراد المحرر. يمكن استخدام هذه الطريقة كمرجع لتطبيقات تحرير الجينات القائمة على كريسبر / كاس 9 في الجراد المهاجر وكذلك في الحشرات الأخرى.
المقدمة
يمكن استخدام تقنيات تحرير الجينات لإدخال عمليات الإدراج أو الحذف في موضع جينوم معين لتعديل الجين المستهدف بشكل مصطنع عن الغرض1. في السنوات الماضية ، تطورت تقنية CRISPR / Cas9 بسرعة ولديها نطاق متزايد من التطبيقات في مختلف مجالات علوم الحياة2،3،4،5،6. تم اكتشاف نظام CRISPR / Cas9 في عام 19877 ، ويوجد على نطاق واسع في البكتيريا والعتائق. أشارت الأبحاث الإضافية إلى أنه كان نظاما مناعيا تكيفيا بدائيات النواة يعتمد على النيوكلياز الموجه بالحمض النووي الريبي Cas9 لم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. اختيار الموقع المستهدف وتصميم sgRNA
- اجمع أكبر قدر ممكن من معلومات التسلسل للجين محل الاهتمام من خلال البحث في الأدبيات و / أو البحث عن mRNA أو ترميز تسلسل الحمض النووي (CDS) للجين في قاعدة بيانات NCBI والجراد24.
- قارن تتابع الجين المعني بتتابع الحمض النووي الجينومي الخاص به لتمييز منطقتي إكسون وإنترون.
- حدد منطقة مرشحة لتصميم الموقع المستهدف بناء على الغرض من البحث. صمم أزواجا أولية لتضخيم جزء المنطقة المرشحة والتحقق من تسلسلها من النوع البري عن طريق تحليل تسلسل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل.
ملاحظة: هناك استراتيجيات مختلفة لاختيار المنطقة المستهدفة المرشحة. على سبيل المثال ، في معظم أبحاث وظ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يحتوي هذا البروتوكول على الخطوات التفصيلية لتوليد طفرات متماثلة الزيجوت من الجراد المهاجر مع RNP الذي يتكون من بروتين Cas9 و sgRNA المركب في المختبر . فيما يلي بعض النتائج التمثيلية للضربة القاضية الجينية المستهدفة بوساطة كريسبر / كاس9 في الجراد ، بما في ذلك اختيار الهدف ، وتوليف sgRNA والتحقق منه (الشكل 1 أ) ، وجمع البيض وحقنه ، وفحص الطفرات وتمريرها ، والحفظ بالتبريد ، وإنعاش البيض متماثل الزيجوت.
في هذه الدراسة ، تم اختيار الموقع المستهدف لنظام CRISPR .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كان الجراد من بين أكثر الآفات تدميرا للزراعة منذ حضارةالبشر 23. تعد تقنية تحرير الجينوم القائمة على كريسبر / كاس 9 أداة قوية لتوفير معرفة أفضل بالآليات البيولوجية في الجراد بالإضافة إلى استراتيجية واعدة لمكافحة الآفات. وبالتالي ، من المفيد جدا تطوير طريقة فعالة وسهلة الاستخدام للبناء بوساطة كريسبر / كاس 9 لمتحولات الجراد متماثل الزيجوت. على الرغم من الإبلاغ عن بعض الأعمال الرائعة وقدمت بعض سير العمل الأساسي لتحرير الجينوم في الجراد18،20،21.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32070502 ، 31601697 ، 32072419 ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (2020M672205).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10 وأقات. NEBuffer r3.1 | New England Biolabs | B7030S | المخزن المؤقت ل ؛ in vitro< / em> فحوصات الانقسام Cas9 |
| 2xEs Taq MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0690 | لتضخيم الجينات |
| 2xPfu MasterMix (صبغة) | Cwbio | CW0686 | لتضخيم الجينات |
| موقع CHOPCHOP | Online لتصميم sgRNAs ، http://chopchop.cbu.uib.no/. | ||
| كريسبور | اون لاين لتصميم sgRNAs ، http://crispor.org. | ||
| CRISPR Direct | Online لتصميم sgRNAs ، http://crispr.dbcls.jp/. | ||
| مزود طاقة الرحلان | الكهربائي LIUYI BIOLOGY | DYY-6D | فصل جزيئات الحمض النووي بأحجام |
| مختلفة أنبوب Eppendorf | Eppendorf | 30125177 | لجمع العينات ، إلخ. |
| فرش دقيقة | Annigoni | 1235 | لتنظيف وعزل البيض. تم شراؤها عبر الإنترنت. |
| مجتذب الماصات الدقيقة المشتعلة / البني | أداة Sutter | P97 | لصنع إبر الحقن |
| الدقيق طقم استخراج الجل | Cwbio | CW2302 | استعادة الحمض النووي وتنقية |
| نظام تحليل التصوير الجل | OLYMPUS | Gel Doc XR | راقب نتائج الرحلان الكهربائي |
| GeneTouch Plus | Bioer | B-48DA | لتضخيم |
| الجينات الزجاج القطب الشعري | Gairdner | GD-102 | لصنع إبر الحقن مع أ حاضنة مجتذب الماصة |
| الدقيقة MEMMERT | INplus55 | لزراعة أجنة الجراد المهاجر | |
| حمام معدني | TIANGEN | AJ-800 | لتسخين العينة |
| الحاقن الذاتي الصغير | Eppendorf | 5253000068 | الحقن المجهري للأجنة في وقت مبكر من التطور |
| طرد مركزي دقيق | Allsheng | MTV-1 | يستخدم لخلط الكواشف |
| المطحنة الدقيقة | NARISHIGE | EG-401 | لتأريض طرف إبرة الحقن |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | لتحميل المحاليل في إبر الحقن. |
| نظام التلاعب الدقيق | Eppendorf | TransferMan 4r | نظام معالجة تناغي للحقن المجهري |
| مجهر cnoptec | SZ780 | للحقن | |
| الدقيق مناور محرك الأقراص | NARISHIGE | MM-94 | للتحكم في موضع الماصة الدقيقة أثناء الحقن |
| ، مطحنة الأنسجة متعددة العينات | jingxin | Tissuelyser-64 | طحن وتجانس وعاء البيض |
| ChangShengYuanYi | CS-11 | مملوء بالرمل المعقم الرطب لوضع الجراد في بيض فيه. يتم جمع البويضات من هذه الحاوية. تم شراؤها عبر الإنترنت. | |
| بارافيلم | بارافيلم | PM996 | لتغليف أطباق بتري. |
| طقم الاستنساخ pEASY-T3 | TransGen Biotech | CT301-01 | لاستنساخ TA |
| طبق بتري | NEST | 752001 | لاستزراع البيض والحفاظ عليه. |
| Pipettor | Eppendorf | Research plus | لتحميل العينات |
| استزراع بلاستيكي | لتربية الجراد بشكل منفصل وأي كوب بلاستيكي كبير بما يكفي (لا يقل حجمه عن 1000 مل) سيفي بالغرض. | ||
| طقم توليف gRNA الدقيق | Thermo | A29377 | لتخليق sgRNA |
| Primer Premier | PREMIER Biosoft | Primer Premier 5.00 | لتصميم التمهيدي |
| SnapGene | Insightful Science | SnapGene & reg ؛ 4.2.4 | لتحليل تسلسلات |
| كرات الصلب | HuaXinGangQiu | HXGQ60 | لطحن العينة. تم شراؤها عبر الإنترنت. |
| نصائح | bioleaf | D781349 | لتحميل العينات |
| DNA Marker II | TransGen Biotech | BM411-01 | تستخدم لتحديد حجم الجين |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo | A36496 | Cas9 protein |
| UniversalGen DNA Kit | Cwbio | CWY004 | لاستخراج الحمض النووي الجيني |
| VANNAS مقص | علوم المجهر الإلكتروني | 72932-01 | لقطع الهوائيات |
| القمح | لتوليد شتلات القمح كغذاء للجراد. تم شراؤها من المزارعين المحليين. | ||
| ZiFiT | Online لتصميم sgRNAs ، http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx. |
المراجع
- Doudna, J. A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).
- van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechn....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
