Summary
Denne undersøgelse giver en systematisk optimeret procedure for CRISPR / Cas9 ribonuklease-baseret konstruktion af homozygote johannesbrødmutanter samt en detaljeret metode til kryopræservering og genoplivning af johannesbrødæggene.
Abstract
Den vandrende græshoppe, Locusta migratoria, er ikke kun en af de verdensomspændende pestgræshopper, der forårsagede enorme økonomiske tab for mennesker, men også en vigtig forskningsmodel for insektmetamorfose. CRISPR/Cas9-systemet kan nøjagtigt lokalisere på et specifikt DNA-sted og spalte inden for målstedet, hvilket effektivt introducerer dobbeltstrengsbrud for at inducere målgenknockout eller integrere nye genfragmenter i det specifikke locus. CRISPR/Cas9-medieret genomredigering er et kraftfuldt værktøj til at løse spørgsmål i græshoppeforskning samt en lovende teknologi til græshoppekontrol. Denne undersøgelse giver en systematisk protokol for CRISPR / Cas9-medieret genknockout med komplekset af Cas9-protein og enkeltguide-RNA'er (sgRNA'er) i migrerende græshopper. Udvælgelsen af målsteder og design af sgRNA beskrives detaljeret, efterfulgt af in vitro-syntese og verifikation af sgRNA'erne. Efterfølgende procedurer omfatter indsamling af ægflåder og garvet ægseparation for at opnå vellykket mikroinjektion med lav dødelighed, ægkultur, foreløbig estimering af mutationshastigheden, johannesbrødavl samt påvisning, konservering og passage af mutanterne for at sikre populationsstabilitet af de redigerede græshopper. Denne metode kan bruges som reference for CRISPR/Cas9-baserede genredigeringsapplikationer i migrerende græshopper såvel som i andre insekter.
Introduction
Genredigeringsteknologier kan bruges til at indføre indsættelser eller deletioner i et specifikt genom-locus for kunstigt at ændre målgenet med formål1. I de seneste år har CRISPR/Cas9-teknologien udviklet sig hurtigt og har et voksende anvendelsesområde inden for forskellige områder af biovidenskab 2,3,4,5,6. CRISPR/Cas9-systemet blev opdaget tilbage i 19877 og findes i vid udstrækning i bakterier og arkæer. Yderligere forskning viste, at det var et prokaryot adaptivt immunsystem, der afhænger af den RNA-guidede nuklease Cas9 for at bekæmpe fager8. Det kunstigt modificerede CRISPR/Cas9-system består hovedsageligt af to komponenter, et enkelt guide-RNA (sgRNA) og Cas9-proteinet. SegRNA'et består af et CRISPR RNA (crRNA), der er komplementært til målsekvensen, og et hjælpetransaktiverende crRNA (tracrRNA), som er relativt konserveret. Når CRISPR/Cas9-systemet aktiveres, danner sgRNA'et et ribonukleoprotein (RNP) med Cas9-proteinet og guider Cas9 til dets målsted via baseparringen af RNA-DNA-interaktioner. Derefter kan det dobbeltstrengede DNA spaltes af Cas9-proteinet, og som et resultat opstår dobbeltstrengsbruddet (DSB) nær protospacerens tilstødende motiv (PAM) på målstedet 9,10,11,12. For at afbøde skaden forårsaget af DSB'erne ville celler aktivere omfattende DNA-skaderesponser for effektivt at opdage de genomiske skader og indlede reparationsproceduren. Der er to forskellige reparationsmekanismer i cellen: ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ) og homologirettet reparation (HDR). NHEJ er den mest almindelige reparationsvej, der hurtigt kan reparere DNA-dobbeltstrengsbrud og forhindrer celleapoptose. Det er dog fejlbehæftet på grund af at efterlade små fragmenter af indsættelser og deletioner (indels) nær DSB'erne, hvilket normalt resulterer i et åbent læserammeskift og dermed kan føre til gen-knock-out. I modsætning hertil er homolog reparation en ganske sjælden begivenhed. Under forudsætning af, at der er en reparationsskabelon med sekvenser, der er homologe med DSB's kontekst, vil celler lejlighedsvis reparere det genomiske brud i henhold til den nærliggende skabelon. Resultatet af HDR er, at DSB er præcist repareret. Især hvis der er en yderligere sekvens mellem de homologe sekvenser i skabelonen, ville de blive integreret i genomet gennem HDR, og på denne måde kunne de specifikke genindsættelser realiseres13.
Med optimering og udvikling af sgRNA-strukturer og Cas9-proteinvarianter er det CRISPR/Cas9-baserede genetiske redigeringssystem også blevet anvendt med succes i forskning af insekter, herunder men ikke begrænset til Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella og Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. Så vidt forfatterne ved, selvom RNP'er bestående af Cas9-proteinet og in vitro transkriberet sgRNA er blevet brugt til græshoppegenomredigering20,21,22, mangler der stadig en systematisk og detaljeret protokol for CRISPR / Cas9 ribonukleasemedieret konstruktion af homozygote mutanter af den migrerende johannesbrød.
Vandrende johannesbrød er et vigtigt skadedyr i landbruget, der har en global fordeling og udgør betydelige trusler mod fødevareproduktionen, idet den er særlig skadelig for graminøse planter, såsom hvede, majs, ris og hirse23. Genfunktionsanalyse baseret på genomredigeringsteknologier kan give nye mål og nye strategier til bekæmpelse af vandrende græshopper. Denne undersøgelse foreslår en detaljeret metode til at slå migrerende johannesbrødgener ud via CRISPR/Cas9-systemet, herunder udvælgelse af målsteder og design af sgRNA'er, in vitro-syntese og verifikation af sgRNA'erne, mikroinjektion og dyrkning af æg, estimering af mutationshastighed på fosterstadiet, påvisning af mutanter samt passage og bevarelse af mutanterne. Denne protokol kan bruges som en basal reference til manipulation af langt de fleste johannesbrødgener og kan give værdifulde referencer til genomredigering af andre insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Valg af målsted og sgRNA-design
- Indsaml så meget sekvensinformation som muligt for genet af interesse gennem litteraturforskning og / eller søgning efter genets mRNA eller kodende DNA-sekvens (CDS) på NCBI og johannesbrøddatabase24.
- Sammenlign sekvensen af det interesserede gen med dets genomiske DNA-sekvens for at skelne exon- og intronregionerne.
- Vælg en kandidatregion til målstedsdesign baseret på forskningsformålet. Design primerpar for at forstærke kandidatregionsfragmentet og verificere dets vildtypesekvens ved sekventeringsanalyse af PCR-produktet.
BEMÆRK: Der er forskellige strategier for udvælgelse af kandidatmålregionen. For eksempel skal du i de fleste gen/proteinfunktions-forskningsområder bruge exonfragmentet tæt på dets startkodon som kandidatregion for at sikre, at hele protein/RNA-funktionen går tabt efter genomredigeringen (dvs. gen-knock-out). Mens du til funktionsanalysen af et bestemt domæne skal vælge kandidatregionen i begyndelsen (eller begge ender) af domænet. - Brug onlineressourcer som E-CRISP Design25 til at søge efter potentielle målsteder i kandidatmålregionen.
- Vælg "Drosophila melanogaster BDGP6" (eller ethvert andet insekt) i rullelisten med referencegenomer, og vælg "Input er FASTA-sekvens" efterfulgt af at indsætte sekvensen af målområdet i tekstboksen (i FASTA-format).
- Start applikationen ved at trykke på "Start sgRNA-søgning" med "medium" og "enkelt design" for at få de mulige målsteder. Vælg 1-3 potentielle mål fra resultaterne baseret på deres forudsagte score, og design de tilsvarende sgRNA'er i overensstemmelse hermed.
BEMÆRK: Der er mange flere online platforme til CRISPR-design, såsom CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT og så videre (se materialetabel). Nogle af dem har funktionen specificitetskontrol for de arter, hvis genomsekvensdata findes i deres databaser. Imidlertid er den genomiske sekvens af græshopper ikke fundet på noget online websted. Det er bedre at bruge mere end et onlineværktøj til CRISPR-designet i græshopper. Overvej grundigt resultaterne fra forskellige websteder og vælg sgRNA'et fra resultaterne på princippet om højeste specificitet, højeste effektivitet og mindste uoverensstemmelsesrate (figur 1A, B).
2. Syntese og verifikation af sgRNA in vitro
- Syntetiser sgRNA'et ved hjælp af sgRNA-syntesesæt i henhold til producentens manual (materialetabel). Denne procedure omfatter normalt tre trin: DNA-skabelonamplifikation, in vitro-transkription og sgRNA-oprensning21. Det syntetiserede sgRNA fortyndes med nukleasefrit vand til en opbevaringskoncentration på 300 ng/μL til videre anvendelse.
- Målgenfragmentet forstærkes og renses, så det kan fungere som substrat for in vitro-spaltningsanalysen i CRISPR/Cas9-systemet. Udfør disse trin ved at følge producentens anvisninger.
- Det købte Cas9-protein fortyndes til 300 ng/μL med nukleasefrit vand. Der inkuberes 1 μL sgRNA (300 ng/μL) og 1 μL Cas9-protein (300 ng/μL) med 200 ng renset målfragment i spaltningsbufferen ved 37 °C i 1 time (10 μL totalvolumen; se tabel 1). Anslå effektiviteten af sgRNA-induceret Cas9-spaltning ved agarosegelelektroforese (figur 1C). Vælg sgRNA'erne med høj aktivitet til følgende mikroinjektion.
BEMÆRK: Resultaterne af agarosegelelektroforese kan konverteres til gråtonebilleder med billedbehandlingssoftware, og spaltningseffektiviteten estimeres i henhold til gråtonerne af båndene med spekulerede størrelser.
3. Mikroinjektion og dyrkning af æggene
- Forbered injektionsnålene ved at trække glaskapillærer med en mikropipettetrækker (materialetabel). Indstil parametrene som følger: Varme til 588, Træk til 90, Hastighed til 60 og Tid til 40. Slib spidsen af injektionsnålen med en mikrokværn (materialetabel).
BEMÆRK: Ideelle nålespidser er åbne og skarpkantede (figur 2A). Det anbefales stærkt at forberede yderligere nåle til eksperimenterne, fordi nåle undertiden blokeres eller ved et uheld brydes under injektioner. - Bland 1 μL Cas9-protein (300 ng/μL) med 1 μL af det verificerede sgRNA (300 ng/μL) sammen for at opnå RNP'erne til injektion. Der tilsættes 8 μL RNasefrit sterilt vand for at bringe det endelige volumen af blandingen op på 10 μL. Bland opløsningen grundigt og opbevar den på is.
BEMÆRK: De endelige koncentrationer af Cas9-proteinet og sgRNA'erne kan optimeres i henhold til redigeringsresultaterne. Undgå gentagen frysning og optøning af den tilberedte RNP-opløsning, og øjeblikkelig brug anbefales. - Bag de mandlige og kvindelige voksne græshopper sammen ved 30 ° C med en 16 (lys):8 (mørk) fotoperiode og giv dem tilstrækkelige friske hvedeplanter som mad. Overhold disse græshopper dagligt og læg en ovipositionspotte (en plastik blomsterpotte eller kop fyldt med vådt sterilt sand) i opdrætsburet til oviposition, når græshopperne parrede sig.
BEMÆRK: Normalt er 100 par voksne græshopper opdrættet i et opdrætsbur (40 cm x 40 cm x 40 cm) nok til at generere æg til at slå et enkelt gen ud. Kultur yderligere johannesbrødpar, hvis der er behov for flere æg. - Saml de frisklagte æggebælge fra æggryden og vent i ca. 30 minutter på æggarvning. Isoler forsigtigt æggene fra æggebælgene i vand med en fin børste og vask dem med sterilt vand tre gange. Opbevar æggene i en petriskål og tilsæt sterilt vand for at holde dem fugtige.
BEMÆRK: Garvning af de nylagte æg kan forbedre mutanteffektiviteten betydeligt21. - Fyld en injektionsnål med den tilberedte RNP-opløsning og læg den på mikromanipulatoren (materialetabel).
- Indstil mikroinjektionsparametrene som følger: 300 hPa af injektionstrykket (pi), 0,5 s af injektionstiden (ti) og 25 hPa af kompensationstrykket (pc).
- Tryk på pedalen for at vurdere lydstyrken af den injicerede opløsning. Juster injektionstrykket og injektionstiden for at sikre, at injektionsvolumenet er ca. 50-100 nL.
BEMÆRK: Udsug den resterende luft i nålen for at gøre injektionsopløsningen kontinuerlig og kontrollerbar så meget som muligt. Forbindelsen mellem nålen og mikromanipulatoren skal være tæt.
- De sterile æg anbringes regelmæssigt på injektionspuden (figur 2B, C), og puden anbringes på mikroskopets genstandsbord (figur 3A). Juster mikroskopets forstørrelse, indtil æggene observeres. Juster mikroinjektionsnålen under mikroskopet, indtil injektionsspidsen kan ses, og placer den nær det æg, der skal injiceres.
- Start injektionen i en passende højde og en vinkel på 30-45 grader. Stik forsigtigt spidsen ind i ægget nær æggets mikropyler (figur 3B), og tryk på pedalen for at udføre injektionen. Træk kanylen hurtigt tilbage og flyt injektionspuden til injektion af det næste æg.
BEMÆRK: Der skal observeres en let udvidelse af ægget under mikroinjektionen. En lille mængde cytoplasmatisk lækage ved pinhole er acceptabel. Udskift kanylen med en ny, eller juster injektionsvinklen, hvis væskeudstrømningen er for meget. - De injicerede æg overføres til en kulturskål (en petriskål med et stykke fugtigt filterpapir), og de anbringes i en inkubator ved 30 °C.
BEMÆRK: Det vil tage ca. 13-14 dage, før nymfer klækkes fra disse injicerede æg (forudsat at mutation af målgenet ikke påvirker embryonernes udvikling) (figur 3C). Injicer mindst 100 æg for at sikre en tilstrækkelig ruge- og eclosionsmængde til at slå et bestemt gen ud.
4. Estimering af mutationshastighed og screening af mutanter
- Kontroller udviklingen af de injicerede æg hver dag efter injektionen. Overfør injicerede æg til en ny kulturskål hver 24. time i de første 5 dage.
- På den 6. dag (eller senere) efter injektion plukkes og overføres 10 æg tilfældigt til et rør og males tilstrækkeligt med to stålkugler ved 60 Hz i 6 minutter ved hjælp af en kværn (se materialetabel). Resuspender affaldet med 1 ml PBS. 5 μL af blandingen overføres til 45 μL 50 mM NaOH og lyseres ved 95 °C i 5 minutter. Der tilsættes 5 μL 1 M Tris-HCl (pH = 8,0) i lysissystemet for at afslutte den alkaliske lysereaktion.
BEMÆRK: Æg kan udvælges til alkalisk lyse på en hvilken som helst dag efter den sidste overførsel, og flere æg kan bruges som en prøve afhængigt af deres udviklingssituation (f.eks. Fem 6 dage gamle embryoner kan bruges som en prøve, og to 10 dage gamle embryoner kan bruges som en prøve). Nogle gange er det ikke muligt at få det genomiske DNA fra æg ved hjælp af alkalisk lysemetode. Kommercielle genomiske DNA-ekstraktionssæt kan bruges som en alternativ metode til isolering af genomisk DNA fra æggene. - Tag 1 μL af lysisproduktet som PCR-skabelon for at amplificere målgenfragmentet (tabel 2 og tabel 3) og send PCR-produkterne til sekventering. Sammenlign sekventeringsresultaterne med vildtypesekvensen for foreløbigt at vurdere, om CRISPR/Cas9-systemet spaltede målgenet in vivo (figur 4A). Tillad resten af æggene til efterfølgende udvikling på betingelse af, at indels detekteres på fosterstadiet.
BEMÆRK: På denne måde kan mutationshastigheden foreløbigt estimeres på embryostadiet. Hvis der ikke findes nogen indels på dette trin, skal du forberede nogle nye sgRNA'er til målgenet og gentage knock-out-protokollen fra trin 2.1. - De udklækkede nymfer overføres til et opdrætsbur, og kulturér dem som beskrevet i trin 3.3. Når nymferne udviklede sig til det femte stjernestadium, adskilles de med plastikkulturkopper (1 nymfe/kop).
BEMÆRK: Det tager normalt omkring 25-35 dage for nymferne at udvikle sig til deres femte stjerne, og den mest oplagte fænotype er, at vingeknopperne strækker sig til det fjerde eller femte abdominale segment. Desuden anbefales det at registrere fænotyperne af døde nymfer for at forudsige forholdet mellem målgenet og fænotyper i yderligere forskning. - Antennernes længde afskæres med dissekeringssaks, og lysér den ved hjælp af alkalisk lysemetode (trin 4.2). Analyser målgenfragmentsekvensen for disse nymfer som beskrevet ovenfor (trin 4.3) for at identificere G 0-mutanterne (figur 4B).
BEMÆRK: Antennerne, der skæres til lysis, kan være lidt længere, og slibning eller hakning af antennerne er nyttigt til lysis, selvom antennerne kan fordøjes direkte. Individer med flere toppe nær målstedet i sekventeringsresultatet identificeres som positive mutanter og tillades efterfølgende udvikling og parring.
5. Etablering og passage af mutantlinjer
- Udfør krydsning ved hjælp af G 0-mutanter og vildtypegræshopper (figur 4B). Oocysterne opsamles og inkuberes separat ved 30 °C. Brug 3-6 udviklede æg i hver oocyst til at detektere mutationer som beskrevet i trin 4.2 og 4.3. Hold mutation-positive oocyster til den efterfølgende udvikling og opgive de mutation-negative oocyster.
BEMÆRK: Estimering af mutationshastighed på fosterstadiet kan i høj grad fremskynde screeningen af G1-mutanter. Normalt kan 3-6 udviklede æg blandes som en prøve til PCR-medieret genotypning som beskrevet ovenfor. - Bageste G 1-nymfer som beskrevet i trin 4.4. Antennerne afskæres ca. 2 mm for at udføre PCR-baseret genotypebestemmelse som beskrevet i trin 4.5 til påvisning af G 1-heterozygoter. Udfør TA-kloning i henhold til producentens anvisninger (se materialetabellen) for at identificere deres mutationer. Udfør in-cross ved hjælp af G1 heterozygoter med de samme mutationer for at opnå G2 nymfer.
BEMÆRK: Sanger-sekventering af PCR-produkterne kan kun give information til at finde ud af heterozygoterne, men ikke nok information til at identificere de nøjagtige mutationer. TA-kloning ved hjælp af PCR-produkterne er således nødvendig for klart at identificere mutationerne og kan fremme etableringen af stabile mutantlinjer. - Bageste G2 nymfer indtil deres femte instar. Brug den PCR-baserede genotypebestemmelse beskrevet i trin 5.2 til at identificere de homozygoter og/eller heterozygoter, der er egnede til yderligere forskning og stabil passaging (figur 4B).
BEMÆRK: Vær opmærksom på at undgå blanding af homozygoter og heterozygoter. Det anbefales at udføre PCR-baseret genotypebestemmelse i hver generation for at bekræfte homozygositeten og/eller heterozygositeten hos hver population. Antallet af græshopper, der anvendes til denne kontrol, afhænger af befolkningens størrelse. Desuden kan græshoppepopulationen udvides ved hjælp af in-cross-strategien.
6. Kryopræservering og genoplivning af æg
- De æg, der skal kryopræserveres, vaskes med sterilt vand og inkuberes i en dyrkningsskål som beskrevet ovenfor (trin 3.8) i 5-6 dage. Saml disse æg sammen i kulturskålen og dæk dem med filterpapirfragmenter. Pak hele kulturskålen ind med en paraffinfilm.
- Opbevar retten ved 25 °C i 2 dage efterfulgt af yderligere 2 dage ved en relativt lavere temperatur (13-16 °C). Overfør derefter fadet til et køleskab på 6 °C. Tilsæt vand i det hver 2. uge for at give æggene et fugtigt miljø (figur 5A).
BEMÆRK: Embryonerne spekuleres i at være på katatrepsisstadiet efter at være udviklet i 5-6 dage ved 30 °C26. Gradientkøling er nyttig til kryopræservering af æg (tabel 5). - For at genoplive de kryopræserverede æg tages petriskålen ud af køleskabet og opbevares ved 25 °C i 2 dage. Disse æg anbringes i en inkubator på 30 °C, indtil nymferne klækkes (figur 5B).
BEMÆRK: Det er nødvendigt at sætte de kryopræserverede æg ved 25 °C, før de overføres til en 30 °C inkubator. Fostrene kan kryopræserveres i mindst fem måneder, selv om udklækningshastigheden og lukkehastigheden kan falde på grund af kryopræserveringen (tabel 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol indeholder de detaljerede trin til generering af homozygote mutanter af de migrerende græshopper med RNP bestående af Cas9-protein og in vitro syntetiseret sgRNA. Følgende er nogle repræsentative resultater af CRISPR / Cas9-medieret målgenudskæring i græshopper, herunder måludvælgelse, sgRNA-syntese og verifikation (figur 1A), ægopsamling og injektion, mutant screening og passaging, kryopræservering og genoplivning af de homozygote æg.
I denne undersøgelse vælges målstedet for CRISPR / Cas9-systemet i henhold til resultaterne af tre onlineprogrammer (E-CRISP, CRISPOR og ZiFit) og placeret i den første exon (figur 1B). Ifølge Cas9-spaltningsanalysen in vitro (tabel 1) kunne CRISPR/Cas9 RNP fordøje PCR-fragmentet (indeholdende målstedet) med en spaltningshastighed på ca. 55% (figur 1C). Derefter blev denne RNP mikroinjiceret i 120 befrugtede æg på deres enkeltcellestadium ved hjælp af standard mikroinjektionssystemet (figur 2 og figur 3). Sekventeringsresultaterne for estimering af embryonale stadiers mutationshastighed tydede på effektiv genomredigering på målstedet (figur 4A). Endvidere resulterede denne undersøgelse i en nymfeudklækningsrate på 52,73%, og 66,7% af G0-voksne var mosaikmutanter (tabel 4).
Endvidere blev G0-kimærerne krydset med vildtypegræshopper for at opnå heterozygote G1-individer, og G1-heterozygoterne med de samme mutationer (screenet ved TA-kloning) blev krydset for atgenerere G2-dyrene. PCR-baseret fænotypning blev anvendt til påvisning af mutanter, og de opnåede homozygoter blev krydset for at etablere stabile mutantlinjer (figur 4B).
I mellemtiden blev de overskydende homozygote æg kryopræserveret for at forbedre udnyttelsesgraden af homozygoterne. Selv om udklækningshastigheden for de kryopræserverede æg blev reduceret med forlængelsen af kryopræserveringstiden (tabel 5), var de afhjælpende foranstaltninger, herunder påføring af filterpapirfragmenter til at holde æggene våde og genvinde disse konserverede æg med en gradient af stigende temperatur, begge nyttige for genoplivningen (figur 5 og tabel 5). Endelig blev den homozygote population af mutanter med succes bevaret til efterfølgende forskning.
Figur 1: Design af målet og in vitro-verifikation af sgRNA'et. (A) Flowdiagrammet for måludvælgelse, sgRNA-syntese og bioaktivitetsverifikation in vitro (herunder, men ikke begrænset til, græshopper). B) Skematisk diagram over genstrukturen og målstedet. Exonerne af dette målgen vises som blå domæner, og målstedet blev valgt nedstrøms for startkodonet i exon 1. Målsekvensen er fremhævet med rødt. C) Agarosegelelektroforese resultat af in vitro Cas9-spaltningsanalyse. Et DNA-fragment, der indeholdt målsekvensen (ca. 400 bp i længden) blev amplificeret og brugt som substrat for Cas9-fordøjelsen. De forventede små bånd (ca. 100 bp og 300 bp her; markeret med røde trekanter) antydede, at det syntetiserede sgRNA kunne fremkalde effektiv Cas9-spaltning. Spaltningshastigheden var ca. 55% ifølge gråtoneanalysen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Nåleforberedelse og mikroinjektionspude til johannesbrød . (A) Spidsen af en forberedt kanyle til mikroinjektion af johannesbrød. Skalastang: 1 mm. (B) Billede af en mikroinjektionspude med æg (angivet med en rød trekant) anbragt på den. Vægtstangen repræsenterer 1 cm. (C) Størrelsen på mikroinjektionspuden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Mikroinjektioner af æg. (A) Et repræsentativt mikroinjektionssystem mærket med røde felter, der angiver et mikroskop (midten) og en mikromanipulator (højre) forbundet til en mikroinjektor (venstre). Computeren bruges til datalagring og til at levere hjælpeobservation. B) Injektion af johannesbrød. Injektionsstedet er markeret med en rød trekant. (C) En udklækket nymfe under mikroskopet. Vægtbjælkerne repræsenterer 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Sekventeringsresultaterne for G 0-dyr og mutantlinjernes overførselsstrategi . (A) Den typiske sekventering resulterer i G0-screeningen. Flere toppe nær målstedet (markeret med et rødt rektangel i vildtypesekvensen) indikerede, at det testede æg/johannesbrød blev redigeret med succes af CRISPR/Cas9-systemet (som vist i G 0-1 og G0-2), mens individet uden nogen ændring i sekventeringsresultatet blev betragtet som ikke redigeret og opgivet (f.eks. G0-3). (B) De mutante linjers passaging strategi. G0-dyrene blev først screenet ved PCR-medieret genotypebestemmelse, og dem med flere toppe i deres sekventeringsresultater blev krydset med vildtypegræshopper for at generere G1-dyrene. PCR-medieret genotypebestemmelse og TA-kloning blev anvendt til at identificere G1-heterozygoterne. Derefter blev heterozygoter med de samme mutationer krydset for atgenerere G2-dyrene (homozygoter og heterozygoter) til yderligere forskning og forbipassering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kryopræservering og genoplivning af æg. A) Kryopræserveringsproceduren: Æggene isoleres fra æggebælgene og udruges ved 30 °C i 5-6 dage efter vask med sterilt vand. Saml derefter de udviklede æg sammen i petriskålen og dæk dem med små rester af fugtigt filterpapir. Pak hele petriskålen ind med en paraffinfilm og opbevar den ved 25 °C i 2 dage, efterfulgt af yderligere 2 dage ved en relativt lavere temperatur (f.eks. 13-16 °C). Til sidst afkøles det ved 6 °C. (B) Genoplivningsproceduren: Tag petriskålene med kryopræserverede æg ud af køleskabet og opbevar dem ved 25 °C i 2 dage efter fjernelse af filterpapirresterne. Derefter kan æggene dyrkes til efterfølgende udvikling ved 30 °C, indtil nymferne klækkes. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Reagens | Volumen (μL) |
| Cas9-protein (300 ng/μL) | 1 |
| sgRNA (300 ng/μL) | 1 |
| PCR-produkt (200 ng/μL) | 1 |
| 10×NEBuffer r3.1 | 1 |
| Nukleasefrit vand | 6 |
Tabel 1: In vitro fordøjelsessystem. 200 ng oprenset målfragment (PCR-produkt) blev blandet med CRISPR/Cas9-systemet (300 ng af hver komponent) til test af bioaktiviteten af de syntetiserede sgRNA'er. En kommerciel buffer blev anvendt, og nukleasefrit vand blev tilsat for at udgøre det samlede volumen til 10 μL.
| Reagens | Volumen (μL) |
| 2xEs Taq MasterMix | 12.5 |
| Fremad primer | 0.5 |
| Omvendt primer | 0.5 |
| Skabelon (lysisprodukt) | 1 |
| Nukleasefrit vand | 10.5 |
Tabel 2: PCR-system til amplifikation af målgenfragmenter. For at forstærke det genomiske fragment af målgenet blev der anvendt en kommerciel Taq-blanding, og primere blev tilsat i henhold til producentens anvisninger. 1 μL af lysisproduktet blev anvendt som skabelon, og nukleasefrit vand blev brugt til at gøre det samlede volumen til 25 μL.
| Temperatur (°C) | Tidspunkt | Cykler |
| 95 | 5 minutter | 1 |
| 95 | 30 s | 35 |
| 55 | 30 s | |
| 72 | 40 s | |
| 72 | 10 minutter | 1 |
Tabel 3: PCR-program til målgenamplifikation. PCR-programmet for målgenamplifikation var: 95 °C i 5 minutter; 35 cyklusser på 95 °C i 30 s, 55 °C i 30 s, 72 °C i 40 s 72 °C i 10 min.
| Elementer | Data |
| Antal injicerede æg | 120 |
| Testede embryoner | 10 |
| Antal udklækkede nymfer | 58 |
| Udklækningshastighed | 52.73% |
| Antal af G0 voksen | 12 |
| Antal G 0-mutanter | 8 |
| Mutationseffektivitet hos voksne G0 | 66.67% |
Tabel 4: Oversigt over redigeringseffektivitet. 120 æg blev injiceret for at slå målgenet ud, og 10 æg blev taget til test i embryostadiet. 58 nymfer klækket fra resten embryoner (rugehastigheden var 52, 73%). Endelig udviklede 12 G0 græshopper sig til voksenstadiet, og 8 af dem blev redigeret med succes på målstedet. Mutationsraten hos voksne G0 var 66,67 %.
| Kontrolgruppe | Gruppe 1 | Gruppe 2 | Gruppe 3 | Gruppe 4 | |
| Antal æg | 120 | 120 | 120 | 120 | 120 |
| Temperaturbehandling til opbevaring | 30 °C | 30 °C (5-6 d)→6 °C | 30 °C (5-6 d)→25 °C (2 d)→13-16 °C (2 d)→6 °C | 30 °C (5-6 d)→25 °C (2 d)→13-16 °C (2 d)→6 °C | 30 °C (5-6 d)→25 °C (2 d)→13-16 °C (2 d)→6 °C |
| Opbevaringstid | 14 dage | 14 dage | 1 måned | 3 måneder | 5 måneder |
| Temperaturbehandling til genoplivning | 30 °C | 6°C→30 °C | 6 °C→25 °C (2 d)→30 °C | 6 °C→25 °C (2 d)→30 °C | 6 °C→25 °C (2 d)→30 °C |
| Antal udklækkede græshopper | 108 | 0 | 96 | 86 | 78 |
| Udklækningshastighed | 90.00% | 0 | 80.00% | 71.67% | 65.00% |
| Antal voksne græshopper | 81 | 0 | 60 | 46 | 31 |
| Eclosion sats | 75.00% | 0 | 62.50% | 53.49% | 39.74% |
Tabel 5: Oversigt over kryopræservering og genoplivning af æg. 600 æg blev opdelt i fem grupper til kryopræservering og genoplivningsundersøgelse. Den første gruppe (kontrol) på 120 æg blev altid udruget ved 30 °C og opbevaret i 14 dage. Den anden gruppe (gruppe 1) på 120 æg blev overført til køleskab efter inkubation ved 30 °C i 5-6 dage og opbevaret ved 6 °C i 14 dage. Derefter blev disse æg overført til 30 °C til genoplivning. De andre grupper (gruppe 2, gruppe 3 og gruppe 4, hver gruppe indeholdt 120 æg) oplevede en gradientkøling og genvindingstemperaturbehandling som beskrevet i protokollen (trin 6.1-6.3) med en anden opbevaringstid (1 måned for gruppe 2, 3 måneder for gruppe 3 og 5 måneder for gruppe 4). Endelig blev 108 nymfer udklækket fra kontrolgruppen (med en rugehastighed på 90%), og 81 af dem udviklede sig til voksenstadiet (75% af eclosionshastigheden). Ingen græshopper klækket i den anden gruppe (gruppe 1). Udklækningshastigheden og eclosionshastigheden for de andre grupper var lavere sammenlignet med kontrolgruppen og faldt med opbevaringstiden. 96 nymfer klækket i gruppe 2 og 60 af dem udviklede sig til voksenstadiet. 86 nymfer klækket i gruppe 3 og 46 af dem udviklede sig til voksenstadiet. I gruppe 4 klækkede 78 nymfer, og 31 af dem udviklede sig til voksenstadiet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Græshopper har været blandt de mest ødelæggende skadedyr for landbruget siden civilisationen af mennesker23. CRISPR/Cas9-baseret genomredigeringsteknologi er et stærkt værktøj til at give bedre viden om græshoppernes biologiske mekanismer samt en lovende skadedyrsbekæmpelsesstrategi. Det er således en stor fordel at udvikle en effektiv og brugervenlig metode til CRISPR/Cas9-medieret konstruktion af homozygote johannesbrødmutanter. Selvom nogle gode værker er blevet rapporteret og givet nogle grundlæggende arbejdsgange til genomredigering i græshopper 18,20,21,22, mangler der stadig en systematisk optimering af hele proceduren. Generelt kan den homozygote johannesbrødmutant, der genereres ved embryonal injektion af CRISPR / Cas9-systemet, opdeles i tre hovedtrin: a) sgRNA-design, syntese og screening in vitro, b) ægindsamling, forberedelse og injektion; og c) mutantscreening og homozygotevedligeholdelse. Denne protokol giver en optimeret arbejdsgang, og trinnene til valg af målsted, in vitro sgRNA-screening, mikroinjektion af æggene samt påvisning af mutanter er især kritiske for effektivt at generere homozygote mutante græshopper med CRISPR / Cas9-systemet.
For det første er målstedet, formen af tilsvarende sgRNA og koncentrationen af sgRNA blevet foreslået som de kritiske faktorer for genomredigeringseffektivitet hos insekter18,27,28. For at løse dette problem anbefales det først at analysere genstrukturen og designe mere end et målsted på exon 1 eller nær startkodonet ved hjælp af onlineressourcerne. Derefter syntetiseres sgRNA in vitro og blandes med Cas9-protein i forskellige koncentrationer for at optimere skæreeffektiviteten af RNP. Denne procedure hjælper med at identificere et sgRNA med høj bioaktivitet og optimere sammensætningen af RNP-komplekset for kandidatmålgenet.
For det andet er indsamling af så mange friske æg som muligt på en begrænset tid og forbedring af rugehastigheden samt mutationshastigheden også store udfordringer for genomredigeringsoperationer. De selskabelige voksne græshopper, der opdrættes i tilstanden 16 (lys):8 (mørk) fotoperiode, bruges til at samle nok æg i en kort periode i løbet af 9:00-11:00. Det er vigtigt at forsigtigt påføre nedadgående tryk mellem æggene ved hjælp af en pensel eller pincet for forsigtigt at isolere æggene fra bælgen. Med tilstrækkelig øvelse kan flere brugere pålideligt adskille individuelle æg fra bælgen. Efter at hvert æg er isoleret og vasket med sterilt vand, justeres æggene på de designede injektionspuder (figur 2B, C) for at stabilisere æggene under mikroinjektion. Ægget injiceres med den optimerede RNP nær mikropylerne. For at begrænse den mekaniske skade og minimere forureningen af æg får friske æg lov til at blive i bælgene i ca. 30 minutter for at sikre, at æggeskallet garvning er ideel til mikroinjektion21 på grund af dets kondenserede struktur og høje forsvarsevne ved invasion efter tilstrækkelig garvning 29,30. I mellemtiden viste en offentliggjort rapport, at syncytialdeling31 af johannesbrødæg forekommer på et tidspunkt mellem 0 timer og 4 timer efter lægning. Med den nuværende standard mikroinjektionsprotokol kan injektion af ca. 100 æg udføres inden for 40 minutter. Samlet set kan proceduren for garvning og mikroinjektion af 100 befrugtede æg afsluttes inden for 2 timer. Der er således mindst 2 timer tilbage til CRISRP/Cas9-medieret spaltning og reparation af målgener for at opnå effektiv mutation i de injicerede æg og fremtidige voksne græshopper.
Endelig er effektive strategier til passaging og mutant identifikation vigtige for at generere homozygoter i de fleste mutante dyr. I græshopper, for gener, der ikke er dødelige efter redigering, er krydsstrategien, der foreslås her, at G 0-mutanter krydser med græshopper af bred type, og yderligere krydsninger kan udføres ved hjælp af G1 heterozygoter med de samme mutationer for at generere homozygote mutanter i den følgende generation. For at verificere mutationen i hver johannesbrød under den mutante arveproces anbefales det at anvende alkalisk lysemetode til at fordøje et kort segment af antenner som skabelon for PCR-baseret genotypning. Endelig skal du bruge de opnåede homozygote voksne til yderligere krydsning for at udvide befolkningen. Begrænset af populationsstørrelse og forskelle i udviklingstrin mellem homozygote græshopper anbefales de overskydende æg til kryopræservering ved 6 °C og genoplivning ved gradienttemperaturstigning (figur 5), som er baseret på princippet om lavtemperaturdiapause og højtemperaturdiapausefrigivelse af migrerende johannesbrødæg32,33.
Kort sagt har CRISPR/Cas9-systemet vist sig at være et pålideligt værktøj til at lette studiet af funktionel genomforskning af migrerende græshopper. Denne detaljerede protokol kan bruges som reference for CRISPR/Cas9-baserede genredigeringsapplikationer i migrerende græshopper såvel som i andre insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (32070502, 31601697, 32072419 og China Postdoctoral Science Foundation (2020M672205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×NEBuffer r3.1 | New England Biolabs | B7030S | The buffer of in vitro Cas9 cleavage assays |
| 2xEs Taq MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0690 | For gene amplification |
| 2xPfu MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0686 | For gene amplification |
| CHOPCHOP | Online website for designing sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/. | ||
| CRISPOR | Online website for designing sgRNAs, http://crispor.org. | ||
| CRISPRdirect | Online website for designing sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/. | ||
| Electrophoresis power supply | LIUYI BIOLOGY | DYY-6D | Separation of nucleic acid molecules of different sizes |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 30125177 | For sample collection, etc. |
| Fine brushes | Annigoni | 1235 | For cleaning and isolating eggs. Purchased online. |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | For making the microinjection needles |
| Gel Extraction Kit | Cwbio | CW2302 | DNA recovery and purification |
| Gel Imaging Analysis System | OLYMPUS | Gel Doc XR | Observe the electrophoresis results |
| GeneTouch Plus | Bioer | B-48DA | For gene amplification |
| Glass electrode capillary | Gairdner | GD-102 | For making injection needles with a micropipette Puller |
| Incubator | MEMMERT | INplus55 | For migratory locust embryo culture |
| Metal bath | TIANGEN | AJ-800 | For heating the sample |
| Micro autoinjector | Eppendorf | 5253000068 | Microinjection of embryos early in development |
| Micro centrifuge | Allsheng | MTV-1 | Used for mixing reagents |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | To ground the tip of injection needle |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | For loading solutions into the injection needles. |
| Micromanipulation system | Eppendorf | TransferMan 4r | An altinative manipulation system for microinjection |
| Microscope | cnoptec | SZ780 | For microinjection |
| Motor-drive Manipulator | NARISHIGE | MM-94 | For controling the position of the micropipette during the microinjection precedure |
| Multi-Sample Tissue Grinder | jingxin | Tissuelyser-64 | Grind and homogenize the eggs |
| ovipisition pot | ChangShengYuanYi | CS-11 | Filled with wet sterile sand for locust ovipositing in it. The oocysts are collected from this container. Purchased online. |
| Parafilm | ParafilmM | PM996 | For wrapping the petri dishes. |
| pEASY-T3 Cloning Kit | TransGen Biotech | CT301-01 | For TA cloning |
| Petri dish | NEST | 752001 | For culture and preservation of the eggs. |
| Pipettor | Eppendorf | Research plus | For sample loading |
| plastic culture cup | For rearing locusts seperately and any plastic cup big enough (not less than 1000 mL in volume) will do. Purchased online. | ||
| Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Primer Premier | PREMIER Biosoft | Primer Premier 5.00 | For primer design |
| SnapGene | Insightful Science | SnapGene®4.2.4 | For analyzing sequences |
| Steel balls | HuaXinGangQiu | HXGQ60 | For sample grinding.Purchased online. |
| Tips | bioleaf | D781349 | For sample loading |
| Trans DNA Marker II | TransGen Biotech | BM411-01 | Used to determine gene size |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo | A36496 | Cas9 protein |
| UniversalGen DNA Kit | Cwbio | CWY004 | For genomic DNA extraction |
| VANNAS Scissors | Electron Microscopy Sciences | 72932-01 | For cutting off the antennae |
| Wheat | To generate wheat seedlings as the food for locusts. Bought from local farmers. | ||
| ZiFiT | Online website for designing sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx. |
References
- Doudna, J. A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).
- van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechnology. 38 (7), 845-855 (2020).
- McCarty, N. S., Graham, A. E., Studena, L., Ledesma-Amaro, R. Multiplexed CRISPR technologies for gene editing and transcriptional regulation. Nature Communications. 11 (1), 1281 (2020).
- Manghwar, H., et al. CRISPR/Cas systems in genome editing: Methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects. Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., Nakata, A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology. 169 (12), 5429-5433 (1987).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa Armigera (Hubner). Journal of Visualized Experiments: JoVE1. (173), e62068 (2021).
- Huang, Y., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of the abdominal-A homeotic gene in the global pest, diamondback moth (Plutella xylostella). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 75, 98-106 (2016).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Xu, X., et al. BmHpo mutation induces smaller body size and late stage larval lethality in the silkworm, Bombyx mori. Insect Science. 25 (6), 1006-1016 (2018).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 60 (2018).
- Zhang, T., et al. Egg tanning improves the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated mutant locust production by enhancing defense ability after microinjection. Journal of Integrative Agriculture. 20 (10), 2716-2726 (2021).
- Guo, X., et al. 4-Vinylanisole is an aggregation pheromone in locusts. Nature. 584 (7822), 584-588 (2020).
- Zhang, L., Lecoq, M., Latchininsky, A., Hunter, D.
- Yang, P., Hou, L., Wang, X., Kang, L. Core transcriptional signatures of phase change in the migratory locust. , Available from: http://www.locustmine.org:8080/locustmine (2019).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. , Available from: http://www.e-crisp.org/E-CRISP/ (2014).
- Pétavy, G. Origin and development of the vitellophags during embryogenesis of the migratory locust, Locusta migratoria L. (Orthoptera : Acrididae). International Journal of Insect Morphology and Embryology. 14 (6), 361-379 (1985).
- Barry, S. K., et al.
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome editing in the cricket, Gryllus bimaculatus. Methods in Molecular Biology. 1630, 219-233 (2017).
- Du, M. H., et al. Suppression of Laccase 2 severely impairs cuticle tanning and pathogen resistance during the pupal metamorphosis of Anopheles sinensis (Diptera: Culicidae). Parasites & Vectors. 10 (1), 171 (2017).
- Eisner, T., Shepherd, J., Happ, G. M. Tanning of grasshopper eggs by an exocrine secretion. Science. 152 (3718), 95-97 (1966).
- Ho, K., Dunin-Borkowski, O. M., Akam, M. Cellularization in locust embryos occurs before blastoderm formation. Development. 124 (14), 2761-2768 (1997).
- Wang, X., et al. Interactive effect of photoperiod and temperature on the induction and termination of embryonic diapause in the migratory locust. Pest Managment Science. 77 (6), 2854-2862 (2021).
- Jarwar, A. R., et al. Comparative transcriptomic analysis reveals molecular profiles of central nervous system in maternal diapause induction of Locusta migratoria. G3-Genes Genomes Genetics. 9 (10), 3287-3296 (2019).
