Summary
מחקר זה מספק הליך מותאם באופן שיטתי של בנייה מבוססת ריבונוקלאז CRISPR/Cas9 של מוטציות ארבה הומוזיגוטיות, כמו גם שיטה מפורטת לשימור בהקפאה והחייאת ביצי ארבה.
Abstract
הארבה הנודדת, Locusta migratoria, היא לא רק אחת מארבות המגפה העולמיים שגרמו הפסדים כלכליים עצומים לבני אדם, אלא גם מודל מחקרי חשוב למטמורפוזה של חרקים. מערכת CRISPR/Cas9 יכולה לאתר במדויק במיקום דנ"א ספציפי ולהיבקע בתוך אתר המטרה, ולהציג ביעילות הפסקות דו-גדיליות כדי לגרום לנוקאאוט של גן המטרה או לשלב מקטעי גנים חדשים בלוקוס הספציפי. עריכת גנום בתיווך CRISPR/Cas9 היא כלי רב עוצמה להתמודדות עם שאלות בחקר הארבה, כמו גם טכנולוגיה מבטיחה להדברת ארבה. מחקר זה מספק פרוטוקול שיטתי לנוקאאוט גנים בתיווך CRISPR/Cas9 עם קומפלקס של חלבון Cas9 ורנ"א מנחה יחיד (sgRNAs) בארבה נודד. בחירת אתרי המטרה והעיצוב של sgRNA מתוארים בפירוט, ולאחר מכן סינתזת מבחנה ואימות של sgRNAs. הליכים מאוחרים יותר כוללים איסוף רפסודות ביצים והפרדת ביצים שזופות כדי להשיג מיקרו-הזרקה מוצלחת עם שיעור תמותה נמוך, תרבית ביצים, הערכה ראשונית של שיעור המוטציות, רבייה של ארבה וכן גילוי, שימור ומעבר של המוטנטים כדי להבטיח את יציבות האוכלוסייה של הארבה הערוך. שיטה זו יכולה לשמש כהפניה ליישומי עריכת גנים מבוססי CRISPR/Cas9 בארבה נודד כמו גם בחרקים אחרים.
Introduction
טכנולוגיות עריכת גנים יכולות לשמש להחדרת החדרות או מחיקות למוקד גנום ספציפי כדי לשנות באופן מלאכותי את גן המטרה למטרה1. בשנים האחרונות, טכנולוגיית CRISPR/Cas9 התפתחה במהירות ויש לה היקף הולך וגדל של יישומים בתחומים שונים של מדעי החיים 2,3,4,5,6. מערכת CRISPR/Cas9 התגלתה עוד בשנת 19877, ונמצאה באופן נרחב בחיידקים ובארכאה. מחקר נוסף הצביע על כך שמדובר במערכת חיסון פרוקריוטית נרכשת התלויה בנוקלאז מונחה RNA Cas9 כדי להילחם בפאגים8. מערכת CRISPR/Cas9 שעברה שינוי מלאכותי מורכבת בעיקר משני מרכיבים, RNA מנחה יחיד (sgRNA) וחלבון Cas9. ה-sgRNA מורכב מ-CRISPR RNA (crRNA) המשלים את רצף המטרה ומ-crRNA טרנסאקטיבי עזר (tracrRNA), שנשמר יחסית. כאשר מערכת CRISPR/Cas9 מופעלת, ה-sgRNA יוצר ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) עם חלבון Cas9 ומנחה את Cas9 לאתר המטרה שלו באמצעות זיווג הבסיס של אינטראקציות RNA-DNA. לאחר מכן, הדנ"א הדו-גדילי יכול להיבקע על ידי חלבון Cas9 וכתוצאה מכך, שבר הגדיל הכפול (DSB) מופיע ליד מוטיב הפרוטוספייסר הסמוך (PAM) של אתר המטרה 9,10,11,12. כדי למתן את הנזק שנגרם על ידי DSBs, תאים יפעילו תגובות מקיפות של נזק לדנ"א כדי לזהות ביעילות את הנזקים הגנומיים וליזום את הליך התיקון. ישנם שני מנגנוני תיקון נפרדים בתא: חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR). NHEJ הוא מסלול התיקון הנפוץ ביותר שיכול לתקן שברים דו-גדיליים של DNA במהירות ומונע אפופטוזיס של תאים. עם זאת, הוא מועד לטעויות בגלל השארת שברים קטנים של החדרות ומחיקות (indels) ליד DSBs, אשר בדרך כלל גורם לשינוי מסגרת קריאה פתוחה ולכן יכול להוביל להסתרת גנים. לעומת זאת, תיקון הומולוגי הוא אירוע נדיר למדי. בתנאי שיש תבנית תיקון עם רצפים הומולוגיים להקשר של DSB, תאים יתקנו מדי פעם את השבר הגנומי בהתאם לתבנית הסמוכה. התוצאה של HDR היא שה- DSB מתוקן במדויק. במיוחד, אם יש רצף נוסף בין הרצפים ההומולוגיים בתבנית, הם ישולבו בגנום באמצעות HDR, וכך ניתן יהיה לממש את החדרות הגנים הספציפיים13.
עם אופטימיזציה ופיתוח של מבני sgRNA וגרסאות חלבון Cas9, מערכת העריכה הגנטית מבוססת CRISPR/Cas9 יושמה בהצלחה גם במחקר של חרקים, כולל אך לא מוגבל Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella, ו Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. למיטב ידיעת המחברים, למרות ש-RNPs המורכבים מחלבון Cas9 ו-sgRNA משועתק במבחנה שימשו לעריכת גנום ארבה20,21,22, פרוטוקול שיטתי ומפורט לבנייה בתיווך ריבונוקלאז CRISPR/Cas9 של מוטציות הומוזיגוטיות של הארבה הנודד עדיין חסר.
הארבה הנודד הוא מזיק חקלאי חשוב בעל תפוצה עולמית ומהווה איום ממשי על ייצור המזון, בהיותו מזיק במיוחד לצמחי גרמין כגון חיטה, תירס, אורז ודוחן23. ניתוח תפקודי גנים המבוסס על טכנולוגיות עריכת גנום יכול לספק מטרות חדשות ואסטרטגיות חדשות להדברת ארבה נודד. מחקר זה מציע שיטה מפורטת להשמדת גנים נודדים של ארבה באמצעות מערכת CRISPR/Cas9, כולל בחירת אתרי מטרה ועיצוב sgRNAs, סינתזת מבחנה ואימות של sgRNAs, מיקרו-הזרקה ותרבית ביציות, הערכת שיעור המוטציות בשלב העוברי, איתור מוטנטים וכן מעבר ושימור של המוטציות. פרוטוקול זה יכול לשמש כנקודת ייחוס בסיסית למניפולציה של הרוב המכריע של גני הארבה ויכול לספק הפניות יקרות ערך לעריכת גנום של חרקים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בחירת אתר יעד ועיצוב sgRNA
- לאסוף כמה שיותר מידע על רצפים עבור הגן המעניין באמצעות מחקר ספרותי ו / או חיפוש mRNA או רצף DNA מקודד (CDS) של הגן ב NCBI ומסד נתונים ארבה24.
- השווה את רצף הגן המעוניין לרצף הדנ"א הגנומי שלו כדי להבחין בין אזורי האקסון והאינטרון.
- בחר אזור מועמד לעיצוב אתר היעד בהתבסס על מטרת המחקר. תכנן זוגות פריימר כדי להגביר את מקטע האזור המועמד ולאמת את הרצף הפרוע שלו על ידי ניתוח רצף של מוצר ה- PCR.
הערה: ישנן אסטרטגיות שונות לבחירת אזור היעד של המועמד. לדוגמה, ברוב מחקרי תפקודי הגנים/חלבונים, השתמשו במקטע האקסון הקרוב לקודון ההתחלה שלו כאזור המועמד כדי להבטיח שכל פונקציית החלבון/רנ"א תאבד לאחר עריכת הגנום (כלומר, נוק-אאוט של גנים). בעוד עבור ניתוח פונקציות של תחום מסוים, בחר את האזור המועמד בתחילת (או שני הקצוות) של הדומיין. - השתמש במשאבים מקוונים כגון E-CRISP Design25 כדי לחפש אתרי יעד פוטנציאליים באזור היעד המועמד.
- בחר "Drosophila melanogaster BDGP6" (או כל חרק אחר) ברשימה הנפתחת של גנומי הייחוס ובחר "קלט הוא רצף FSTA" ולאחר מכן הדבק את רצף אזור היעד בתיבת הטקסט (בפורמט FSTA).
- הפעל את היישום על ידי לחיצה על "התחל חיפוש sgRNA" עם "בינוני" ו "עיצוב יחיד" כדי לקבל את אתרי היעד האפשריים. בחר 1-3 מטרות פוטנציאליות מהתוצאות בהתבסס על הציונים החזויים שלהן ותכנן את ה- sgRNA המתאים בהתאם.
הערה: ישנן פלטפורמות מקוונות רבות נוספות לעיצוב קריספר, כגון CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT וכן הלאה (ראה טבלת חומרים). לחלקם יש את הפונקציה של בדיקת ספציפיות עבור המינים שנתוני הרצף הגנומי שלהם נמצאים במאגרי המידע שלהם. עם זאת, הרצף הגנומי של הארבה לא נמצא בשום אתר אינטרנט. עדיף להשתמש ביותר מכלי מקוון אחד לעיצוב CRISPR בארבה. באופן מקיף, שקול את התוצאות מאתרים שונים ובחר את ה-sgRNA מהתוצאות על-פי העיקרון של הספציפיות הגבוהה ביותר, היעילות הגבוהה ביותר ושיעור אי-ההתאמה הנמוך ביותר (איור 1A,B).
2. סינתזה ואימות של sgRNA במבחנה
- סנתז את ה-sgRNA באמצעות ערכות סינתזת sgRNA בהתאם למדריך היצרן (Table of Materials). הליך זה כולל בדרך כלל שלושה שלבים: הגברת תבנית DNA, שעתוק חוץ גופי וטיהור sgRNA21. דללו את ה-sgRNA המסונתז במים נטולי נוקלאז לריכוז אחסון של 300 ננוגרם/מיקרוליטר לשימוש נוסף.
- הגבירו וטיהרו את מקטע גן המטרה כדי שישמש כמצע לבדיקת המחשוף במבחנה של מערכת CRISPR/Cas9. בצע שלבים אלה בהתאם להוראות היצרן.
- דללו את חלבון Cas9 שנרכש ל-300 ננוגרם/מיקרוליטר עם מים נטולי נוקלאז. דגרו 1 μL של sgRNA (300 ng/μL) ו-1 μL של חלבון Cas9 (300 ng/μL) עם 200 ng של מקטע מטרה מטוהר במאגר המחשוף ב-37°C למשך שעה אחת (10 μL מהנפח הכולל; ראו טבלה 1). העריכו את היעילות של מחשוף Cas9 המושרה על ידי sgRNA על-ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (איור 1C). בחר את sgRNAs עם פעילות גבוהה עבור microinjection הבא.
הערה: ניתן להמיר את התוצאות של אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז לתמונות בגווני אפור באמצעות תוכנת עיבוד תמונה ויעילות המחשוף נאמדת על פי גווני האפור של הפסים בגדלים משוערים.
3. מיקרו-הזרקה ותרבית של הביצים
- מכינים את מחטי ההזרקה על ידי משיכת נימי זכוכית עם מושך מיקרופיפטה (טבלה של חומרים). הגדר את הפרמטרים באופן הבא: חום ל- 588, משוך ל- 90, מהירות ל- 60 וזמן ל- 40. טוחנים את קצה מחט ההזרקה עם מטחנת מיקרו (טבלת חומרים).
הערה: קצות המחטים האידיאליים פתוחים וחדים (איור 2A). מומלץ מאוד להכין מחטים נוספות לניסויים מכיוון שמחטים לעיתים חסומות או נשברות בטעות במהלך הזרקות. - ערבבו 1 μL של חלבון Cas9 (300 ng/μL) עם 1 μL של sgRNA מאומת (300 ng/μL) יחד כדי לקבל את ה-RNPs להזרקה. הוסף 8 μL של מים סטריליים ללא RNase כדי להפוך את הנפח הסופי של התערובת ל 10 μL. מערבבים היטב את התמיסה ושומרים אותה על קרח.
הערה: ניתן למטב את הריכוזים הסופיים של חלבון Cas9 ו- sgRNA בהתאם לתוצאות העריכה. יש להימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית של תמיסת ה-RNP המוכנה, ומומלץ להשתמש בה באופן מיידי. - מגדלים את הארבה הבוגר הזכר והנקבה יחד בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם פוטופריוד של 16 (אור):8 (כהה) ומספקים להם מספיק שתילי חיטה טריים כמזון. התבוננו בארבה זה מדי יום והכניסו לכלוב הגידול עציץ אוביפוזישן (עציץ פלסטיק או מלאה בחול סטרילי רטוב) לכלוב הגידול לאחר שהארבה הזדווג.
הערה: בדרך כלל, 100 זוגות של ארבה בוגר המגודל בכלוב גידול (40 ס"מ x 40 ס"מ x 40 ס"מ) מספיקים כדי לייצר ביצים כדי לדפוק גן יחיד. תרבו זוגות ארבה נוספים אם יש צורך בביצים נוספות. - אספו את תרמילי הביצים הטריות מהסיר והמתינו כ-30 דקות לשיזוף ביצים. בודדו בעדינות את הביצים מתרמילי הביצים במים בעזרת מברשת עדינה ושטפו אותן במים סטריליים שלוש פעמים. שמרו את הביצים בצלוחית פטרי והוסיפו מים סטריליים כדי לשמור עליהן לחות.
הערה: שיזוף הביצים שזה עתה הוטלו יכול לשפר באופן משמעותי את יעילות המוטציה21. - ממלאים מחט הזרקה בתמיסת RNP מוכנה וטוענים אותה למיקרומניפולטור (טבלת חומרים).
- הגדר את פרמטרי המיקרו-הזרקה באופן הבא: 300 hPa של לחץ ההזרקה (pi), 0.5 שניות של זמן ההזרקה (ti) ו- 25 hPa של לחץ הפיצוי (pc).
- לחץ על הדוושה כדי להעריך את עוצמת הקול של התמיסה המוזרקת. התאם את לחץ ההזרקה ואת זמן ההזרקה כדי להבטיח שנפח ההזרקה הוא כ- 50-100 nL.
הערה: יש למצות את שאריות האוויר במחט כדי להפוך את תמיסת ההזרקה לרציפה וניתנת לשליטה ככל האפשר. החיבור של המחט ואת micromanipulator צריך להיות הדוק.
- סדרו את הביציות הסטריליות באופן קבוע על משטח ההזרקה (איור 2B,C) והניחו את הפד על שולחן העצמים במיקרוסקופ (איור 3A). התאימו את ההגדלה של המיקרוסקופ עד לצפייה בביצים. התאימו את מחט המיקרו-הזרקה מתחת למיקרוסקופ עד שניתן יהיה לראות את קצה ההזרקה ומקמו אותה ליד הביצה להזרקה.
- התחל את ההזרקה בגובה מתאים ובזווית של 30-45 מעלות. הכניסו את הקצה לתוך הביצה בזהירות ליד המיקרופיילים של הביצה (איור 3B) ולחצו על הדוושה כדי להשלים את ההזרקה. משכו את המחט במהירות והזיזו את כרית ההזרקה להזרקת הביצית הבאה.
הערה: יש להבחין בהתרחבות קלה של הביצית במהלך המיקרו-הזרקה. כמות קטנה של דליפה ציטופלזמית בחור הסיכה מקובלת. החלף את מחט ההזרקה בחדשה או התאם את זווית ההזרקה אם זרימת הנוזל היא יותר מדי. - מעבירים את הביצים המוזרקות לצלחת תרבית (צלחת פטרי עם פיסת נייר פילטר לח), ומניחים אותן באינקובטור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
הערה: יעברו כ-13-14 ימים עד שנימפות יבקעו מהביציות המוזרקות האלה (בתנאי שמוטציה בגן המטרה לא תשפיע על התפתחות העוברים) (איור 3C). הזריקו לפחות 100 ביצים כדי להבטיח כמות מספקת של בקיעה ואקלוסיה לחיסול גן מסוים.
4. הערכת שיעור מוטציות וסינון מוטנטים
- בדוק את התפתחות הביציות המוזרקות כל יום לאחר ההזרקה. מעבירים ביצים מוזרקות לצלחת תרבית חדשה כל 24 שעות ב-5 הימים הראשונים.
- ביוםהשישי (או מאוחר יותר) לאחר ההזרקה, יש לבחור ולהעביר באופן אקראי 10 ביצים לתוך צינור ולטחון כראוי את הביצים עם שני כדורי פלדה ב 60 הרץ במשך 6 דקות באמצעות מטחנה (ראה טבלת חומרים). להשעות מחדש את הפסולת עם 1 מ"ל של PBS. מעבירים 5 μL של התערובת לתוך 45 μL של 50 mM NaOH וליז ב 95 ° C במשך 5 דקות. הוסף 5 μL של 1 M Tris-HCl (pH=8.0) למערכת הליזה כדי לסיים את תגובת הליזה הבסיסית.
הערה: ניתן לבחור ביציות לליזה בסיסית בכל יום לאחר ההחזרה האחרונה וניתן להשתמש בביציות מרובות כדגימה אחת בהתאם למצב התפתחותן (למשל, חמישה עוברים בני 6 ימים יכולים לשמש כדגימה אחת, ושני עוברים בני 10 ימים יכולים לשמש כדגימה אחת). לפעמים, זה לא ריאלי לקבל את הדנ"א הגנומי של ביצים באמצעות שיטת ליזה אלקליין. ערכות מיצוי DNA גנומי מסחריות יכולות לשמש כשיטה חלופית לבידוד הדנ"א הגנומי מהביציות. - קח 1 μL של מוצר הליזיס כתבנית PCR כדי להגביר את מקטע גן המטרה (טבלה 2 וטבלה 3) ושלח את מוצרי ה- PCR לריצוף. השוו את תוצאות הריצוף עם הרצף הפראי כדי להעריך באופן ראשוני אם מערכת CRISPR/Cas9 חתכה את גן המטרה in vivo (איור 4A). לאפשר את שאר הביציות להתפתחות הבאה בתנאי indels מזוהים בשלב העוברי.
הערה: בדרך זו, ניתן להעריך את שיעור המוטציות באופן ראשוני בשלב העובר. אם לא נמצאו אינדלים בשלב זה, הכינו כמה sgRNA חדשים לגן המטרה וחזרו על פרוטוקול הנוק-אאוט משלב 2.1. - העבירו את הנימפות שבקעו לכלוב גידול ותרבו אותן כמתואר בשלב 3.3. כאשר הנימפות התפתחו לשלב האינסטאר החמישי, הפרידו אותן בעזרת גביעי תרבית פלסטיים (נימפה / אחת).
הערה: בדרך כלל לוקח לנימפות כ-25-35 ימים להתפתח לכוכב החמישי שלהן והפנוטיפ הבולט ביותר הוא שניצני הכנפיים מתרחבים למקטעי הבטן הרביעי או החמישי. יתר על כן, מומלץ להקליט את הפנוטיפים של נימפות מתות כדי לחזות את הקשר בין גן המטרה לבין פנוטיפים במחקר נוסף. - חותכים כ-2 מ"מ אורך של האנטנות בעזרת מספריים מנתחים ומניחים אותו בשיטת הליזה הבסיסית (שלב 4.2). נתחו את רצף מקטעי גן המטרה של הנימפות האלה כפי שתואר לעיל (שלב 4.3) כדי לזהות את מוטציות G0 (איור 4B).
הערה: חיתוך האנטנות עבור ליזיס יכול להיות מעט ארוך יותר ושחיקה או טחינה של האנטנות מועילה לליזה למרות שניתן לעכל את האנטנות ישירות. פרטים עם פסגות מרובות בקרבת אתר המטרה בתוצאת הריצוף מזוהים כמוטנטים חיוביים ומאפשרים התפתחות והזדווגות לאחר מכן.
5. הקמה ומעבר של קווים מוטנטיים
- בצעו הכלאה צולבת באמצעות מוטנטים מסוג G0 וארבה מסוג בר (איור 4B). אספו את הביציות ודגרו על הביציות בנפרד בטמפרטורה של 30°C. השתמשו ב-3-6 ביציות מפותחות בכל ביצית כדי לזהות מוטציות כמתואר בשלבים 4.2 ו-4.3. שמור ביציות חיוביות למוטציה להתפתחות הבאה ונטוש את הביציות השליליות למוטציה.
הערה: הערכת קצב מוטציות בשלב העוברי יכולה להאיץ מאוד את הסינון של מוטציות G1 . בדרך כלל, ניתן לערבב 3-6 ביצים מפותחות כדגימה אחת לגנוטיפ בתיווך PCR כמתואר לעיל. - מאחור נימפות G1 כמתואר בשלב 4.4. חתכו כ-2 מ"מ אורך של האנטנות כדי לבצע גנוטיפ מבוסס PCR כמתואר בשלב 4.5 לאיתור הטרוזיגוטים G1 . ביצוע שיבוט TA בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים) לזיהוי המוטציות שלו. בצע in-cross באמצעות G1 heterozygotes עם אותן מוטציות כדי לקבל נימפות G2 .
הערה: ריצוף Sanger של מוצרי PCR יכול לספק רק מידע לגילוי הטרוזיגוטים, אך לא מספיק מידע לזיהוי המוטציות המדויקות. לפיכך, שיבוט TA באמצעות מוצרי PCR נדרש כדי לזהות בבירור את המוטציות ויכול לקדם הקמת קווים מוטנטיים יציבים. - מאחור נימפות G2 עד הכוכב החמישי שלהם. השתמשו בגנוטיפ מבוסס PCR המתואר בשלב 5.2 כדי לזהות את ההומוזיגוטים ו/או ההטרוזיגוטים המתאימים למחקר נוסף ולמעבר יציב (איור 4B).
הערה: שימו לב להימנע מערבוב של הומוזיגוטים והטרוזיגוטים. מומלץ לבצע גנוטיפ מבוסס PCR בכל דור כדי לאשר את ההומוזיגוטיות ו/או ההטרוזיגוטיות של כל אוכלוסייה. מספר הארבה המשמש לבדיקה זו תלוי בגודל האוכלוסייה. יתר על כן, ניתן להרחיב את אוכלוסיית הארבה על ידי אסטרטגיית ההצלבה.
6. הקפאת ביצים והחייאה
- לשטוף את הביצים כדי להיות cryopreserved עם מים סטריליים לדגור אותם בכלי תרבית כמתואר לעיל (שלב 3.8) במשך 5-6 ימים. אספו את הביצים יחד בצלחת התרבית וכסו אותן בשברי נייר פילטר. עוטפים את כל מנת התרבות בסרט פרפין.
- שמור את המנה ב 25 ° C במשך 2 ימים ואחריו עוד 2 ימים בטמפרטורה נמוכה יחסית (13-16 ° C). לאחר מכן, להעביר את המנה למקרר 6 מעלות צלזיוס. הוסיפו לתוכו מים כל שבועיים כדי לספק סביבה לחה לביצים (איור 5A).
הערה: העוברים משערים להיות בשלב katatrepsis לאחר שפותחו במשך 5-6 ימים ב 30 ° C26. קירור הדרגתי מועיל לשימור בהקפאה של ביצים (טבלה 5). - להחייאת הביצים בהקפאה, הוציאו את צלחת הפטרי מהמקרר ושמרו אותה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך יומיים. הניחו את הביצים האלה באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס עד שהנימפות יבקעו (איור 5B).
הערה: יש צורך לשים את הביצים cryopreserved ב 25 ° C לפני העברתם לאינקובטור 30 ° C. ניתן לשמר את העוברים בהקפאה למשך חמישה חודשים לפחות, אם כי קצב הבקיעה וקצב האקלוסיה יכולים לרדת בגלל ההקפאה (טבלה 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מכיל את השלבים המפורטים ליצירת מוטציות הומוזיגוטיות של הארבה הנודד עם RNP המורכב מחלבון Cas9 ו- sgRNA מסונתז במבחנה . להלן כמה תוצאות מייצגות של נוקאאוט גן המטרה בתיווך CRISPR/Cas9 בארבה, כולל בחירת מטרה, סינתזה ואימות של sgRNA (איור 1A), איסוף והזרקת ביציות, סינון והעברה מוטנטיים, שימור בהקפאה והחייאה של הביציות ההומוזיגוטיות.
במחקר זה, אתר היעד של מערכת CRISPR/Cas9 נבחר על פי התוצאות של שלוש תוכניות מקוונות (E-CRISP, CRISPOR ו-ZiFit) וממוקם באקסון הראשון (איור 1B). על-פי בדיקת המחשוף במבחנה Cas9 (טבלה 1), ה-CRISPR/Cas9 RNP יכול היה לעכל את מקטע ה-PCR (המכיל את אתר המטרה) בשיעור מחשוף של כ-55% (איור 1C). לאחר מכן, ה-RNP הזה הוזרק במיקרו ל-120 ביציות מופרות בשלב התא הבודד שלהן באמצעות מערכת המיקרו-הזרקה הסטנדרטית (איור 2 ואיור 3). תוצאות הריצוף של הערכת שיעור המוטציות בשלב העוברי הצביעו על עריכה יעילה של הגנום באתר היעד (איור 4A). יתר על כן, מחקר זה הביא לשיעור בקיעת נימפה של 52.73% ו-66.7% מהבוגרים של G0 היו מוטנטים של פסיפס (טבלה 4).
יתר על כן, הכימרות G0 הוצלבו עם ארבה מסוג בר כדי להשיג פרטים הטרוזיגוטיים G 1 והטרוזיגוטים G1 עם אותן מוטציות (שהוקרנו על ידי שיבוט TA) הוצלבו כדי ליצור את חיות G2. פנוטיפ מבוסס PCR שימש לזיהוי מוטנטים, וההומוזיגוטים שהתקבלו נחצו כדי ליצור קווים מוטנטיים יציבים (איור 4B).
בינתיים, עודפי הביצים ההומוזיגוטיות נשמרו בהקפאה כדי לשפר את שיעור הניצול של ההומוזיגוטים. אף על פי שקצב הבקיעה של הביצים שנשמרו, פחת עם הארכת זמן השימור בהקפאה (טבלה 5), הפעולות המתקנות שכללו שימוש בשברי נייר סינון לשמירה על ביצים רטובות ושחזור הביצים שהשתמרו עם שיפוע של עליית טמפרטורה סייעו שתיהן להחייאה (איור 5 וטבלה 5). לבסוף, אוכלוסיית המוטנטים ההומוזיגוטית נשמרה בהצלחה למחקר הבא.
איור 1: תכנון המטרה ואימות במבחנה של ה-sgRNA. (A) דיאגרמת הזרימה לבחירת מטרה, סינתזת sgRNA ואימות ביו-אקטיביות במבחנה (כולל, בין היתר, ארבה). (B) תרשים סכמטי של מבנה הגן ואתר היעד. האקסונים של גן מטרה זה מוצגים כתחומים כחולים ואתר היעד נבחר במורד הזרם של קודון ההתחלה באקסון 1. רצף היעד מסומן באדום. (C) אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז כתוצאה מבדיקת מחשוף Cas9 במבחנה. מקטע DNA המכיל את רצף המטרה (כ-400 bp אורך) הוגבר ושימש כמצע לעיכול Cas9. הפסים הקטנים הצפויים (כ-100 bp ו-300 bp כאן; מסומנים במשולשים אדומים) הציעו כי ה-sgRNA המסונתז יכול לגרום למחשוף Cas9 יעיל. שיעור המחשוף היה כ -55% על פי ניתוח גווני אפור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכנת מחטים וכרית מיקרו-הזרקה לביצי ארבה. (A) קצה של מחט מוכנה למיקרו-הזרקה של ביצי ארבה. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. (B) תמונה של כרית מיקרו-הזרקה עם ביצים (מסומנות במשולש אדום) מסודרות עליה. סרגל קנה המידה מייצג 1 ס"מ. (C) גודל כרית המיקרו-הזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מיקרו-הזרקות ביצים. (A) מערכת מיקרו-הזרקה מייצגת המסומנת בקופסאות אדומות המציינות מיקרוסקופ (באמצע) ומיקרומניפולטור (מימין) המחוברים למיקרו-מזרק (משמאל). המחשב משמש לאחסון נתונים ולמתן תצפית עזר. (B) הזרקת ביצת הארבה. אתר ההזרקה מסומן במשולש אדום. (C) נימפה שבקעה מתחת למיקרוסקופ. פסי קנה המידה מייצגים 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות הריצוף של חיות G 0 ואסטרטגיית המעבר של הקווים המוטנטים. (A) תוצאות הריצוף האופייני בבדיקת G0. פסגות מרובות בקרבת אתר המטרה (מסומנות במלבן אדום ברצף מסוג הבר) הצביעו על כך שהביצה/ארבה שנבדקה נערכה בהצלחה על ידי מערכת CRISPR/Cas9 (כפי שמוצג ב-G 0-1 וב-G0-2), בעוד שהפרט ללא כל שינוי בתוצאת הרצף נחשב כלא ערוך ונטוש (למשל, ז0-3). (B) אסטרטגיית המעבר של הקווים המוטנטים. בעלי החיים G0 נבדקו תחילה על ידי גנוטיפ בתיווך PCR, ואלה עם שיאים מרובים בתוצאות הריצוף שלהם הוצלבו עם ארבה מסוג בר כדי ליצור את חיות G1. גנוטיפ בתיווך PCR ושיבוט TA שימשו לזיהוי הטרוזיגוטים G1. לאחר מכן, הטרוזיגוטים עם אותן מוטציות הוצלבו כדי ליצור את חיות G2 (הומוזיגוטים והטרוזיגוטים) להמשך מחקר ומעבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: שימור ביצים בהקפאה והחייאה. (A) הליך ההקפאה: בודדו את הביצים מתרמילי ביצים ודגרו עליהן בטמפרטורה של 30°C למשך 5-6 ימים לאחר השטיפה במים סטריליים. לאחר מכן, אספו את הביצים המפותחות יחד בצלחת הפטרי וכסו אותן בשאריות קטנות של נייר פילטר לח. עוטפים את כל צלחת הפטרי בסרט פרפין ושומרים אותה על 25 מעלות צלזיוס למשך יומיים, ולאחר מכן עוד יומיים בטמפרטורה נמוכה יחסית (למשל, 13-16 מעלות צלזיוס). לבסוף, מקררים אותו ב 6 ° C. (B) הליך החייאה: להוציא את צלחות פטרי עם ביצים cryoppreserve מהמקרר ולשמור אותם ב 25 ° C במשך 2 ימים לאחר הסרת שאריות נייר פילטר. לאחר מכן, ניתן לתרבית את הביצים להתפתחות לאחר מכן ב -30 מעלות צלזיוס עד שהנימפות בוקעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מגיב | נפח (μL) |
| חלבון Cas9 (300 נ"ג/מיקרוליטר) | 1 |
| sgRNA (300 ננוגרם/μL) | 1 |
| מוצר PCR (200 ננוגרם/מיקרוליטר) | 1 |
| 10×NEBuffer r3.1 | 1 |
| מים ללא Nuclease | 6 |
טבלה 1: מערכת עיכול חוץ גופית . 200 ננוגרם של מקטע מטרה מטוהר (מוצר PCR) עורבבו עם מערכת CRISPR/Cas9 (300 ננוגרם מכל רכיב) לבדיקת הפעילות הביולוגית של sgRNA המסונתז. נעשה שימוש בחיץ מסחרי ונוספו מים נטולי נוקלאז כדי להשלים את הנפח הכולל ל-10 מיקרוליטר.
| מגיב | נפח (μL) |
| 2xEs Taq MasterMix | 12.5 |
| פריימר קדימה | 0.5 |
| פריימר הפוך | 0.5 |
| תבנית (מוצר ליזיס) | 1 |
| מים ללא Nuclease | 10.5 |
טבלה 2: מערכת PCR להגברת מקטע גן מטרה. כדי להגביר את המקטע הגנומי של גן המטרה, נעשה שימוש בתערובת טאק מסחרית ונוספו פריימרים בהתאם להוראות היצרן. 1 μL של מוצר הליזה שימש כתבנית ומים נטולי נוקלאז שימשו כדי להפוך את הנפח הכולל ל 25 μL.
| טמפרטורה (°C) | זמן | מחזורים |
| 95 | 5 דקות | 1 |
| 95 | 30 שניות | 35 |
| 55 | 30 שניות | |
| 72 | 40 שניות | |
| 72 | 10 דק' | 1 |
טבלה 3: תוכנית PCR להגברה של גני מטרה. תוכנית ה-PCR להגברת גן המטרה הייתה: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 35 מחזורים של 95 °C עבור 30 s, 55 °C עבור 30 s, 72 °C עבור 40 שניות; 72°C למשך 10 דקות.
| פריטים | נתונים |
| מס' של ביצים מוזרקות | 120 |
| עוברים שנבדקו | 10 |
| מס' של נימפות שבקעו | 58 |
| קצב בקיעה | 52.73% |
| מס' של G0 מבוגר | 12 |
| מס' של מוטנטים G0 | 8 |
| יעילות מוטציה ב-G0 מבוגרים | 66.67% |
טבלה 4: סיכום יעילות העריכה. 120 ביציות הוזרקו כדי לדפוק את גן המטרה ו-10 ביציות נלקחו לבדיקה בשלב העובר. 58 נימפות בקעו משאר העוברים (שיעור הבקיעה היה 52.73%). לבסוף, 12 גר'0 ארבה התפתחו לשלב הבוגר ו-8 מהם נערכו בהצלחה באתר היעד. שיעור המוטציות ב-G0 מבוגרים היה 66.67%.
| קבוצת בקרה | בית 1 | בית 2 | בית 3 | בית 4 | |
| מס' ביצים | 120 | 120 | 120 | 120 | 120 |
| טיפול טמפרטורה לאחסון | 30°C | 30°C (5-6 °F)→6 °C | 30°C (5-6 D)→25°C (2 D)→13-16°C (2 D)→6°C | 30°C (5-6 D)→25°C (2 D)→13-16°C (2 D)→6°C | 30°C (5-6 D)→25°C (2 D)→13-16°C (2 D)→6°C |
| זמן אחסון | 14 יום | 14 יום | חודש 1 | 3 חודשים | 5 חודשים |
| טיפול בטמפרטורה להחייאה | 30°C | 6°C→30°C | 6°C→25°C (2 D)→30°C | 6°C→25°C (2 D)→30°C | 6°C→25°C (2 D)→30°C |
| מס' של ארבה שבקע | 108 | 0 | 96 | 86 | 78 |
| קצב בקיעה | 90.00% | 0 | 80.00% | 71.67% | 65.00% |
| מס' של ארבה בוגר | 81 | 0 | 60 | 46 | 31 |
| קצב אקלוסיה | 75.00% | 0 | 62.50% | 53.49% | 39.74% |
טבלה 5: סיכום ההקפאה וההחייאה של ביציות. 600 ביציות חולקו לחמש קבוצות למחקר הקפאה והחייאה. הקבוצה הראשונה (ביקורת) של 120 ביצים הודגרה תמיד ב 30 מעלות צלזיוס ואוחסנה במשך 14 ימים. הקבוצה השנייה (קבוצה 1) של 120 ביצים הועברה למקרר לאחר הדגירה ב 30 ° C במשך 5-6 ימים ואוחסנה ב 6 ° C במשך 14 ימים. לאחר מכן, ביצים אלה הועברו ל 30 מעלות צלזיוס להחייאה. הקבוצות האחרות (קבוצה 2, קבוצה 3 וקבוצה 4, כל קבוצה הכילה 120 ביציות) חוו קירור הדרגתי וטיפול בטמפרטורה כמתואר בפרוטוקול (שלבים 6.1-6.3) עם זמן אחסון שונה (חודש אחד לקבוצה 2, 3 חודשים לקבוצה 3 ו-5 חודשים לקבוצה 4). לבסוף בקעו 108 נימפות מקבוצת הביקורת (בקצב בקיעה של 90%) ו-81 מהן התפתחו לשלב הבוגר (75% משיעור האקלוסיון). בקבוצה השנייה לא בקע ארבה (קבוצה 1). קצב הבקיעה וקצב האקלוסיה של הקבוצות האחרות היו נמוכים יותר בהשוואה לקבוצת הביקורת וירדו עם זמן האחסון. 96 נימפות בקעו בקבוצה 2 ו-60 מהן התפתחו לשלב הבוגר. 86 נימפות בקעו בקבוצה 3 ו-46 מהן התפתחו לשלב הבוגר. בקבוצה 4 בקעו 78 נימפות ו-31 מהן התפתחו לשלב הבוגר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ארבה היה בין המזיקים ההרסניים ביותר לחקלאות מאז הציוויליזציה של בני האדם23 . טכנולוגיית עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 היא כלי רב עוצמה להקניית ידע טוב יותר על המנגנונים הביולוגיים בארבה, כמו גם אסטרטגיית הדברה מבטיחה. לפיכך, יש תועלת רבה בפיתוח שיטה יעילה וקלה לשימוש של בנייה בתיווך CRISPR/Cas9 של מוטציות ארבה הומוזיגוטיות. למרות שכמה עבודות נהדרות דווחו וסיפקו זרימת עבודה בסיסית לעריכת גנום בארבה 18,20,21,22, אופטימיזציה שיטתית של ההליך כולו עדיין חסרה. באופן כללי, ניתן לחלק את מוטציית הארבה ההומוזיגוטית הנוצרת על ידי הזרקה עוברית של מערכת CRISPR/Cas9 לשלושה שלבים עיקריים: א) תכנון, סינתזה וסינון sgRNA במבחנה, ב) איסוף, הכנה והזרקת ביציות; ו-ג) סינון מוטנטי ושמירה על הומוזיגוטים. פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה אופטימלית והשלבים של בחירת אתר המטרה, בדיקת sgRNA במבחנה, מיקרו-הזרקה של הביצים וכן איתור מוטנטים הם קריטיים במיוחד ליצירת ארבה מוטנטי הומוזיגוטי ביעילות עם מערכת CRISPR/Cas9.
ראשית, אתר המטרה, צורת ה-sgRNA המתאים וריכוז ה-sgRNA הוצעו כגורמים קריטיים ליעילות עריכת הגנום בחרקים18,27,28. כדי לפתור בעיה זו, מומלץ לנתח תחילה את מבנה הגן ולעצב יותר מאתר מטרה אחד באקסון 1 או בסמוך לקודון ההתחלה באמצעות המשאבים המקוונים. לאחר מכן, סנתז sgRNA במבחנה וערבב אותו עם חלבון Cas9 בריכוזים שונים כדי לייעל את יעילות החיתוך של RNP. הליך זה יסייע לזהות sgRNA עם פעילות ביולוגית גבוהה ולייעל את הרכב קומפלקס RNP עבור גן היעד המועמד.
שנית, איסוף כמה שיותר ביצים טריות בזמן מוגבל ושיפור קצב הבקיעה וקצב המוטציות הם גם אתגרים גדולים לפעולות עריכת גנום. הארבה הבוגר הגדל במצב של 16 (אור):8 (כהה) פוטופריוד משמש לאיסוף מספיק ביצים בתקופה קצרה בין השעות 9:00-11:00. חשוב להפעיל בעדינות לחץ כלפי מטה בין הביצים באמצעות מברשת צבע או פינצטה כדי לבודד בזהירות את הביצים מהתרמיל. עם מספיק תרגול, משתמשים מרובים יכולים להפריד ביצים בודדות באופן אמין מהתרמיל. לאחר שכל ביצה מבודדת ונשטפת במים סטריליים, הביצים מיושרות על רפידות ההזרקה המתוכננות (איור 2B,C) כדי לייצב את הביצים במהלך מיקרו-הזרקה. הביצה מוזרקת עם RNP אופטימלי ליד micropyles. כדי לצמצם את הנזק המכני ולמזער את זיהום הביצים, ביצים טריות מורשות להישאר בתרמילים במשך כ -30 דקות כדי לוודא ששיזוף קליפת הביצה אידיאלי למיקרו-הזרקה21, בשל המבנה המעובה שלה ויכולת ההגנה הגבוהה שלה בפלישה לאחר מספיק שיזוף29,30. בינתיים, דו"ח שפורסם הצביע על כך שהחלוקה הסינקטיאלית31 של ביצי ארבה מתרחשת בשלב כלשהו בין 0 שעות ל -4 שעות לאחר ההטלה. עם פרוטוקול המיקרו-הזרקה הסטנדרטי הנוכחי, הזרקה של כ-100 ביציות יכולה להתבצע תוך 40 דקות. יחד, הליך של שיזוף מיקרו הזרקה של 100 ביצים מופרות ניתן להשלים בתוך 2 שעות. לפיכך, נותרו לפחות שעתיים למחשוף בתיווך CRISRP/Cas9 ולתיקון גני המטרה להשגת מוטציה יעילה בביציות המוזרקות ובארבה הבוגר העתידי.
לבסוף, אסטרטגיות יעילות לזיהוי עוברי דרך ומוטנטיים חשובות ליצירת הומוזיגוטים ברוב בעלי החיים המוטנטים. בארבה, עבור גנים שאינם קטלניים לאחר עריכה, אסטרטגיית הצלב המוצעת כאן היא שמוטנטים מסוג G0 חוצים עם ארבה מסוג רחב, ובהמשך ניתן לבצע הצלבות באמצעות הטרוזיגוטים G1 עם אותן מוטציות כדי ליצור מוטציות הומוזיגוטיות בדור הבא. כדי לאמת את המוטציה בכל ארבה במהלך תהליך ההורשה המוטנטי, מומלץ להשתמש בשיטת הליזה הבסיסית כדי לעכל קטע קצר של אנטנות כתבנית לגנוטיפ מבוסס PCR. לבסוף, השתמש במבוגרים ההומוזיגוטיים המתקבלים להמשך הצלבה כדי להרחיב את האוכלוסייה. מוגבל על ידי גודל האוכלוסייה והבדלי שלב ההתפתחות בין ארבה הומוזיגוטים, הביצים העודפות מומלצות להקפאה ב -6 מעלות צלזיוס והחייאה על ידי עליית טמפרטורה הדרגתית (איור 5), המבוססת על העיקרון של דיאפאוזה בטמפרטורה נמוכה ושחרור דיאפאוזה בטמפרטורה גבוהה של ביצי ארבה נודדות32,33.
בקיצור, מערכת CRISPR/Cas9 הוכחה ככלי אמין המאפשר את חקר הגנומיקה הפונקציונלית של ארבה נודד. פרוטוקול מפורט זה יכול לשמש כהפניה ליישומי עריכת גנים מבוססי CRISPR/Cas9 בארבה נודד כמו גם בחרקים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32070502, 31601697, 32072419 והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2020M672205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×NEBuffer r3.1 | New England Biolabs | B7030S | The buffer of in vitro Cas9 cleavage assays |
| 2xEs Taq MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0690 | For gene amplification |
| 2xPfu MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0686 | For gene amplification |
| CHOPCHOP | Online website for designing sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/. | ||
| CRISPOR | Online website for designing sgRNAs, http://crispor.org. | ||
| CRISPRdirect | Online website for designing sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/. | ||
| Electrophoresis power supply | LIUYI BIOLOGY | DYY-6D | Separation of nucleic acid molecules of different sizes |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 30125177 | For sample collection, etc. |
| Fine brushes | Annigoni | 1235 | For cleaning and isolating eggs. Purchased online. |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | For making the microinjection needles |
| Gel Extraction Kit | Cwbio | CW2302 | DNA recovery and purification |
| Gel Imaging Analysis System | OLYMPUS | Gel Doc XR | Observe the electrophoresis results |
| GeneTouch Plus | Bioer | B-48DA | For gene amplification |
| Glass electrode capillary | Gairdner | GD-102 | For making injection needles with a micropipette Puller |
| Incubator | MEMMERT | INplus55 | For migratory locust embryo culture |
| Metal bath | TIANGEN | AJ-800 | For heating the sample |
| Micro autoinjector | Eppendorf | 5253000068 | Microinjection of embryos early in development |
| Micro centrifuge | Allsheng | MTV-1 | Used for mixing reagents |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | To ground the tip of injection needle |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | For loading solutions into the injection needles. |
| Micromanipulation system | Eppendorf | TransferMan 4r | An altinative manipulation system for microinjection |
| Microscope | cnoptec | SZ780 | For microinjection |
| Motor-drive Manipulator | NARISHIGE | MM-94 | For controling the position of the micropipette during the microinjection precedure |
| Multi-Sample Tissue Grinder | jingxin | Tissuelyser-64 | Grind and homogenize the eggs |
| ovipisition pot | ChangShengYuanYi | CS-11 | Filled with wet sterile sand for locust ovipositing in it. The oocysts are collected from this container. Purchased online. |
| Parafilm | ParafilmM | PM996 | For wrapping the petri dishes. |
| pEASY-T3 Cloning Kit | TransGen Biotech | CT301-01 | For TA cloning |
| Petri dish | NEST | 752001 | For culture and preservation of the eggs. |
| Pipettor | Eppendorf | Research plus | For sample loading |
| plastic culture cup | For rearing locusts seperately and any plastic cup big enough (not less than 1000 mL in volume) will do. Purchased online. | ||
| Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Primer Premier | PREMIER Biosoft | Primer Premier 5.00 | For primer design |
| SnapGene | Insightful Science | SnapGene®4.2.4 | For analyzing sequences |
| Steel balls | HuaXinGangQiu | HXGQ60 | For sample grinding.Purchased online. |
| Tips | bioleaf | D781349 | For sample loading |
| Trans DNA Marker II | TransGen Biotech | BM411-01 | Used to determine gene size |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo | A36496 | Cas9 protein |
| UniversalGen DNA Kit | Cwbio | CWY004 | For genomic DNA extraction |
| VANNAS Scissors | Electron Microscopy Sciences | 72932-01 | For cutting off the antennae |
| Wheat | To generate wheat seedlings as the food for locusts. Bought from local farmers. | ||
| ZiFiT | Online website for designing sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx. |
References
- Doudna, J. A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).
- van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechnology. 38 (7), 845-855 (2020).
- McCarty, N. S., Graham, A. E., Studena, L., Ledesma-Amaro, R. Multiplexed CRISPR technologies for gene editing and transcriptional regulation. Nature Communications. 11 (1), 1281 (2020).
- Manghwar, H., et al. CRISPR/Cas systems in genome editing: Methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects. Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., Nakata, A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology. 169 (12), 5429-5433 (1987).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa Armigera (Hubner). Journal of Visualized Experiments: JoVE1. (173), e62068 (2021).
- Huang, Y., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of the abdominal-A homeotic gene in the global pest, diamondback moth (Plutella xylostella). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 75, 98-106 (2016).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Xu, X., et al. BmHpo mutation induces smaller body size and late stage larval lethality in the silkworm, Bombyx mori. Insect Science. 25 (6), 1006-1016 (2018).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 60 (2018).
- Zhang, T., et al. Egg tanning improves the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated mutant locust production by enhancing defense ability after microinjection. Journal of Integrative Agriculture. 20 (10), 2716-2726 (2021).
- Guo, X., et al. 4-Vinylanisole is an aggregation pheromone in locusts. Nature. 584 (7822), 584-588 (2020).
- Zhang, L., Lecoq, M., Latchininsky, A., Hunter, D. Locust and grasshopper management. Annual Review of Entomology. 64, 15-34 (2019).
- Yang, P., Hou, L., Wang, X., Kang, L. Core transcriptional signatures of phase change in the migratory locust. , Available from: http://www.locustmine.org:8080/locustmine (2019).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. , Available from: http://www.e-crisp.org/E-CRISP/ (2014).
- Pétavy, G. Origin and development of the vitellophags during embryogenesis of the migratory locust, Locusta migratoria L. (Orthoptera : Acrididae). International Journal of Insect Morphology and Embryology. 14 (6), 361-379 (1985).
- Barry, S. K., et al. Injecting Gryllus bimaculatus eggs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59726 (2019).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome editing in the cricket, Gryllus bimaculatus. Methods in Molecular Biology. 1630, 219-233 (2017).
- Du, M. H., et al. Suppression of Laccase 2 severely impairs cuticle tanning and pathogen resistance during the pupal metamorphosis of Anopheles sinensis (Diptera: Culicidae). Parasites & Vectors. 10 (1), 171 (2017).
- Eisner, T., Shepherd, J., Happ, G. M. Tanning of grasshopper eggs by an exocrine secretion. Science. 152 (3718), 95-97 (1966).
- Ho, K., Dunin-Borkowski, O. M., Akam, M. Cellularization in locust embryos occurs before blastoderm formation. Development. 124 (14), 2761-2768 (1997).
- Wang, X., et al. Interactive effect of photoperiod and temperature on the induction and termination of embryonic diapause in the migratory locust. Pest Managment Science. 77 (6), 2854-2862 (2021).
- Jarwar, A. R., et al. Comparative transcriptomic analysis reveals molecular profiles of central nervous system in maternal diapause induction of Locusta migratoria. G3-Genes Genomes Genetics. 9 (10), 3287-3296 (2019).
