הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בניית מוטנטים הומוזיגוטיים של ארבה נודד בטכנולוגיית CRISPR/Cas9

2.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63629

⸱

16 במרץ 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cotton Biology, Key Laboratory of Plant Stress Biology, School of Life Sciences, Henan University, 2Research Institute of Applied Biology, Shanxi University, 3School of Life Science, Shanxi University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מספק הליך מותאם באופן שיטתי של בנייה מבוססת ריבונוקלאז CRISPR/Cas9 של מוטציות ארבה הומוזיגוטיות, כמו גם שיטה מפורטת לשימור בהקפאה והחייאת ביצי ארבה.

תקציר

הארבה הנודדת, Locusta migratoria, היא לא רק אחת מארבות המגפה העולמיים שגרמו הפסדים כלכליים עצומים לבני אדם, אלא גם מודל מחקרי חשוב למטמורפוזה של חרקים. מערכת CRISPR/Cas9 יכולה לאתר במדויק במיקום דנ"א ספציפי ולהיבקע בתוך אתר המטרה, ולהציג ביעילות הפסקות דו-גדיליות כדי לגרום לנוקאאוט של גן המטרה או לשלב מקטעי גנים חדשים בלוקוס הספציפי. עריכת גנום בתיווך CRISPR/Cas9 היא כלי רב עוצמה להתמודדות עם שאלות בחקר הארבה, כמו גם טכנולוגיה מבטיחה להדברת ארבה. מחקר זה מספק פרוטוקול שיטתי לנוקאאוט גנים בתיווך CRISPR/Cas9 עם קומפלקס של חלבון Cas9 ורנ"א מנחה יחיד (sgRNAs) בארבה נודד. בחירת אתרי המטרה והעיצוב של sgRNA מתוארים בפירוט, ולאחר מכן סינתזת מבחנה ואימות של sgRNAs. הליכים מאוחרים יותר כוללים איסוף רפסודות ביצים והפרדת ביצים שזופות כדי להשיג מיקרו-הזרקה מוצלחת עם שיעור תמותה נמוך, תרבית ביצים, הערכה ראשונית של שיעור המוטציות, רבייה של ארבה וכן גילוי, שימור ומעבר של המוטנטים כדי להבטיח את יציבות האוכלוסייה של הארבה הערוך. שיטה זו יכולה לשמש כהפניה ליישומי עריכת גנים מבוססי CRISPR/Cas9 בארבה נודד כמו גם בחרקים אחרים.

מבוא

טכנולוגיות עריכת גנים יכולות לשמש להחדרת החדרות או מחיקות למוקד גנום ספציפי כדי לשנות באופן מלאכותי את גן המטרה למטרה1. בשנים האחרונות, טכנולוגיית CRISPR/Cas9 התפתחה במהירות ויש לה היקף הולך וגדל של יישומים בתחומים שונים של מדעי החיים 2,3,4,5,6. מערכת CRISPR/Cas9 התגלתה עוד בשנת 19877, ונמצאה באופן נרחב בחיידקים ובארכאה. מחקר נוסף הצביע על כך שמדובר במערכת חיסון פרוקריוטית נרכשת התלויה בנוקלאז מונחה RNA Cas9 כדי להילחם בפאגים8. מערכת CRISPR/Cas9 שעברה שינוי מלאכותי מורכבת בעיקר משני מרכיבים, RNA מנחה יחיד (sgRNA) וחלבון Cas9. ה-sgRNA מורכב מ-CRISPR RNA (crRNA) המשלים את רצף המטרה ומ-crRNA טרנסאקטיבי עזר (tracrRNA), שנשמר יחסית. כאשר מערכת CRISPR/Cas9 מופעלת, ה-sgRNA יוצר ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) עם חלבון Cas9 ומנחה את Cas9 לאתר המטרה שלו באמצעות זיווג הבסיס של אינטראקציות RNA-DNA. לאחר מכן, הדנ"א הדו-גדילי יכול להיבקע על ידי חלבון Cas9 וכתוצאה מכך, שבר הגדיל הכפול (DSB) מופיע ליד מוטיב הפרוטוספייסר הסמוך (PAM) של אתר המטרה 9,10,11,12. כדי למתן את הנזק שנגרם על ידי DSBs, תאים יפעילו תגובות מקיפות של נזק לדנ"א כדי לזהות ביעילות את הנזקים הגנומיים וליזום את הליך התיקון. ישנם שני מנגנוני תיקון נפרדים בתא: חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR). NHEJ הוא מסלול התיקון הנפוץ ביותר שיכול לתקן שברים דו-גדיליים של DNA במהירות ומונע אפופטוזיס של תאים. עם זאת, הוא מועד לטעויות בגלל השארת שברים קטנים של החדרות ומחיקות (indels) ליד DSBs, אשר בדרך כלל גורם לשינוי מסגרת קריאה פתוחה ולכן יכול להוביל להסתרת גנים. לעומת זאת, תיקון הומולוגי הוא אירוע נדיר למדי. בתנאי שיש תבנית תיקון עם רצפים הומולוגיים להקשר של DSB, תאים יתקנו מדי פעם את השבר הגנומי בהתאם לתבנית הסמוכה. התוצאה של HDR היא שה- DSB מתוקן במדויק. במיוחד, אם יש רצף נוסף בין הרצפים ההומולוגיים בתבנית, הם ישולבו בגנום באמצעות HDR, וכך ניתן יהיה לממש את החדרות הגנים הספציפיים13.

עם אופטימיזציה ופיתוח של מבני sgRNA וגרסאות חלבון Cas9, מערכת העריכה הגנטית מבוססת CRISPR/Cas9 יושמה בהצלחה גם במחקר של חרקים, כולל אך לא מוגבל Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella, ו Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. למיטב ידיעת המחברים, למרות ש-RNPs המורכבים מחלבון Cas9 ו-sgRNA משועתק במבחנה שימשו לעריכת גנום ארבה20,21,22, פרוטוקול שיטתי ומפורט לבנייה בתיווך ריבונוקלאז CRISPR/Cas9 של מוטציות הומוזיגוטיות של הארבה הנודד עדיין חסר.

הארבה הנודד הוא מזיק חקלאי חשוב בעל תפוצה עולמית ומהווה איום ממשי על ייצור המזון, בהיותו מזיק במיוחד לצמחי גרמין כגון חיטה, תירס, אורז ודוחן23. ניתוח תפקודי גנים המבוסס על טכנולוגיות עריכת גנום יכול לספק מטרות חדשות ואסטרטגיות חדשות להדברת ארבה נודד. מחקר זה מציע שיטה מפורטת להשמדת גנים נודדים של ארבה באמצעות מערכת CRISPR/Cas9, כולל בחירת אתרי מטרה ועיצוב sgRNAs, סינתזת מבחנה ואימות של sgRNAs, מיקרו-הזרקה ותרבית ביציות, הערכת שיעור המוטציות בשלב העוברי, איתור מוטנטים וכן מעבר ושימור של המוטציות. פרוטוקול זה יכול לשמש כנקודת ייחוס בסיסית למניפולציה של הרוב המכריע של גני הארבה ויכול לספק הפניות יקרות ערך לעריכת גנום של חרקים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. בחירת אתר יעד ועיצוב sgRNA

  1. לאסוף כמה שיותר מידע על רצפים עבור הגן המעניין באמצעות מחקר ספרותי ו / או חיפוש mRNA או רצף DNA מקודד (CDS) של הגן ב NCBI ומסד נתונים ארבה24.
  2. השווה את רצף הגן המעוניין לרצף הדנ"א הגנומי שלו כדי להבחין בין אזורי האקסון והאינטרון.
  3. בחר אזור מועמד לעיצוב אתר היעד בהתבסס על מטרת המחקר. תכנן זוגות פריימר כדי להגביר את מקטע האזור המועמד ולאמת את הרצף הפרוע שלו על ידי ניתוח רצף של מוצר ה- PCR.
    הערה: ישנן אסטרטגיות שונות לבחירת אזור היעד של המועמד. לדוגמה, ברוב מחקרי תפקודי הגנים/חלבונים, השתמשו במקטע האקסון הקרוב לקודון ההתחלה שלו כאזור המועמד כדי להבטיח שכל פונקציית החלבון/רנ"א תאבד לאחר עריכת הגנום (כלומר, נוק-אאוט של גנים). בעוד עבור ניתוח פונקציות של תחום מסוים, בחר את האזור המועמד בתחילת (או שני הקצוות) של הדומיין.
  4. השתמש במשאבים מקוונים כגון E-CRISP Design25 כדי לחפש אתרי יעד פוטנציאליים באזור היעד המועמד.
    1. בחר "Drosophila melanogaster BDGP6" (או כל חרק אחר) ברשימה הנפתחת של גנומי הייחוס ובחר "קלט הוא רצף FSTA" ולאחר מכן הדבק את רצף אזור היעד בתיבת הטקסט (בפורמט FSTA).
    2. הפעל את היישום על ידי לחיצה על "התחל חיפוש sgRNA" עם "בינוני" ו "עיצוב יחיד" כדי לקבל את אתרי היעד האפשריים. בחר 1-3 מטרות פוטנציאליות מהתוצאות בהתבסס על הציונים החזויים שלהן ותכנן את ה- sgRNA המתאים בהתאם.
      הערה: ישנן פלטפורמות מקוונות רבות נוספות לעיצוב קריספר, כגון CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT וכן הלאה (ראה טבלת חומרים). לחלקם יש את הפונקציה של בדיקת ספציפיות עבור המינים שנתוני הרצף הגנומי שלהם נמצאים במאגרי המידע שלהם. עם זאת, הרצף הגנומי של הארבה לא נמצא בשום אתר אינטרנט. עדיף להשתמש ביותר מכלי מקוון אחד לעיצוב CRISPR בארבה. באופן מקיף, שקול את התוצאות מאתרים שונים ובחר את ה-sgRNA מהתוצאות על-פי העיקרון של הספציפיות הגבוהה ביותר, היעילות הגבוהה ביותר ושיעור אי-ההתאמה הנמוך ביותר (איור 1A,B).

2. סינתזה ואימות של sgRNA במבחנה

  1. סנתז את ה-sgRNA באמצעות ערכות סינתזת sgRNA בהתאם למדריך היצרן (Table of Materials). הליך זה כולל בדרך כלל שלושה שלבים: הגברת תבנית DNA, שעתוק חוץ גופי וטיהור sgRNA21. דללו את ה-sgRNA המסונתז במים נטולי נוקלאז לריכוז אחסון של 300 ננוגרם/מיקרוליטר לשימוש נוסף.
  2. הגבירו וטיהרו את מקטע גן המטרה כדי שישמש כמצע לבדיקת המחשוף במבחנה של מערכת CRISPR/Cas9. בצע שלבים אלה בהתאם להוראות היצרן.
  3. דללו את חלבון Cas9 שנרכש ל-300 ננוגרם/מיקרוליטר עם מים נטולי נוקלאז. דגרו 1 μL של sgRNA (300 ng/μL) ו-1 μL של חלבון Cas9 (300 ng/μL) עם 200 ng של מקטע מטרה מטוהר במאגר המחשוף ב-37°C למשך שעה אחת (10 μL מהנפח הכולל; ראו טבלה 1). העריכו את היעילות של מחשוף Cas9 המושרה על ידי sgRNA על-ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (איור 1C). בחר את sgRNAs עם פעילות גבוהה עבור microinjection הבא.
    הערה: ניתן להמיר את התוצאות של אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז לתמונות בגווני אפור באמצעות תוכנת עיבוד תמונה ויעילות המחשוף נאמדת על פי גווני האפור של הפסים בגדלים משוערים.

3. מיקרו-הזרקה ותרבית של הביצים

  1. מכינים את מחטי ההזרקה על ידי משיכת נימי זכוכית עם מושך מיקרופיפטה (טבלה של חומרים). הגדר את הפרמטרים באופן הבא: חום ל- 588, משוך ל- 90, מהירות ל- 60 וזמן ל- 40. טוחנים את קצה מחט ההזרקה עם מטחנת מיקרו (טבלת חומרים).
    הערה: קצות המחטים האידיאליים פתוחים וחדים (איור 2A). מומלץ מאוד להכין מחטים נוספות לניסויים מכיוון שמחטים לעיתים חסומות או נשברות בטעות במהלך הזרקות.
  2. ערבבו 1 μL של חלבון Cas9 (300 ng/μL) עם 1 μL של sgRNA מאומת (300 ng/μL) יחד כדי לקבל את ה-RNPs להזרקה. הוסף 8 μL של מים סטריליים ללא RNase כדי להפוך את הנפח הסופי של התערובת ל 10 μL. מערבבים היטב את התמיסה ושומרים אותה על קרח.
    הערה: ניתן למטב את הריכוזים הסופיים של חלבון Cas9 ו- sgRNA בהתאם לתוצאות העריכה. יש להימנע מהקפאה והפשרה חוזרת ונשנית של תמיסת ה-RNP המוכנה, ומומלץ להשתמש בה באופן מיידי.
  3. מגדלים את הארבה הבוגר הזכר והנקבה יחד בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם פוטופריוד של 16 (אור):8 (כהה) ומספקים להם מספיק שתילי חיטה טריים כמזון. התבוננו בארבה זה מדי יום והכניסו לכלוב הגידול עציץ אוביפוזישן (עציץ פלסטיק או מלאה בחול סטרילי רטוב) לכלוב הגידול לאחר שהארבה הזדווג.
    הערה: בדרך כלל, 100 זוגות של ארבה בוגר המגודל בכלוב גידול (40 ס"מ x 40 ס"מ x 40 ס"מ) מספיקים כדי לייצר ביצים כדי לדפוק גן יחיד. תרבו זוגות ארבה נוספים אם יש צורך בביצים נוספות.
  4. אספו את תרמילי הביצים הטריות מהסיר והמתינו כ-30 דקות לשיזוף ביצים. בודדו בעדינות את הביצים מתרמילי הביצים במים בעזרת מברשת עדינה ושטפו אותן במים סטריליים שלוש פעמים. שמרו את הביצים בצלוחית פטרי והוסיפו מים סטריליים כדי לשמור עליהן לחות.
    הערה: שיזוף הביצים שזה עתה הוטלו יכול לשפר באופן משמעותי את יעילות המוטציה21.
  5. ממלאים מחט הזרקה בתמיסת RNP מוכנה וטוענים אותה למיקרומניפולטור (טבלת חומרים).
    1. הגדר את פרמטרי המיקרו-הזרקה באופן הבא: 300 hPa של לחץ ההזרקה (pi), 0.5 שניות של זמן ההזרקה (ti) ו- 25 hPa של לחץ הפיצוי (pc).
    2. לחץ על הדוושה כדי להעריך את עוצמת הקול של התמיסה המוזרקת. התאם את לחץ ההזרקה ואת זמן ההזרקה כדי להבטיח שנפח ההזרקה הוא כ- 50-100 nL.
      הערה: יש למצות את שאריות האוויר במחט כדי להפוך את תמיסת ההזרקה לרציפה וניתנת לשליטה ככל האפשר. החיבור של המחט ואת micromanipulator צריך להיות הדוק.
  6. סדרו את הביציות הסטריליות באופן קבוע על משטח ההזרקה (איור 2B,C) והניחו את הפד על שולחן העצמים במיקרוסקופ (איור 3A). התאימו את ההגדלה של המיקרוסקופ עד לצפייה בביצים. התאימו את מחט המיקרו-הזרקה מתחת למיקרוסקופ עד שניתן יהיה לראות את קצה ההזרקה ומקמו אותה ליד הביצה להזרקה.
  7. התחל את ההזרקה בגובה מתאים ובזווית של 30-45 מעלות. הכניסו את הקצה לתוך הביצה בזהירות ליד המיקרופיילים של הביצה (איור 3B) ולחצו על הדוושה כדי להשלים את ההזרקה. משכו את המחט במהירות והזיזו את כרית ההזרקה להזרקת הביצית הבאה.
    הערה: יש להבחין בהתרחבות קלה של הביצית במהלך המיקרו-הזרקה. כמות קטנה של דליפה ציטופלזמית בחור הסיכה מקובלת. החלף את מחט ההזרקה בחדשה או התאם את זווית ההזרקה אם זרימת הנוזל היא יותר מדי.
  8. מעבירים את הביצים המוזרקות לצלחת תרבית (צלחת פטרי עם פיסת נייר פילטר לח), ומניחים אותן באינקובטור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
    הערה: יעברו כ-13-14 ימים עד שנימפות יבקעו מהביציות המוזרקות האלה (בתנאי שמוטציה בגן המטרה לא תשפיע על התפתחות העוברים) (איור 3C). הזריקו לפחות 100 ביצים כדי להבטיח כמות מספקת של בקיעה ואקלוסיה לחיסול גן מסוים.

4. הערכת שיעור מוטציות וסינון מוטנטים

  1. בדוק את התפתחות הביציות המוזרקות כל יום לאחר ההזרקה. מעבירים ביצים מוזרקות לצלחת תרבית חדשה כל 24 שעות ב-5 הימים הראשונים.
  2. ביוםהשישי (או מאוחר יותר) לאחר ההזרקה, יש לבחור ולהעביר באופן אקראי 10 ביצים לתוך צינור ולטחון כראוי את הביצים עם שני כדורי פלדה ב 60 הרץ במשך 6 דקות באמצעות מטחנה (ראה טבלת חומרים). להשעות מחדש את הפסולת עם 1 מ"ל של PBS. מעבירים 5 μL של התערובת לתוך 45 μL של 50 mM NaOH וליז ב 95 ° C במשך 5 דקות. הוסף 5 μL של 1 M Tris-HCl (pH=8.0) למערכת הליזה כדי לסיים את תגובת הליזה הבסיסית.
    הערה: ניתן לבחור ביציות לליזה בסיסית בכל יום לאחר ההחזרה האחרונה וניתן להשתמש בביציות מרובות כדגימה אחת בהתאם למצב התפתחותן (למשל, חמישה עוברים בני 6 ימים יכולים לשמש כדגימה אחת, ושני עוברים בני 10 ימים יכולים לשמש כדגימה אחת). לפעמים, זה לא ריאלי לקבל את הדנ"א הגנומי של ביצים באמצעות שיטת ליזה אלקליין. ערכות מיצוי DNA גנומי מסחריות יכולות לשמש כשיטה חלופית לבידוד הדנ"א הגנומי מהביציות.
  3. קח 1 μL של מוצר הליזיס כתבנית PCR כדי להגביר את מקטע גן המטרה (טבלה 2 וטבלה 3) ושלח את מוצרי ה- PCR לריצוף. השוו את תוצאות הריצוף עם הרצף הפראי כדי להעריך באופן ראשוני אם מערכת CRISPR/Cas9 חתכה את גן המטרה in vivo (איור 4A). לאפשר את שאר הביציות להתפתחות הבאה בתנאי indels מזוהים בשלב העוברי.
    הערה: בדרך זו, ניתן להעריך את שיעור המוטציות באופן ראשוני בשלב העובר. אם לא נמצאו אינדלים בשלב זה, הכינו כמה sgRNA חדשים לגן המטרה וחזרו על פרוטוקול הנוק-אאוט משלב 2.1.
  4. העבירו את הנימפות שבקעו לכלוב גידול ותרבו אותן כמתואר בשלב 3.3. כאשר הנימפות התפתחו לשלב האינסטאר החמישי, הפרידו אותן בעזרת גביעי תרבית פלסטיים (נימפה / אחת).
    הערה: בדרך כלל לוקח לנימפות כ-25-35 ימים להתפתח לכוכב החמישי שלהן והפנוטיפ הבולט ביותר הוא שניצני הכנפיים מתרחבים למקטעי הבטן הרביעי או החמישי. יתר על כן, מומלץ להקליט את הפנוטיפים של נימפות מתות כדי לחזות את הקשר בין גן המטרה לבין פנוטיפים במחקר נוסף.
  5. חותכים כ-2 מ"מ אורך של האנטנות בעזרת מספריים מנתחים ומניחים אותו בשיטת הליזה הבסיסית (שלב 4.2). נתחו את רצף מקטעי גן המטרה של הנימפות האלה כפי שתואר לעיל (שלב 4.3) כדי לזהות את מוטציות G0 (איור 4B).
    הערה: חיתוך האנטנות עבור ליזיס יכול להיות מעט ארוך יותר ושחיקה או טחינה של האנטנות מועילה לליזה למרות שניתן לעכל את האנטנות ישירות. פרטים עם פסגות מרובות בקרבת אתר המטרה בתוצאת הריצוף מזוהים כמוטנטים חיוביים ומאפשרים התפתחות והזדווגות לאחר מכן.

5. הקמה ומעבר של קווים מוטנטיים

  1. בצעו הכלאה צולבת באמצעות מוטנטים מסוג G0 וארבה מסוג בר (איור 4B). אספו את הביציות ודגרו על הביציות בנפרד בטמפרטורה של 30°C. השתמשו ב-3-6 ביציות מפותחות בכל ביצית כדי לזהות מוטציות כמתואר בשלבים 4.2 ו-4.3. שמור ביציות חיוביות למוטציה להתפתחות הבאה ונטוש את הביציות השליליות למוטציה.
    הערה: הערכת קצב מוטציות בשלב העוברי יכולה להאיץ מאוד את הסינון של מוטציות G1 . בדרך כלל, ניתן לערבב 3-6 ביצים מפותחות כדגימה אחת לגנוטיפ בתיווך PCR כמתואר לעיל.
  2. מאחור נימפות G1 כמתואר בשלב 4.4. חתכו כ-2 מ"מ אורך של האנטנות כדי לבצע גנוטיפ מבוסס PCR כמתואר בשלב 4.5 לאיתור הטרוזיגוטים G1 . ביצוע שיבוט TA בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים) לזיהוי המוטציות שלו. בצע in-cross באמצעות G1 heterozygotes עם אותן מוטציות כדי לקבל נימפות G2 .
    הערה: ריצוף Sanger של מוצרי PCR יכול לספק רק מידע לגילוי הטרוזיגוטים, אך לא מספיק מידע לזיהוי המוטציות המדויקות. לפיכך, שיבוט TA באמצעות מוצרי PCR נדרש כדי לזהות בבירור את המוטציות ויכול לקדם הקמת קווים מוטנטיים יציבים.
  3. מאחור נימפות G2 עד הכוכב החמישי שלהם. השתמשו בגנוטיפ מבוסס PCR המתואר בשלב 5.2 כדי לזהות את ההומוזיגוטים ו/או ההטרוזיגוטים המתאימים למחקר נוסף ולמעבר יציב (איור 4B).
    הערה: שימו לב להימנע מערבוב של הומוזיגוטים והטרוזיגוטים. מומלץ לבצע גנוטיפ מבוסס PCR בכל דור כדי לאשר את ההומוזיגוטיות ו/או ההטרוזיגוטיות של כל אוכלוסייה. מספר הארבה המשמש לבדיקה זו תלוי בגודל האוכלוסייה. יתר על כן, ניתן להרחיב את אוכלוסיית הארבה על ידי אסטרטגיית ההצלבה.

6. הקפאת ביצים והחייאה

  1. לשטוף את הביצים כדי להיות cryopreserved עם מים סטריליים לדגור אותם בכלי תרבית כמתואר לעיל (שלב 3.8) במשך 5-6 ימים. אספו את הביצים יחד בצלחת התרבית וכסו אותן בשברי נייר פילטר. עוטפים את כל מנת התרבות בסרט פרפין.
  2. שמור את המנה ב 25 ° C במשך 2 ימים ואחריו עוד 2 ימים בטמפרטורה נמוכה יחסית (13-16 ° C). לאחר מכן, להעביר את המנה למקרר 6 מעלות צלזיוס. הוסיפו לתוכו מים כל שבועיים כדי לספק סביבה לחה לביצים (איור 5A).
    הערה: העוברים משערים להיות בשלב katatrepsis לאחר שפותחו במשך 5-6 ימים ב 30 ° C26. קירור הדרגתי מועיל לשימור בהקפאה של ביצים (טבלה 5).
  3. להחייאת הביצים בהקפאה, הוציאו את צלחת הפטרי מהמקרר ושמרו אותה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך יומיים. הניחו את הביצים האלה באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס עד שהנימפות יבקעו (איור 5B).
    הערה: יש צורך לשים את הביצים cryopreserved ב 25 ° C לפני העברתם לאינקובטור 30 ° C. ניתן לשמר את העוברים בהקפאה למשך חמישה חודשים לפחות, אם כי קצב הבקיעה וקצב האקלוסיה יכולים לרדת בגלל ההקפאה (טבלה 5).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מכיל את השלבים המפורטים ליצירת מוטציות הומוזיגוטיות של הארבה הנודד עם RNP המורכב מחלבון Cas9 ו- sgRNA מסונתז במבחנה . להלן כמה תוצאות מייצגות של נוקאאוט גן המטרה בתיווך CRISPR/Cas9 בארבה, כולל בחירת מטרה, סינתזה ואימות של sgRNA (איור 1A), איסוף והזרקת ביציות, סינון והעברה מוטנטיים, שימור בהקפאה והחייאה של הביציות ההומוזיגוטיות.

במחקר זה, אתר היעד של מערכת CRISPR/Cas9 נבחר על פי התוצאות של שלוש תוכניות מקוונות (E-CRISP, CRISPOR ו-ZiFit) וממוקם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ארבה היה בין המזיקים ההרסניים ביותר לחקלאות מאז הציוויליזציה של בני האדם23 . טכנולוגיית עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 היא כלי רב עוצמה להקניית ידע טוב יותר על המנגנונים הביולוגיים בארבה, כמו גם אסטרטגיית הדברה מבטיחה. לפיכך, יש תועלת רבה בפיתוח שיטה יעילה וקלה לשימוש של בנייה בתיווך CRISPR/Cas9 של מוטציות ארבה הומוזיגוטיות. למרות שכמה עבודות נהדרות דווחו וסיפקו זרימת עבודה בסיסית לעריכת גנום בארבה 18,20,21,22,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32070502, 31601697, 32072419 והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2020M672205).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10 פעמים; NEBuffer r3.1ניו אינגלנד BiolabsB7030Sהמאגר של   in vitro מבחני מחשוף Cas9
2xEs Taq MasterMix (צבע)CwbioCW0690להגברת גנים
2xPfu MasterMix (צבע)CwbioCW0686להגברת גנים
אתר מקוון CHOPCHOP
CRISPOROnline לעיצוב sgRNAs, http://crispor.org.
אתר CRISPRdirectOnline לעיצוב sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/.
ספק כוח אלקטרופורזהLIUYI BIOLOGYDYY-6Dהפרדה של מולקולות חומצות גרעין בגדלים שונים
אפנדורף Eppendorf30125177לאיסוף דגימות וכו '.
מברשות עדינותAnnigoni1235לניקוי ובידוד ביצים. נרכש באינטרנט.
חולץ מיקרופיפטה בוער/חוםSutter InstrumentP97להכנת מחטי המיקרו-הזרקה
ערכת מיצוי ג'לCwbioCW2302שחזור וטיהור DNA
מערכת ניתוח הדמיית ג'לOLYMPUSGel Doc XRהתבונן בתוצאות האלקטרופורזה
GeneTouch PlusBioerB-48DAלהגברת גנים
זכוכית נימי אלקטרודהGairdnerGD-102להכנה  מחטי הזרקה עם  א  חממת חולץ מיקרופיפטה
MEMMERTINplus55לתרבית עובר ארבה נודד
אמבט מתכתTIANGENAJ-800לחימום הדגימה
מיקרו מזרק אוטומטיEppendorf5253000068מיקרו-הזרקה של עוברים בשלב מוקדם בפיתוח
מיקרו צנטריפוגהAllshengMTV-1משמש לערבוב ריאגנטים
מיקרו-מטחנהNARISHIGEEG-401להארקת קצה מחט ההזרקה
MicroloaderEppendorf5242956003להעמסת תמיסות לתוך מחטי ההזרקה.
מערכת מיקרומניפולציהEppendorfTransferMan 4rמערכת מניפולציה אלטינטיבית למיקרו-הזרקה
מיקרוסקופcnoptecSZ780למניפולטור כונן מנוע מיקרו-הזרקה
NARISHIGEMM-94לשליטה במיקום המיקרופיפטה במהלך קדם המיקרו-הזרקה
מטחנת רקמות מרובת דגימהjingxinTissuelyser-64טוחנים והומוגניזציה של
סיר הביציםChangShengYuanYiCS-11מלא בחול סטרילי רטוב להטלת ארבה בו. האוציסטים נאספים ממיכל זה. נרכש באינטרנט.
ParafilmParafilmMPM996לעטיפת צלחות הפטרי.
ערכת שיבוט pEASY-T3TransGen BiotechCT301-01לשיבוט ת"א
צלחת פטריNEST752001לתרבית ושימור הביצים.
פיפטוראפנדורףמחקר פלוסלטעינת מדגם
לגידול ארבה בנפרד וכל פלסטיק גדולה מספיק (לא פחות מ-1000 מ"ל בנפח) תתאים. נרכש באינטרנט.
ערכת סינתזת gRNA מדויקתThermoA29377לסינתזת sgRNA
פריימר PremierPREMIER BiosoftPrimer Premier 5.00לעיצוב פריימר
SnapGeneInsightful ScienceSnapGene® 4.2.4לניתוח   רצפים כדורי
פלדהHuaXinGangQiuHXGQ60לטחינת מדגם. נרכש באינטרנט.
טיפיםbioleafD781349לטעינת דגימה
Trans DNA Marker IITransGen BiotechBM411-01משמש לקביעת גודל הגן
TrueCut Cas9 חלבון v2ThermoA36496Cas9 חלבון
UniversalGen DNA KitCwbioCWY004למיצוי DNA גנומי
VANNAS מספרייםמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית72932-01לכריתת האנטנות
חיטהליצירת שתילי חיטה כמזון לארבה. נקנה מחקלאים מקומיים.
ZiFiTOnline לעיצוב sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx.
לעיצוב sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/.אתר צינור תרבית פלסטיק אתר

מקורות

  1. Doudna, J. A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).
  2. van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechnology. 38 (7), 845-855 (2020).
  3. McCarty, N. S., Graham, A. E., Studena, L., Ledesma-Amaro, R. Multiplexed CRISPR technologies for gene editing and transcriptional regulation. Nature Communications. 11 (1), 1281(2020).
  4. Manghwar, H., et al. CRISPR/Cas systems in genome editing: Methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects. Advanced Science. 7 (6), 1902312(2020).
  5. Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
  6. Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
  7. Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., Nakata, A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology. 169 (12), 5429-5433 (1987).
  8. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  9. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  10. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471(2013).
  11. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
  14. Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa Armigera (Hubner). Journal of Visualized Experiments: JoVE1. (173), e62068(2021).
  15. Huang, Y., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of the abdominal-A homeotic gene in the global pest, diamondback moth (Plutella xylostella). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 75, 98-106 (2016).
  16. Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
  17. Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
  18. Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
  19. Xu, X., et al. BmHpo mutation induces smaller body size and late stage larval lethality in the silkworm, Bombyx mori. Insect Science. 25 (6), 1006-1016 (2018).
  20. Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 60(2018).
  21. Zhang, T., et al. Egg tanning improves the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated mutant locust production by enhancing defense ability after microinjection. Journal of Integrative Agriculture. 20 (10), 2716-2726 (2021).
  22. Guo, X., et al. 4-Vinylanisole is an aggregation pheromone in locusts. Nature. 584 (7822), 584-588 (2020).
  23. Zhang, L., Lecoq, M., Latchininsky, A., Hunter, D. Locust and grasshopper management. Annual Review of Entomology. 64, 15-34 (2019).
  24. Yang, P., Hou, L., Wang, X., Kang, L. Core transcriptional signatures of phase change in the migratory locust. , Available from: http://www.locustmine.org:8080/locustmine (2019).
  25. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. , Available from: http://www.e-crisp.org/E-CRISP/ (2014).
  26. Pétavy, G. Origin and development of the vitellophags during embryogenesis of the migratory locust, Locusta migratoria L. (Orthoptera : Acrididae). International Journal of Insect Morphology and Embryology. 14 (6), 361-379 (1985).
  27. Barry, S. K., et al. Injecting Gryllus bimaculatus eggs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59726(2019).
  28. Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome editing in the cricket, Gryllus bimaculatus. Methods in Molecular Biology. 1630, 219-233 (2017).
  29. Du, M. H., et al. Suppression of Laccase 2 severely impairs cuticle tanning and pathogen resistance during the pupal metamorphosis of Anopheles sinensis (Diptera: Culicidae). Parasites & Vectors. 10 (1), 171(2017).
  30. Eisner, T., Shepherd, J., Happ, G. M. Tanning of grasshopper eggs by an exocrine secretion. Science. 152 (3718), 95-97 (1966).
  31. Ho, K., Dunin-Borkowski, O. M., Akam, M. Cellularization in locust embryos occurs before blastoderm formation. Development. 124 (14), 2761-2768 (1997).
  32. Wang, X., et al. Interactive effect of photoperiod and temperature on the induction and termination of embryonic diapause in the migratory locust. Pest Managment Science. 77 (6), 2854-2862 (2021).
  33. Jarwar, A. R., et al. Comparative transcriptomic analysis reveals molecular profiles of central nervous system in maternal diapause induction of Locusta migratoria. G3-Genes Genomes Genetics. 9 (10), 3287-3296 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

sgRNA
בניית מוטנטים הומוזיגוטיים של ארבה נודד בטכנולוגיית CRISPR/Cas9
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.