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Biology

CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी का उपयोग करके प्रवासी टिड्डियों के होमोजीगस उत्परिवर्ती का निर्माण

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63629
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3, 1, 2,3, 2,3, 2, 2
1State Key Laboratory of Cotton Biology, Key Laboratory of Plant Stress Biology, School of Life Sciences, Henan University, 2Research Institute of Applied Biology, Shanxi University, 3School of Life Science, Shanxi University
* These authors contributed equally

Summary

यह अध्ययन सीआरआईएसपीआर/कैस 9 राइबोन्यूक्लिज़-आधारित होमोजीगस टिड्डी उत्परिवर्ती के निर्माण के साथ-साथ टिड्डियों के अंडे के क्रायोप्रिजर्वेशन और पुनर्जीवन के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करता है।

Abstract

प्रवासी टिड्डी, टिड्डी प्रवासी, न केवल दुनिया भर में प्लेग टिड्डियों में से एक है जिसने मनुष्यों को भारी आर्थिक नुकसान पहुंचाया, बल्कि कीट कायापलट के लिए एक महत्वपूर्ण शोध मॉडल भी है। CRISPR / Cas9 प्रणाली एक विशिष्ट डीएनए स्थान पर सटीक रूप से पता लगा सकती है और लक्ष्य स्थल के भीतर छोड़ सकती है, लक्ष्य जीन नॉकआउट को प्रेरित करने या विशिष्ट स्थान में नए जीन टुकड़ों को एकीकृत करने के लिए कुशलतापूर्वक डबल-स्ट्रैंड ब्रेक पेश कर सकती है। CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन टिड्डी अनुसंधान में आने वाले सवालों के साथ-साथ टिड्डी नियंत्रण के लिए एक आशाजनक तकनीक के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यह अध्ययन प्रवासी टिड्डियों में कैस 9 प्रोटीन और सिंगल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) के परिसर के साथ सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-मध्यस्थता जीन नॉकआउट के लिए एक व्यवस्थित प्रोटोकॉल प्रदान करता है। लक्ष्य साइटों का चयन और एसजीआरएनए के डिजाइन को विस्तार से वर्णित किया गया है, इसके बाद इन विट्रो संश्लेषण और एसजीआरएनए का सत्यापन किया जाता है। बाद की प्रक्रियाओं में कम मृत्यु दर, अंडा संवर्धन के साथ सफल माइक्रोइंजेक्शन प्राप्त करने के लिए अंडा राफ्ट संग्रह और टैन्ड-एग पृथक्करण शामिल है, अंडे की संस्कृति, उत्परिवर्तन दर का प्रारंभिक अनुमान, टिड्डी प्रजनन के साथ-साथ संपादित टिड्डियों की जनसंख्या स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए उत्परिवर्ती का पता लगाना, संरक्षण और पारित करना। इस विधि का उपयोग प्रवासी टिड्डियों के साथ-साथ अन्य कीड़ों में CRISPR/Cas9 आधारित जीन संपादन अनुप्रयोगों के लिए एक संदर्भ के रूप में किया जा सकता है।

Introduction

जीन संपादन प्रौद्योगिकियों का उपयोग उद्देश्य1 पर लक्ष्य जीन को कृत्रिम रूप से संशोधित करने के लिए एक विशिष्ट जीनोम लोकस में सम्मिलन या विलोपन को पेश करने के लिए किया जा सकता है। पिछले वर्षों में, CRISPR / Cas9 प्रौद्योगिकी तेजी से विकसित हुई है और जीवन विज्ञान 2,3,4,5,6 के विभिन्न क्षेत्रों में अनुप्रयोगों की बढ़ती गुंजाइश है। CRISPR / Cas9 प्रणाली 1987 में वापस खोजी गईथी, और व्यापक रूप से बैक्टीरिया और आर्किया में पाया जाता है। आगे के शोध ने संकेत दिया कि यह एक प्रोकैरियोटिक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली थी जो फेज8 के खिलाफ लड़ने के लिए आरएनए-निर्देशित न्यूक्लियस कैस 9 पर निर्भर करती है। कृत्रिम रूप से संशोधित CRISPR / Cas9 प्रणाली में मुख्य रूप से दो घटक होते हैं, एक एकल गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) और कैस 9 प्रोटीन। एसजीआरएनए एक सीआरआईएसपीआर आरएनए (सीआरआरएनए) से बना है जो लक्ष्य अनुक्रम के पूरक है और एक सहायक ट्रांस-सक्रिय सीआरआरएनए (ट्रैसीआरएनए) है, जो अपेक्षाकृत संरक्षित है। जब CRISPR / Cas9 प्रणाली सक्रिय होती है, तो sgRNA Cas9 प्रोटीन के साथ एक राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (RNP) बनाता है और RNA-DNA इंटरैक्शन की आधार जोड़ी के माध्यम से Cas9 को अपने लक्ष्य स्थल पर मार्गदर्शन करता है। फिर, डबल-स्ट्रैंड डीएनए को कैस 9 प्रोटीन द्वारा क्लीवर किया जा सकता है और परिणामस्वरूप, डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) लक्ष्य साइट 9,10,11,12 के प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) के पास उभरता है। डीएसबी के कारण होने वाले नुकसान को कम करने के लिए, कोशिकाएं जीनोमिक क्षति का कुशलतापूर्वक पता लगाने और मरम्मत प्रक्रिया शुरू करने के लिए व्यापक डीएनए क्षति प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करेंगी। सेल में दो अलग-अलग मरम्मत तंत्र हैं: गैर-होमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे) और होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर)। एनएचईजे सबसे आम मरम्मत मार्ग है जो डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक को जल्दी से ठीक कर सकता है और सेल एपोप्टोसिस को रोकता है। हालांकि, डीएसबी के पास सम्मिलन और विलोपन (इंडेल) के छोटे टुकड़े छोड़ने के कारण यह त्रुटि-प्रवण है, जिसके परिणामस्वरूप आमतौर पर एक ओपन रीडिंग फ्रेम शिफ्ट होता है और इस प्रकार जीन नॉक-आउट हो सकता है। इसके विपरीत, समरूप मरम्मत काफी दुर्लभ घटना है। इस शर्त पर कि डीएसबी के संदर्भ के अनुरूप अनुक्रमों के साथ एक मरम्मत टेम्पलेट है, कोशिकाएं कभी-कभी पास के टेम्पलेट के अनुसार जीनोमिक ब्रेक की मरम्मत करेंगी। एचडीआर का परिणाम यह है कि डीएसबी की ठीक से मरम्मत की जाती है। विशेष रूप से, यदि टेम्पलेट में समरूप अनुक्रमों के बीच एक अतिरिक्त अनुक्रम है, तो उन्हें एचडीआर के माध्यम से जीनोम में एकीकृत किया जाएगा, और इस तरह, विशिष्ट जीन सम्मिलनको महसूस किया जा सकता है।

एसजीआरएनए संरचनाओं और कैस 9 प्रोटीन वेरिएंट के अनुकूलन और विकास के साथ, सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-आधारित आनुवंशिक संपादन प्रणाली को भी कीड़ों के अनुसंधान में सफलतापूर्वक लागू किया गया है, जिसमें ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, एडीज एजिप्टी, बॉम्बिक्स मोरी, हेलिकोवेर्पा आर्मिगेरा, प्लुटेला ज़ाइलोस्टेला और लोकस्टा माइग्रेटोरिया14,15,16,17,18 तक सीमित नहीं है।, 19. लेखकों की जानकारी के अनुसार, हालांकि कैस 9 प्रोटीन और इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड एसजीआरएनए से युक्त आरएनपी का उपयोग टिड्डी जीनोम संपादन20,21,22 के लिए किया गया है, लेकिन प्रवासी टिड्डियों के होमोजीगस म्यूटेंट के सीआरआईएसपीआर/कैस 9 राइबोन्यूक्लिज़ मध्यस्थता निर्माण के लिए एक व्यवस्थित और विस्तृत प्रोटोकॉल का अभी भी अभाव है।

प्रवासी टिड्डी एक महत्वपूर्ण कृषि कीट है जिसका वैश्विक वितरण है और खाद्य उत्पादन के लिए पर्याप्त खतरा पैदा करता है, विशेष रूप से ग्रामीण पौधों, जैसे गेहूं, मक्का, चावल और बाजरा23 के लिए हानिकारक है। जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों पर आधारित जीन फ़ंक्शन विश्लेषण प्रवासी टिड्डियों के नियंत्रण के लिए नए लक्ष्य और नई रणनीतियां प्रदान कर सकता है। इस अध्ययन में सीआरआईएसपीआर/कैस9 प्रणाली के माध्यम से प्रवासी टिड्डियों के जीनों को बाहर निकालने के लिए एक विस्तृत विधि का प्रस्ताव किया गया है, जिसमें लक्ष्य स्थलों का चयन और एसजीआरएनए का डिजाइन, एसजीआरएनए का इन विट्रो संश्लेषण और सत्यापन, अंडे का माइक्रोइंजेक्शन और कल्चर, भ्रूण चरण में उत्परिवर्तन दर का अनुमान, उत्परिवर्ती का पता लगाने के साथ-साथ उत्परिवर्ती का मार्ग और संरक्षण शामिल है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग टिड्डी जीन के विशाल बहुमत के हेरफेर के लिए एक बेसल संदर्भ के रूप में किया जा सकता है और अन्य कीड़ों के जीनोम संपादन के लिए मूल्यवान संदर्भ प्रदान कर सकता है।

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Protocol

1. लक्ष्य साइट चयन और एसजीआरएनए डिजाइन

  1. साहित्य अनुसंधान और / या एनसीबीआई और टिड्डी डेटाबेस24 में जीन के एमआरएनए या कोडिंग डीएनए अनुक्रम (सीडीएस) की खोज के माध्यम से रुचि के जीन के लिए जितना संभव हो उतना अनुक्रम जानकारी एकत्र करें।
  2. एक्सॉन और इंट्रॉन क्षेत्रों को अलग करने के लिए इच्छुक जीन के अनुक्रम की तुलना उसके जीनोमिक डीएनए अनुक्रम से करें।
  3. अनुसंधान उद्देश्य के आधार पर लक्ष्य साइट डिजाइन के लिए एक उम्मीदवार क्षेत्र का चयन करें। उम्मीदवार क्षेत्र के टुकड़े को बढ़ाने और पीसीआर उत्पाद के अनुक्रमण विश्लेषण द्वारा इसके जंगली-प्रकार के अनुक्रम को सत्यापित करने के लिए प्राइमर जोड़े डिजाइन करें।
    नोट: उम्मीदवार लक्ष्य क्षेत्र के चयन के लिए विभिन्न रणनीतियाँ हैं। उदाहरण के लिए, अधिकांश जीन / प्रोटीन फ़ंक्शन अनुसंधान में, एक्सॉन टुकड़े का उपयोग उम्मीदवार क्षेत्र के रूप में अपने शुरुआती कोडन के करीब करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि जीनोम संपादन (यानी, जीन नॉक-आउट) के बाद पूरा प्रोटीन / आरएनए फ़ंक्शन खो गया है। जबकि किसी विशिष्ट डोमेन के फ़ंक्शन विश्लेषण के लिए, डोमेन के शुरुआत (या दोनों छोरों) पर उम्मीदवार क्षेत्र का चयन करें।
  4. उम्मीदवार लक्ष्य क्षेत्र में संभावित लक्ष्य साइटों की खोज करने के लिए ई-CRISP डिज़ाइन25 जैसे ऑनलाइन संसाधनों का उपयोग करें।
    1. संदर्भ जीनोम की ड्रॉप-डाउन सूची में "ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर बीडीजीपी 6" (या कोई अन्य कीट) चुनें और "इनपुट फास्टा अनुक्रम है" चुनें, इसके बाद टेक्स्टबॉक्स में लक्ष्य क्षेत्र के अनुक्रम को पेस्ट करें (एफएएसटीए प्रारूप में)।
    2. संभावित लक्ष्य साइटों को प्राप्त करने के लिए "मध्यम" और "एकल डिज़ाइन" के साथ "एसजीआरएनए खोज प्रारंभ करें" दबाकर एप्लिकेशन शुरू करें। उनके अनुमानित स्कोर के आधार पर परिणामों से 1-3 संभावित लक्ष्यों का चयन करें और तदनुसार संबंधित एसजीआरएनए डिजाइन करें।
      नोट: CRISPR डिज़ाइन के लिए कई और ऑनलाइन प्लेटफ़ॉर्म हैं, जैसे CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT, और इतने पर ( सामग्री की तालिका देखें)। उनमें से कुछ में उन प्रजातियों के लिए विशिष्टता जांच का कार्य है जिनके जीनोमिक अनुक्रम डेटा उनके डेटाबेस में हैं। हालांकि, किसी भी ऑनलाइन वेबसाइट पर टिड्डियों का जीनोमिक अनुक्रम नहीं पाया गया है। टिड्डियों में सीआरआईएसपीआर डिजाइन के लिए एक से अधिक ऑनलाइन टूल का उपयोग करना बेहतर है। व्यापक रूप से, विभिन्न वेबसाइटों के परिणामों पर विचार करें और उच्चतम विशिष्टता, उच्चतम दक्षता और कम से कम बेमेल दर (चित्रा 1 ए, बी) के सिद्धांत पर परिणामों से एसजीआरएनए का चयन करें।

2. विट्रो में एसजीआरएनए का संश्लेषण और सत्यापन।

  1. निर्माता के मैनुअल (सामग्री की तालिका) के अनुसार एसजीआरएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके एसजीआरएनए को संश्लेषित करें। इस प्रक्रिया में आमतौर पर तीन चरण शामिल होते हैं: डीएनए टेम्पलेट प्रवर्धन, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन, और एसजीआरएनए शुद्धिकरण21। आगे के उपयोग के लिए 300 एनजी / μL की भंडारण एकाग्रता के लिए न्यूक्लियस-मुक्त पानी के साथ संश्लेषित एसजीआरएनए को पतला करें।
  2. CRISPR / Cas9 प्रणाली के इन विट्रो दरार परख के सब्सट्रेट के रूप में सेवा करने के लिए लक्ष्य जीन टुकड़े को बढ़ाएं और शुद्ध करें। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए इन चरणों का पालन करें।
  3. खरीदे गए कैस 9 प्रोटीन को न्यूक्लियस मुक्त पानी के साथ 300 एनजी / 1 μL sgRNA (300 ng/μL) और Cas9 प्रोटीन (300 ng/μL) के 1 μL को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर दरार बफर में 200 ng शुद्ध लक्ष्य टुकड़े के साथ इनक्यूबेट करें (कुल मात्रा का 10 μL; तालिका 1 देखें)। एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 1 सी) द्वारा एसजीआरएनए प्रेरित कैस 9 दरार की दक्षता का अनुमान लगाएं। निम्नलिखित माइक्रोइंजेक्शन के लिए उच्च गतिविधि वाले एसजीआरएनए का चयन करें।
    नोट: एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन के परिणामों को छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के साथ ग्रेस्केल छवियों में परिवर्तित किया जा सकता है और क्लीवेज दक्षता का अनुमान अनुमानित आकार के बैंड के ग्रेस्केल के अनुसार लगाया जाता है।

3. अंडे का माइक्रोइंजेक्शन और संस्कृति

  1. माइक्रोपिपेट पुलर (सामग्री की तालिका) के साथ कांच की केशिकाओं को खींचकर इंजेक्शन सुइयों को तैयार करें। पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: 588 तक हीट, 90 तक खींचें, वेग 60 तक, और समय 40 तक। इंजेक्शन सुई की नोक को माइक्रो ग्राइंडर (सामग्री की तालिका) के साथ पीस लें।
    नोट: आदर्श सुई युक्तियाँ खुली और तेज धार वाली होती हैं (चित्रा 2 ए)। प्रयोगों के लिए अतिरिक्त सुइयों को तैयार करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है क्योंकि इंजेक्शन के दौरान सुइयों को कभी-कभी अवरुद्ध या गलती से तोड़ दिया जाता है।
  2. इंजेक्शन के लिए आरएनपी प्राप्त करने के लिए सत्यापित एसजीआरएनए (300 एनजी / μL) के 1 μL के साथ Cas9 प्रोटीन (300 ng / μL) के 1 μL को एक साथ मिलाएं। मिश्रण की अंतिम मात्रा को 10 μL तक बनाने के लिए RNase-मुक्त बाँझ पानी के 8 μL जोड़ें। घोल को अच्छी तरह से मिलाएं और इसे बर्फ पर रखें।
    नोट: कैस 9 प्रोटीन और एसजीआरएनए की अंतिम सांद्रता को संपादन परिणामों के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है। तैयार आरएनपी समाधान के दोहराव वाले ठंड और पिघलने से बचें और तत्काल उपयोग की सिफारिश की जाती है।
  3. नर और मादा वयस्क टिड्डियों को 16 (प्रकाश): 8 (अंधेरे) फोटोपीरियड के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर एक साथ पालें और उन्हें भोजन के रूप में पर्याप्त ताजा गेहूं के पौधों की आपूर्ति करें। इन टिड्डियों का रोजाना निरीक्षण करें और टिड्डियों के आपस में जुड़ जाने के बाद ओविपोजिशन पॉट (गीली बाँझ रेत से भरा एक प्लास्टिक का गमला या कप) को पालन पिंजरे में डाल दें।
    नोट: आमतौर पर, एक पालन पिंजरे (40 सेमी x 40 सेमी x 40 सेमी) में पाले गए वयस्क टिड्डियों के 100 जोड़े एक जीन को बाहर निकालने के लिए अंडे उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त हैं। यदि अधिक अंडे की आवश्यकता हो तो अतिरिक्त टिड्डियों के जोड़े का संवर्धन करें।
  4. ओविपोजिशन पॉट से ताजा रखी गई अंडे की फली इकट्ठा करें और अंडे की टैनिंग के लिए लगभग 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें। धीरे से अंडे की फली से अंडे को एक बारीक ब्रश का उपयोग करके पानी में अलग करें और उन्हें बाँझ पानी से तीन बार धोएं। अंडे को पेट्री डिश में रखें और उन्हें नम रखने के लिए बाँझ पानी डालें।
    नोट: नए रखे गए अंडों की टैनिंग उत्परिवर्ती दक्षतामें काफी सुधार कर सकती है।
  5. तैयार आरएनपी समाधान के साथ एक इंजेक्शन सुई भरें और इसे माइक्रोमैनिपुलेटर (सामग्री की तालिका) में लोड करें।
    1. माइक्रोइंजेक्शन पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: इंजेक्शन दबाव (पीआई) का 300 एचपीए, इंजेक्शन समय (टीआई) का 0.5 एस, और मुआवजा दबाव (पीसी) का 25 एचपीए।
    2. इंजेक्शन समाधान की मात्रा का मूल्यांकन करने के लिए पेडल दबाएं। यह सुनिश्चित करने के लिए इंजेक्शन दबाव और इंजेक्शन समय समायोजित करें कि इंजेक्शन की मात्रा लगभग 50-100 एनएल है।
      नोट: इंजेक्शन समाधान को यथासंभव निरंतर और नियंत्रणीय बनाने के लिए सुई में अवशिष्ट हवा को समाप्त करें। सुई और माइक्रोमैनिपुलेटर का कनेक्शन तंग होना चाहिए।
  6. बाँझ अंडे को नियमित रूप से इंजेक्शन पैड (चित्रा 2 बी, सी) पर व्यवस्थित करें और पैड को माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 ए) की ऑब्जेक्ट टेबल पर रखें। जब तक अंडे नहीं देखे जाते तब तक माइक्रोस्कोप के आवर्धन को समायोजित करें। माइक्रोस्कोप के नीचे माइक्रोइंजेक्शन सुई को समायोजित करें जब तक कि इंजेक्शन टिप को देखा जा सके और इसे इंजेक्शन के लिए अंडे के पास रखें।
  7. इंजेक्शन को उपयुक्त ऊंचाई और 30-45 डिग्री के कोण पर शुरू करें। अंडे के माइक्रोपाइल्स (चित्रा 3 बी) के पास अंडे में टिप को सावधानी से डालें और इंजेक्शन को पूरा करने के लिए पेडल दबाएं। सुई को जल्दी से वापस लें और अगले अंडे के इंजेक्शन के लिए इंजेक्शन पैड को स्थानांतरित करें।
    नोट: माइक्रोइंजेक्शन के दौरान अंडे का थोड़ा विस्तार देखा जाना चाहिए। पिनहोल में साइटोप्लाज्मिक रिसाव की एक छोटी मात्रा स्वीकार्य है। इंजेक्शन सुई को एक नए के साथ बदलें या इंजेक्शन कोण को समायोजित करें यदि तरल पदार्थ का बहिर्वाह बहुत अधिक है।
  8. इंजेक्शन वाले अंडे को एक कल्चर डिश (नम फिल्टर पेपर के टुकड़े के साथ एक पेट्री डिश) में स्थानांतरित करें, और उन्हें 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: इन इंजेक्शन वाले अंडों से अप्सराओं के निकलने में लगभग 13-14 दिन लगेंगे (इस शर्त पर कि लक्ष्य जीन का उत्परिवर्तन भ्रूण के विकास को प्रभावित नहीं करता है) (चित्रा 3 सी)। एक विशिष्ट जीन को बाहर निकालने के लिए पर्याप्त सेने और उत्सर्जन राशि सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 100 अंडे इंजेक्ट करें।

4. उत्परिवर्तन दर अनुमान और उत्परिवर्ती की स्क्रीनिंग

  1. इंजेक्शन के बाद हर दिन इंजेक्शन अंडे के विकास की जांच करें। पहले 5 दिनों में हर 24 घंटे में अंडे को एक नई संस्कृति डिश में स्थानांतरित करें।
  2. इंजेक्शन के बाद 6वें दिन (या बाद में) यादृच्छिक रूप से 10 अंडे को एक ट्यूब में उठाएं और स्थानांतरित करें और ग्राइंडर का उपयोग करके 6 मिनट के लिए 60 हर्ट्ज पर दो स्टील गेंदों के साथ अंडे को पर्याप्त रूप से पीस लें ( सामग्री की तालिका देखें)। पीबीएस के 1 एमएल के साथ मलबे को फिर से निलंबित करें। मिश्रण के 5 μL को 50 mM NaOH के 45 μL में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 95 °C पर लाइज़ करें। क्षारीय लाइसिस प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए लाइसिस सिस्टम में 1 एम ट्रिस-एचसीएल (पीएच = 8.0) के 5 μL जोड़ें।
    नोट: अंतिम हस्तांतरण के बाद किसी भी दिन क्षारीय लाइसिस के लिए अंडे उठाए जा सकते हैं और उनके विकास की स्थिति के आधार पर कई अंडों को एक नमूने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, पांच 6-दिवसीय भ्रूण को एक नमूने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और दो 10-दिवसीय भ्रूण को एक नमूने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है)। कभी-कभी, क्षारीय लाइसिस विधि का उपयोग करके अंडे के जीनोमिक डीएनए को प्राप्त करना संभव नहीं होता है। वाणिज्यिक जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग अंडे से जीनोमिक डीएनए को अलग करने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में किया जा सकता है।
  3. लक्ष्य जीन टुकड़े (तालिका 2 और तालिका 3) को बढ़ाने के लिए पीसीआर टेम्पलेट के रूप में लाइसिस उत्पाद का 1 μL लें और अनुक्रमण के लिए पीसीआर उत्पादों को भेजें। प्रारंभिक मूल्यांकन करने के लिए जंगली-प्रकार अनुक्रम के साथ अनुक्रमण परिणामों की तुलना करें कि क्या CRISPR / Cas9 प्रणाली ने विवो (चित्रा 4 ए) में लक्ष्य जीन को छोड़ दिया है। शेष अंडों को इस शर्त पर बाद के विकास के लिए अनुमति दें कि भ्रूण के चरण में इंडेल का पता लगाया जाता है।
    नोट: इस तरह, भ्रूण चरण में उत्परिवर्तन दर का प्रारंभिक अनुमान लगाया जा सकता है। यदि इस चरण में कोई इंडेल नहीं मिलता है, तो लक्ष्य जीन के लिए कुछ नए एसजीआरएनए तैयार करें और चरण 2.1 से नॉक-आउट प्रोटोकॉल को दोहराएं।
  4. हैच की गई अप्सराओं को एक पालन पिंजरे में स्थानांतरित करें और उन्हें चरण 3.3 में वर्णित के रूप में कल्चर करें। जब अप्सराएं पांचवें इनस्टार चरण में विकसित हुईं, तो उन्हें प्लास्टिक कल्चर कप (1 अप्सरा / कप) से अलग करें।
    नोट: आमतौर पर अप्सराओं को अपने पांचवें इनस्टार तक विकसित होने में लगभग 25-35 दिन लगते हैं और सबसे स्पष्ट फेनोटाइप यह है कि विंग कलियां चौथे या पांचवें पेट के खंडों तक फैली हुई हैं। इसके अलावा, आगे के शोध में लक्ष्य जीन और फेनोटाइप के बीच संबंधों की भविष्यवाणी करने के लिए मृत अप्सराओं के फेनोटाइप को रिकॉर्ड करने की सिफारिश की जाती है।
  5. कैंची को विच्छेदित करके एंटीना की लगभग 2 मिमी लंबाई काट लें और क्षारीय लाइसिस विधि (चरण 4.2) का उपयोग करके इसे लाइज़ करें। जी0 उत्परिवर्ती (चित्रा 4 बी) की पहचान करने के लिए ऊपर वर्णित (चरण 4.3) के रूप में इन अप्सराओं के लक्ष्य जीन टुकड़े अनुक्रम का विश्लेषण करें।
    नोट: लाइसिस के लिए काटा गया एंटीना थोड़ा लंबा हो सकता है और एंटीना को पीसना या छोटा करना लाइसिस के लिए सहायक होता है, हालांकि एंटीना को सीधे पचाया जा सकता है। अनुक्रमण परिणाम में लक्ष्य स्थल के पास कई चोटियों वाले व्यक्तियों को सकारात्मक उत्परिवर्ती के रूप में पहचाना जाता है और बाद के विकास और संभोग के लिए अनुमति दी जाती है।

5. उत्परिवर्ती रेखाओं की स्थापना और पासिंग

  1. जी0 उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के टिड्डों का उपयोग करके क्रॉस प्रजनन करें (चित्रा 4 बी)। ओसिस्ट को इकट्ठा करें और इन ओसिस्ट को 30 डिग्री सेल्सियस पर अलग से इनक्यूबेट करें। चरण 4.2 और 4.3 में वर्णित उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रत्येक ओसिस्ट में 3-6 विकसित अंडे का उपयोग करें। बाद के विकास के लिए उत्परिवर्तन-सकारात्मक ओसिस्ट रखें और उत्परिवर्तन-नकारात्मक ओसिस्ट को छोड़ दें।
    नोट: भ्रूण के चरण में उत्परिवर्तन दर अनुमान जी1 उत्परिवर्ती की स्क्रीनिंग में बहुत तेजी ला सकता है। आमतौर पर, 3-6 विकसित अंडे को ऊपर वर्णित पीसीआर-मध्यस्थता जीनोटाइपिंग के लिए एक नमूने के रूप में मिलाया जा सकता है।
  2. चरण 4.4 में वर्णित जी1 अप्सराओं को पीछे करें। जी1 हेटरोजाइगोट का पता लगाने के लिए चरण 4.5 में वर्णित पीसीआर-आधारित जीनोटाइपिंग करने के लिए एंटीना की लगभग 2 मिमी लंबाई काट दें। उनके उत्परिवर्तन की पहचान करने के लिए निर्माता के निर्देशों (सामग्री की तालिका देखें) के अनुसार टीए-क्लोनिंग करें। जी2 अप्सराओं को प्राप्त करने के लिए समान उत्परिवर्तन के साथ जी1 हेटरोजाइगोट का उपयोग करके इन-क्रॉस प्रदर्शन करें।
    नोट: पीसीआर उत्पादों का सेंगर अनुक्रमण केवल हेटरोजाइगोट का पता लगाने के लिए जानकारी प्रदान कर सकता है, लेकिन सटीक उत्परिवर्तन की पहचान करने के लिए पर्याप्त जानकारी नहीं है। इस प्रकार, पीसीआर उत्पादों का उपयोग करके टीए क्लोनिंग को उत्परिवर्तन की स्पष्ट रूप से पहचान करने की आवश्यकता होती है और स्थिर उत्परिवर्ती लाइनों की स्थापना को बढ़ावा दे सकता है।
  3. जी2 अप्सराओं को उनके पांचवें इंस्टार तक उठाएं। चरण 5.2 में वर्णित पीसीआर-आधारित जीनोटाइपिंग का उपयोग होमोजीगोट्स और / या हेटरोजाइगोट की पहचान करने के लिए करें जो आगे के शोध और स्थिर पासिंग के लिए उपयुक्त हैं (चित्रा 4 बी)।
    नोट: होमोजीगोट्स और हेटरोजाइगोट के मिश्रण से बचने के लिए ध्यान दें। प्रत्येक आबादी की होमोजीगोसिटी और / या हेटरोजाइगोसिटी की पुष्टि करने के लिए हर पीढ़ी में पीसीआर-आधारित जीनोटाइपिंग करने की सिफारिश की जाती है। इस जांच के लिए उपयोग किए जाने वाले टिड्डियों की संख्या जनसंख्या के आकार पर निर्भर करती है। इसके अलावा, इन-क्रॉस रणनीति द्वारा टिड्डियों की आबादी का विस्तार किया जा सकता है।

6. अंडा क्रायोप्रिजर्वेशन और पुनर्जीवन

  1. अंडे को बाँझ पानी के साथ क्रायोसंरक्षित करने के लिए धोएं और उन्हें 5-6 दिनों के लिए ऊपर वर्णित (चरण 3.8) के रूप में एक कल्चर डिश में सेने दें। इन अंडों को कल्चर डिश में एक साथ इकट्ठा करें और उन्हें फिल्टर पेपर के टुकड़ों के साथ कवर करें। पैराफिन फिल्म के साथ पूरे संस्कृति पकवान को लपेटें।
  2. पकवान को 2 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें, इसके बाद अपेक्षाकृत कम तापमान (13-16 डिग्री सेल्सियस) पर एक और 2 दिन रखें। फिर, पकवान को 6 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में स्थानांतरित करें। अंडे के लिए नम वातावरण प्रदान करने के लिए हर 2 सप्ताह में इसमें पानी जोड़ें (चित्रा 5 ए)।
    नोट: भ्रूण को 30 डिग्री सेल्सियस26 पर 5-6 दिनों के लिए विकसित होने के बाद कैटाट्रेप्सिस चरण में होने का अनुमान लगाया जाता है। अंडे के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए ग्रेडिएंट कूलिंग सहायक है (तालिका 5)।
  3. क्रायोसंरक्षित अंडे को पुनर्जीवित करने के लिए, पेट्री डिश को रेफ्रिजरेटर से बाहर निकालें और इसे 2 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें। इन अंडों को 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में तब तक रखें जब तक कि अप्सराएं बाहर न निकल जाएं (चित्रा 5 बी)।
    नोट: क्रायोसंरक्षित अंडे को 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करने से पहले 25 डिग्री सेल्सियस पर रखना आवश्यक है। भ्रूण को कम से कम पांच महीने के लिए क्रायोसंरक्षित किया जा सकता है, हालांकि क्रायोप्रिजर्वेशन (तालिका 5) के कारण हैचिंग दर और एक्लोजन दर कम हो सकती है।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में सीएएस 9 प्रोटीन और इन विट्रो संश्लेषित एसजीआरएनए से युक्त आरएनपी के साथ प्रवासी टिड्डियों के होमोजीगस उत्परिवर्ती उत्पन्न करने के लिए विस्तृत चरण शामिल हैं। टिड्डियों में CRISPR / Cas9-मध्यस्थता लक्ष्य जीन नॉकआउट के कुछ प्रतिनिधि परिणाम निम्नलिखित हैं, जिनमें लक्ष्य चयन, एसजीआरएनए संश्लेषण और सत्यापन (चित्रा 1 ए), अंडा संग्रह और इंजेक्शन, उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग और पासिंग, क्रायोप्रिजर्वेशन और होमोजीगस अंडे का पुनर्जीवन शामिल है।

इस अध्ययन में, CRISPR / Cas9 प्रणाली के लिए लक्ष्य साइट का चयन तीन ऑनलाइन कार्यक्रमों (E-CRISP, CRISPOR, और ZiFit) के परिणामों के अनुसार किया जाता है और पहले एक्सॉन (चित्रा 1 बी) में स्थित होता है। इन विट्रो (तालिका 1) में कैस 9 दरार परख के अनुसार, CRISPR / Cas9 RNP पीसीआर टुकड़े (लक्ष्य साइट युक्त) को लगभग 55% की दरार दर के साथ पचा सकता है (चित्रा 1 सी)। फिर, इस आरएनपी को मानक माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम (चित्रा 2 और चित्रा 3) का उपयोग करके उनके एकल-कोशिका चरण में 120 निषेचित अंडों में माइक्रोइंजेक्ट किया गया था। भ्रूण चरण उत्परिवर्तन दर आकलन के लिए अनुक्रमण परिणामों ने लक्ष्य स्थल पर कुशल जीनोम संपादन का सुझाव दिया (चित्रा 4 ए)। इसके अलावा, इस अध्ययन के परिणामस्वरूप 52.73% अप्सरा सेने की दर थी और जी0 वयस्कों में से 66.7% मोज़ेक उत्परिवर्ती थे (तालिका 4)।

इसके अलावा, जी0 चिमेरा को जंगली प्रकार के टिड्डों के साथ पार किया गया ताकि विषम जी 1 व्यक्तियों को प्राप्त किया जा सके और जी2 जानवरों को उत्पन्न करने के लिए उसी उत्परिवर्तन (टीए-क्लोनिंग द्वारा जांच) के साथ जी1 हेटरोजाइगोट को पार किया गया। पीसीआर-आधारित फेनोटाइपिंग का उपयोग उत्परिवर्ती का पता लगाने के लिए किया गया था और प्राप्त होमोजीगोट्स को स्थिर उत्परिवर्ती लाइनों (चित्रा 4 बी) को स्थापित करने के लिए पार किया गया था।

इस बीच, होमोजीगोस की उपयोग दर में सुधार के लिए अतिरिक्त होमोजीगस अंडे को क्रायोसंरक्षित किया गया था। यद्यपि क्रायोप्रिजर्वेशन समय (तालिका 5) के विस्तार के साथ क्रायोसंरक्षित अंडे की सेने की दर कम हो गई थी, लेकिन अंडे को गीला रखने के लिए फिल्टर पेपर के टुकड़े लगाने और बढ़ते तापमान की ढाल के साथ इन संरक्षित अंडों को पुनर्प्राप्त करने सहित उपचारात्मक क्रियाएं पुनर्जीवन के लिए सहायक थीं (चित्रा 5 और तालिका 5)। अंत में, उत्परिवर्ती की होमोजीगस आबादी को बाद के शोध के लिए सफलतापूर्वक रखा गया था।

Figure 1
चित्रा 1: लक्ष्य का डिजाइन और एसजीआरएनए का इन विट्रो सत्यापन। (ए) विट्रो में लक्ष्य चयन, एसजीआरएनए संश्लेषण और जैव गतिविधि सत्यापन के लिए प्रवाह आरेख (टिड्डियों सहित लेकिन सीमित नहीं)। (बी) जीन संरचना और लक्ष्य स्थल का योजनाबद्ध आरेख। इस लक्ष्य जीन के एक्सॉन को नीले डोमेन के रूप में दिखाया गया है और लक्ष्य साइट को एक्सॉन 1 में स्टार्ट कोडन के डाउनस्ट्रीम में चुना गया था। लक्ष्य अनुक्रम लाल रंग में हाइलाइट किया गया है। (सी) इन विट्रो कैस 9 दरार परख के अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन परिणाम। लक्ष्य अनुक्रम (लंबाई में लगभग 400 बीपी) को आश्रय देने वाले एक डीएनए टुकड़े को प्रवर्धित किया गया और कैस 9 पाचन के लिए सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किया गया। अपेक्षित छोटे बैंड (लगभग 100 बीपी और 300 बीपी यहां; लाल त्रिकोण के साथ चिह्नित) ने सुझाव दिया कि संश्लेषित एसजीआरएनए प्रभावी कैस 9 दरार को प्रेरित कर सकता है। ग्रेस्केल विश्लेषण के अनुसार दरार दर लगभग 55% थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: टिड्डियों के अंडे के लिए सुई तैयार करना और माइक्रोइंजेक्शन पैड। (ए) टिड्डियों के अंडे के माइक्रोइंजेक्शन के लिए तैयार सुई की नोक। स्केल बार: 1 मिमी (बी) अंडे के साथ एक माइक्रोइंजेक्शन पैड की तस्वीर (लाल त्रिकोण के साथ इंगित) उस पर व्यवस्थित। स्केल बार 1 सेमी का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) माइक्रोइंजेक्शन पैड का आकार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: अंडे के माइक्रोइंजेक्शन । (ए) लाल बक्से के साथ लेबल किया गया एक प्रतिनिधि माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम जो माइक्रोस्कोप (मध्य) और माइक्रोमैनिपुलेटर (दाएं) को दर्शाता है जो माइक्रोइंजेक्टर (बाएं) से जुड़ा होता है। कंप्यूटर का उपयोग डेटा भंडारण और सहायक अवलोकन प्रदान करने के लिए किया जाता है। (बी) टिड्डी अंडे का इंजेक्शन। इंजेक्शन साइट को एक लाल त्रिकोण के साथ चिह्नित किया गया है। (ग) माइक्रोस्कोप के नीचे एक हैच की हुई अप्सरा। स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: जी 0 जानवरों के अनुक्रमण परिणाम और उत्परिवर्ती लाइनों की पासिंग रणनीति। (ए) विशिष्ट अनुक्रमण के परिणामस्वरूप जी0 स्क्रीनिंग होती है। लक्ष्य स्थल के पास कई चोटियों (जंगली-प्रकार के अनुक्रम में एक लाल आयत के साथ चिह्नित) ने संकेत दिया कि परीक्षण किए गए अंडे / टिड्डे को CRISPR / Cas9 प्रणाली (जैसा कि G 0-1 और G0-2 में दिखाया गया है) द्वारा सफलतापूर्वक संपादित किया गया था, जबकि अनुक्रमण परिणाम में किसी भी बदलाव के बिना व्यक्ति को संपादित नहीं माना गया था और परित्यक्त माना गया था (उदाहरण के लिए, जी0-3)। (बी) उत्परिवर्ती लाइनों की पासिंग रणनीति। जी0 जानवरों को पहले पीसीआर-मध्यस्थता जीनोटाइपिंग द्वारा जांच की गई थी और उनके अनुक्रमण परिणामों में कई चोटियों वाले लोगों को जी1 जानवरों को उत्पन्न करने के लिए जंगली प्रकार के टिड्डियों के साथ पार किया गया था। पीसीआर-मध्यस्थता जीनोटाइपिंग और टीए क्लोनिंग का उपयोग जी1 हेटरोजाइगोट की पहचान करने के लिए किया गया था। फिर, आगे के शोध और पासिंग के लिए जी2 जानवरों (होमोजीगोट्स और हेटरोजाइगोट्स) को उत्पन्न करने के लिए एक ही उत्परिवर्तन वाले हेटरोजाइगोट को पार किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: अंडा क्रायोप्रिजर्वेशन और पुनर्जीवन। (ए) क्रायोप्रिजर्वेशन की प्रक्रिया: अंडे की फली से अंडे को अलग करें और बाँझ पानी से धोने के बाद 5-6 दिनों के लिए उन्हें 30 डिग्री सेल्सियस पर सेएं। फिर, विकसित अंडे को पेट्री डिश में एक साथ इकट्ठा करें और उन्हें नम फिल्टर पेपर के छोटे स्क्रैप के साथ कवर करें। पूरे पेट्री डिश को पैराफिन फिल्म के साथ लपेटें और इसे 2 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें, इसके बाद अपेक्षाकृत कम तापमान (जैसे, 13-16 डिग्री सेल्सियस) पर एक और 2 दिन। (बी) पुनर्जीवन की प्रक्रिया: पेट्री व्यंजन ों को क्रायोसंरक्षित अंडे के साथ रेफ्रिजरेटर से बाहर निकालें और फिल्टर पेपर स्क्रैप को हटाने के बाद उन्हें 25 डिग्री सेल्सियस पर 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें। फिर, अंडों को 30 डिग्री सेल्सियस पर बाद के विकास के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है जब तक कि अप्सराएं बाहर न निकल जाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) वॉल्यूम (μL)
Cas9 प्रोटीन (300 ng / μL) 1
sgRNA (300 ng/μL) 1
पीसीआर उत्पाद (200 ng / μL) 1
10×NEBuffer r3.1 1
न्यूक्लियस मुक्त पानी 6

तालिका 1: इन विट्रो पाचन प्रणाली। संश्लेषित एसजीआरएनए की जैव-गतिविधि का परीक्षण करने के लिए सीआरआईएसपीआर/सीएएस 9 प्रणाली (प्रत्येक घटक का 300 एनजी) के साथ 200 एनजी शुद्ध लक्ष्य टुकड़ा (पीसीआर उत्पाद) मिलाया गया था। एक वाणिज्यिक बफर का उपयोग किया गया था और कुल मात्रा को 10 μL बनाने के लिए न्यूक्लियस-मुक्त पानी जोड़ा गया था।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) वॉल्यूम (μL)
2xEs Taq MasterMix 12.5
फॉरवर्ड प्राइमर 0.5
रिवर्स प्राइमर 0.5
टेम्पलेट (लाइसिस उत्पाद) 1
न्यूक्लियस मुक्त पानी 10.5

तालिका 2: लक्ष्य जीन टुकड़ा प्रवर्धन के लिए पीसीआर प्रणाली। लक्ष्य जीन के जीनोमिक टुकड़े को बढ़ाने के लिए, एक वाणिज्यिक टैक मिश्रण का उपयोग किया गया था और निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्राइमरों को जोड़ा गया था। लाइसिस उत्पाद के 1 μL का उपयोग टेम्पलेट के रूप में किया गया था और कुल मात्रा को 25 μL बनाने के लिए न्यूक्लियस-मुक्त पानी का उपयोग किया गया था।

तापमान (°C) समय चक्र
95 5 मिनट 1
95 30 s 35
55 30 s
72 40 s
72 10 मिनट 1

तालिका 3: लक्ष्य जीन प्रवर्धन के लिए पीसीआर कार्यक्रम। लक्ष्य जीन प्रवर्धन के लिए पीसीआर कार्यक्रम था: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 40 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।

आइटम डेटा
इंजेक्शन वाले अंडे की संख्या 120
परीक्षण किए गए भ्रूण 10
हैच की गई अप्सराओं की संख्या 58
हैचिंग दर 52.73%
जी0 वयस्क की संख्या 12
जी0 उत्परिवर्ती की संख्या 8
जी0 वयस्कों में उत्परिवर्तन दक्षता 66.67%

तालिका 4: संपादन दक्षता का सारांश। लक्षित जीन को बाहर निकालने के लिए 120 अंडे इंजेक्ट किए गए थे और भ्रूण चरण के दौरान परीक्षण के लिए 10 अंडे लिए गए थे। शेष भ्रूणों से 58 अप्सराएं निकलीं (हैचिंग दर 52.73% थी)। अंत में, 12 जी0 टिड्डियां वयस्क अवस्था में विकसित हुईं और उनमें से 8 को लक्ष्य स्थल पर सफलतापूर्वक संपादित किया गया। जी0 वयस्कों में उत्परिवर्तन दर 66.67% थी।

नियंत्रण समूह समूह 1 समूह 2 समूह 3 समूह 4
अंडे की संख्या 120 120 120 120 120
भंडारण के लिए तापमान उपचार 30 °C 30 °C (5-6 d)→6 °C 30 डिग्री सेल्सियस (5-6 डी)→25 डिग्री सेल्सियस (2 डी)→13-16 डिग्री सेल्सियस (2 डी)→6 डिग्री सेल्सियस 30 डिग्री सेल्सियस (5-6 डी)→25 डिग्री सेल्सियस (2 डी)→13-16 डिग्री सेल्सियस (2 डी)→6 डिग्री सेल्सियस 30 डिग्री सेल्सियस (5-6 डी)→25 डिग्री सेल्सियस (2 डी)→13-16 डिग्री सेल्सियस (2 डी)→6 डिग्री सेल्सियस
भंडारण समय 14 दिन 14 दिन 1 महीना 3 महीने 5 महीने
पुनर्जीवन के लिए तापमान उपचार 30 °C 6 °C→30 °C 6 °C→25°C (2 d)→30 °C 6 °C→25°C (2 d)→30 °C 6 °C→25°C (2 d)→30 °C
हैच किए गए टिड्डियों की संख्या 108 0 96 86 78
हैचिंग दर 90.00% 0 80.00% 71.67% 65.00%
वयस्क टिड्डियों की संख्या 81 0 60 46 31
एक्लोजन दर 75.00% 0 62.50% 53.49% 39.74%

तालिका 5: अंडे के क्रायोप्रिजर्वेशन और पुनर्जीवन का सारांश। क्रायोप्रिजर्वेशन और पुनर्जीवन अध्ययन के लिए 600 अंडों को पांच समूहों में विभाजित किया गया था। 120 अंडों के पहले समूह (नियंत्रण) को हमेशा 30 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जाता था और 14 दिनों तक संग्रहीत किया जाता था। 120 अंडों के दूसरे समूह (समूह 1) को 5-6 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के बाद एक रेफ्रिजरेटर में स्थानांतरित किया गया और 14 दिनों के लिए 6 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। फिर, इन अंडों को पुनर्जीवन के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित किया गया। अन्य समूहों (समूह 2, समूह 3, और समूह 4, प्रत्येक समूह में 120 अंडे थे) ने प्रोटोकॉल (चरण 6.1-6.3) में वर्णित एक ढाल शीतलन और पुनर्प्राप्त तापमान उपचार का अनुभव किया, जिसमें एक अलग भंडारण समय (समूह 2 के लिए 1 महीने, समूह 3 के लिए 3 महीने और समूह 4 के लिए 5 महीने) था। अंत में, 108 अप्सराएं नियंत्रण समूह (90% की हैचिंग दर पर) से निकलीं और उनमें से 81 वयस्क चरण (इक्लोशन दर का 75%) में विकसित हुईं। दूसरे समूह (समूह 1) में कोई टिड्डे नहीं निकले। नियंत्रण समूह की तुलना में अन्य समूहों की हैचिंग दर और उत्सर्जन दर कम थी और भंडारण समय के साथ गिरावट आई। समूह 2 में 96 अप्सराएं निकलीं और उनमें से 60 वयस्क अवस्था में विकसित हुईं। समूह 3 में 86 अप्सराएं निकलीं और उनमें से 46 वयस्क अवस्था में विकसित हुईं। समूह 4 में, 78 अप्सराएं निकलीं और उनमें से 31 वयस्क अवस्था में विकसित हुईं।

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Discussion

टिड्डे मनुष्य की सभ्यता के बाद से कृषि के लिए सबसे विनाशकारी कीटों में से एक रहेहैं। CRISPR/Cas9-आधारित जीनोम संपादन तकनीक टिड्डियों में जैविक तंत्र के बेहतर ज्ञान के साथ-साथ एक आशाजनक कीट नियंत्रण रणनीति प्रदान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इस प्रकार, होमोजीगस टिड्डी उत्परिवर्ती के CRISPR / Cas9-मध्यस्थता निर्माण की एक कुशल और उपयोग में आसान विधि विकसित करने के लिए बहुत लाभ है। यद्यपि कुछ महान कार्यों की सूचना दी गई है और टिड्डियों 18,20,21,22 में जीनोम संपादन के लिए कुछ बुनियादी वर्कफ़्लो प्रदान किए गए हैं, लेकिन पूरी प्रक्रिया के एक व्यवस्थित अनुकूलन का अभी भी अभाव है। सामान्य तौर पर, सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 प्रणाली के भ्रूण इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न होमोजीगस टिड्डी उत्परिवर्ती को तीन प्रमुख चरणों में विभाजित किया जा सकता है: ए) एसजीआरएनए डिजाइन, संश्लेषण और विट्रो में स्क्रीनिंग, बी) अंडा संग्रह, तैयारी और इंजेक्शन; और सी) उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग और होमोजाइट रखरखाव। यह प्रोटोकॉल एक अनुकूलित वर्कफ़्लो प्रदान करता है और लक्ष्य साइट चयन, इन विट्रो एसजीआरएनए स्क्रीनिंग, अंडों के माइक्रोइंजेक्शन के साथ-साथ उत्परिवर्ती का पता लगाने के चरण विशेष रूप से CRISPR / Cas9 प्रणाली के साथ होमोजीगस उत्परिवर्ती टिड्डियों को प्रभावी ढंग से उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

सबसे पहले, लक्ष्य साइट, संबंधित एसजीआरएनए का रूप, और एसजीआरएनए की एकाग्रता को कीड़े 18,27,28 में जीनोम संपादन दक्षता के महत्वपूर्ण कारकों के रूप में सुझाया गया है। इस समस्या को हल करने के लिए, पहले जीन संरचना का विश्लेषण करने और ऑनलाइन संसाधनों का उपयोग करके एक्सॉन 1 पर या स्टार्ट कोडन के पास एक से अधिक लक्ष्य साइट डिजाइन करने की सिफारिश की जाती है। फिर, विट्रो में एसजीआरएनए को संश्लेषित करें और आरएनपी की काटने की दक्षता को अनुकूलित करने के लिए इसे विभिन्न सांद्रता में कैस 9 प्रोटीन के साथ मिलाएं। यह प्रक्रिया उच्च बायोएक्टिविटी के साथ एसजीआरएनए की पहचान करने और उम्मीदवार लक्ष्य जीन के लिए आरएनपी कॉम्प्लेक्स की संरचना को अनुकूलित करने में मदद करेगी।

दूसरे, सीमित समय में जितना संभव हो उतने ताजे अंडे इकट्ठा करना और हैचिंग दर के साथ-साथ उत्परिवर्तन दर में सुधार करना भी जीनोम संपादन कार्यों के लिए बड़ी चुनौतियां हैं। 16 (प्रकाश): 8 (अंधेरे) फोटोपीरियड की स्थिति में पाले गए ग्रेगेरियस वयस्क टिड्डों का उपयोग 9:00-11:00 बजे के दौरान छोटी अवधि में पर्याप्त अंडे एकत्र करने के लिए किया जाता है। फली से अंडों को सावधानीपूर्वक अलग करने के लिए पेंटब्रश या चिमटी का उपयोग करके अंडे के बीच धीरे से नीचे की ओर दबाव डालना महत्वपूर्ण है। पर्याप्त अभ्यास के साथ, कई उपयोगकर्ता मज़बूती से फली से अलग-अलग अंडे अलग कर सकते हैं। प्रत्येक अंडे को अलग करने और बाँझ पानी से धोने के बाद, अंडे को माइक्रोइंजेक्शन के दौरान अंडे को स्थिर करने के लिए डिज़ाइन किए गए इंजेक्शन पैड (चित्रा 2 बी, सी) पर संरेखित किया जाता है। अंडे को माइक्रोपाइल्स के पास अनुकूलित आरएनपी के साथ इंजेक्ट किया जाता है। यांत्रिक क्षति को सीमित करने और अंडे के प्रदूषण को कम करने के लिए, ताजे अंडे को लगभग 30 मिनट तक फली में रहने की अनुमति दी जाती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अंडे की टैनिंग माइक्रोइंजेक्शन21 के लिए आदर्श है, इसकी संघनित संरचना और29,30 के बाद आक्रमण पर उच्च रक्षा क्षमता के कारण। इस बीच, एक प्रकाशित रिपोर्ट ने संकेत दिया कि टिड्डियों के अंडे का सिंकेटियल डिवीजन31 बिछाने के बाद 0 घंटे और 4 घंटे के बीच किसी बिंदु पर होता है। वर्तमान मानक माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल के साथ, लगभग 100 अंडे का इंजेक्शन 40 मिनट के भीतर पूरा किया जा सकता है। एक साथ लिया गया, 100 निषेचित अंडे की टैनिंग और माइक्रोइंजेक्शन की प्रक्रिया 2 घंटे के भीतर पूरी की जा सकती है। इस प्रकार, सीआरआईएसआरपी / सीएएस 9-मध्यस्थता दरार और इंजेक्शन अंडे और भविष्य के वयस्क टिड्डियों में कुशल उत्परिवर्तन प्राप्त करने के लिए लक्ष्य जीन की मरम्मत के लिए कम से कम 2 घंटे बचे हैं।

अंत में, अधिकांश उत्परिवर्ती जानवरों में होमोजीगोट्स उत्पन्न करने के लिए पासिंग और उत्परिवर्ती पहचान के लिए प्रभावी रणनीतियां महत्वपूर्ण हैं। टिड्डियों में, उन जीनों के लिए जो संपादन के बाद गैर-घातक होते हैं, यहां सुझाई गई क्रॉस रणनीति यह है कि जी0 उत्परिवर्ती व्यापक प्रकार के टिड्डियों के साथ पार करते हैं और अगली पीढ़ी में होमोजीगस उत्परिवर्ती उत्पन्न करने के लिए उसी उत्परिवर्तन के साथ जी1 हेटरोजाइगोट का उपयोग करके आगे इन-क्रॉस किया जा सकता है। उत्परिवर्ती विरासत प्रक्रिया के दौरान प्रत्येक टिड्डे में उत्परिवर्तन को सत्यापित करने के लिए, पीसीआर-आधारित जीनोटाइपिंग के लिए टेम्पलेट के रूप में एंटीना के एक छोटे खंड को पचाने के लिए क्षारीय लाइसिस विधि का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। अंत में, जनसंख्या का विस्तार करने के लिए आगे इन-क्रॉस के लिए प्राप्त होमोजीगस वयस्कों का उपयोग करें। होमोजीगस टिड्डियों के बीच जनसंख्या के आकार और विकास चरण के अंतर से सीमित, अतिरिक्त अंडे को 6 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोप्रिजर्वेशन और ढाल तापमान वृद्धि (चित्रा 5) द्वारा पुनर्जीवन के लिए अनुशंसित किया जाता है, जो प्रवासी टिड्डियों के अंडे32,33 के कम तापमान डायपॉज और उच्च तापमान डायपॉज रिलीज के सिद्धांत पर आधारित है।

संक्षेप में, CRISPR / Cas9 प्रणाली प्रवासी टिड्डियों के कार्यात्मक जीनोमिक्स के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण साबित हुई है। इस विस्तृत प्रोटोकॉल का उपयोग प्रवासी टिड्डियों के साथ-साथ अन्य कीड़ों में CRISPR / Cas9 आधारित जीन संपादन अनुप्रयोगों के लिए एक संदर्भ के रूप में किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (32070502, 31601697, 32072419 और चीन पोस्टडॉक्टरल साइंस फाउंडेशन (2020 एम 672205) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10×NEBuffer r3.1 New England Biolabs B7030S The buffer of  in vitro Cas9 cleavage assays
2xEs Taq MasterMix (Dye) Cwbio CW0690 For gene amplification
2xPfu MasterMix (Dye) Cwbio CW0686 For gene amplification
CHOPCHOP Online website for designing sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/.
CRISPOR Online website for designing sgRNAs, http://crispor.org.
CRISPRdirect Online website for designing sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/.
Electrophoresis power supply LIUYI BIOLOGY DYY-6D Separation of nucleic acid molecules of different sizes
Eppendorf Tube Eppendorf 30125177 For sample collection, etc.
Fine brushes Annigoni 1235 For cleaning and isolating eggs. Purchased online.
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument P97 For making the microinjection needles
Gel Extraction Kit Cwbio CW2302 DNA recovery and purification
Gel Imaging Analysis System OLYMPUS Gel Doc XR Observe the electrophoresis results
GeneTouch Plus Bioer B-48DA For gene amplification
Glass electrode capillary Gairdner GD-102 For making injection needles with a micropipette Puller
Incubator MEMMERT INplus55 For migratory locust embryo culture
Metal bath TIANGEN AJ-800 For heating the sample
Micro autoinjector Eppendorf 5253000068 Microinjection of embryos early in development
Micro centrifuge Allsheng MTV-1 Used for mixing reagents
Microgrinder NARISHIGE EG-401 To ground the tip of injection needle
Microloader Eppendorf 5242956003 For loading solutions into the injection needles.
Micromanipulation system Eppendorf TransferMan 4r An altinative manipulation system for microinjection
Microscope cnoptec SZ780 For microinjection
Motor-drive Manipulator NARISHIGE MM-94 For controling the position of the micropipette during the microinjection precedure
Multi-Sample Tissue Grinder jingxin Tissuelyser-64 Grind and homogenize the eggs
ovipisition pot ChangShengYuanYi CS-11 Filled with wet sterile sand for locust ovipositing in it. The oocysts are collected from this container. Purchased online.
Parafilm ParafilmM PM996 For wrapping the petri dishes.
pEASY-T3 Cloning Kit TransGen Biotech CT301-01 For TA cloning
Petri dish NEST 752001 For culture and preservation of  the eggs.
Pipettor Eppendorf Research plus For sample loading
plastic culture cup For rearing locusts seperately and any plastic cup big enough (not less than 1000 mL in volume) will do. Purchased online.
Precision gRNA Synthesis Kit Thermo A29377 For sgRNA synthesis
Primer Premier PREMIER Biosoft Primer Premier 5.00 For primer design
SnapGene Insightful Science SnapGene®4.2.4 For analyzing  sequences
Steel balls HuaXinGangQiu HXGQ60 For sample grinding.Purchased online.
Tips bioleaf D781349 For sample loading
Trans DNA Marker II TransGen Biotech BM411-01 Used to determine gene size
TrueCut Cas9 Protein v2 Thermo A36496 Cas9 protein
UniversalGen DNA Kit Cwbio CWY004 For genomic DNA extraction
VANNAS Scissors Electron Microscopy Sciences 72932-01 For cutting off the antennae
Wheat To generate wheat seedlings as the food for locusts. Bought from local farmers.
ZiFiT Online website for designing sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doudna, J. A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).
  2. van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechnology. 38 (7), 845-855 (2020).
  3. McCarty, N. S., Graham, A. E., Studena, L., Ledesma-Amaro, R. Multiplexed CRISPR technologies for gene editing and transcriptional regulation. Nature Communications. 11 (1), 1281 (2020).
  4. Manghwar, H., et al. CRISPR/Cas systems in genome editing: Methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects. Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).
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वापसी अंक 181 होमोजीगस उत्परिवर्ती प्रवासी टिड्डे सीआरआईएसपीआर / कैस 9 जीनोम संपादन माइक्रोइंजेक्शन अंडा क्रायोप्रिजर्वेशन और पुनर्जीवन।
CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी का उपयोग करके प्रवासी टिड्डियों के होमोजीगस उत्परिवर्ती का निर्माण
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Yan, Q., He, Y., Yue, Y., Jie, L., Wen, T., Zhao, Y., Zhang, M., Zhang, T. Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology. J. Vis. Exp. (181), e63629, doi:10.3791/63629 (2022).

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