Summary
Denne studien gir en systematisk optimalisert prosedyre for CRISPR/Cas9 ribonukleasebasert konstruksjon av homozygote gresshoppemutanter, samt en detaljert metode for kryopreservering og gjenoppliving av gresshoppeeggene.
Abstract
Den trekkende gresshoppen, Locusta migratoria, er ikke bare en av de verdensomspennende pestgresshoppene som forårsaket store økonomiske tap for mennesker, men også en viktig forskningsmodell for insektmetamorfose. CRISPR / Cas9-systemet kan nøyaktig lokalisere på et spesifikt DNA-lokus og spalte innenfor målstedet, og effektivt introdusere dobbeltstrengbrudd for å indusere målgenknockout eller integrere nye genfragmenter i det spesifikke stedet. CRISPR / Cas9-mediert genomredigering er et kraftig verktøy for å ta opp spørsmål som oppstår i gresshoppeforskning, samt en lovende teknologi for gresshoppekontroll. Denne studien gir en systematisk protokoll for CRISPR / Cas9-mediert genknockout med komplekset av Cas9-protein og enkeltveilednings-RNA (sgRNA) i migrerende gresshopper. Valg av målsteder og design av sgRNA er beskrevet i detalj, etterfulgt av in vitro-syntese og verifisering av sgRNAene. Påfølgende prosedyrer inkluderer eggflåteoppsamling og separasjon av garveegg for å oppnå vellykket mikroinjeksjon med lav dødelighet, eggkultur, foreløpig estimering av mutasjonsraten, gresshoppeavl samt deteksjon, bevaring og passasje av mutantene for å sikre populasjonsstabilitet av de redigerte gresshoppene. Denne metoden kan brukes som referanse for CRISPR/Cas9-baserte genredigeringsapplikasjoner i trekkende gresshopper så vel som i andre insekter.
Introduction
Genredigeringsteknologier kan brukes til å introdusere innsettinger eller slettinger i et spesifikt genomlokus for kunstig å modifisere målgenet på formål1. I de siste årene har CRISPR / Cas9-teknologien utviklet seg raskt og har et økende anvendelsesområde innen ulike felt innen biovitenskap 2,3,4,5,6. CRISPR/Cas9-systemet ble oppdaget tilbake i 19877, og utbredt i bakterier og archaea. Videre forskning indikerte at det var et prokaryot adaptivt immunsystem som er avhengig av RNA-styrt nuklease Cas9 for å bekjempe fager8. Det kunstig modifiserte CRISPR/Cas9-systemet består hovedsakelig av to komponenter, et enkelt RNA (sgRNA) og Cas9-proteinet. SgRNA består av et CRISPR RNA (crRNA) komplementært til målsekvensen og et hjelpetransaktiverende crRNA (tracrRNA), som er relativt konservert. Når CRISPR / Cas9-systemet er aktivert, danner sgRNA et ribonukleoprotein (RNP) med Cas9-proteinet og leder Cas9 til målstedet via baseparingen av RNA-DNA-interaksjoner. Deretter kan dobbeltstrenget DNA spaltes av Cas9-proteinet, og som et resultat oppstår dobbeltstrengsbruddet (DSB) nær protospacer-tilstøtende motiv (PAM) på målstedet 9,10,11,12. For å redusere skaden forårsaket av DSB-ene, ville cellene aktivere omfattende DNA-skaderesponser for effektivt å oppdage genomiske skader og starte reparasjonsprosedyren. Det er to forskjellige reparasjonsmekanismer i cellen: ikke-homolog endekobling (NHEJ) og homologirettet reparasjon (HDR). NHEJ er den vanligste reparasjonsveien som kan reparere DNA-dobbeltstrengbrudd raskt og forhindrer celleapoptose. Det er imidlertid feilutsatt på grunn av å etterlate små fragmenter av innsettinger og slettinger (indels) i nærheten av DSB-ene, noe som vanligvis resulterer i et åpent leserammeskifte og dermed kan føre til genutslag. I motsetning til dette er homolog reparasjon ganske sjelden. Under forutsetning av at det finnes en reparasjonsmal med sekvenser som er homologe med DSBs kontekst, vil cellene av og til reparere genombruddet i henhold til den nærliggende malen. Resultatet av HDR er at DSB er nøyaktig reparert. Spesielt hvis det er en ekstra sekvens mellom de homologe sekvensene i malen, vil de bli integrert i genomet gjennom HDR, og på denne måten kan de spesifikke geninnsettingene realiseres13.
Med optimalisering og utvikling av sgRNA-strukturer og Cas9-proteinvarianter, har det CRISPR / Cas9-baserte genetiske redigeringssystemet også blitt brukt med suksess i forskning på insekter, inkludert men ikke begrenset til Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella og Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. Så vidt forfatterne vet, selv om RNP-er bestående av Cas9-proteinet og in vitro-transkribert sgRNA har blitt brukt til redigering av gresshoppegenom20,21,22, mangler det fortsatt en systematisk og detaljert protokoll for CRISPR/Cas9 ribonukleasemediert konstruksjon av homozygote mutanter i den migrerende gresshoppen.
Den migrerende gresshoppen er et viktig landbruksskadegjører som har en global distribusjon og utgjør betydelige trusler mot matproduksjonen, og er spesielt skadelig for gramineøse planter, som hvete, mais, ris og hirse23. Genfunksjonsanalyse basert på genomredigeringsteknologier kan gi nye mål og nye strategier for kontroll av migrerende gresshopper. Denne studien foreslår en detaljert metode for å slå ut migrerende gresshoppegener via CRISPR / Cas9-systemet, inkludert valg av målsteder og design av sgRNAer, in vitro-syntese og verifisering av sgRNAer, mikroinjeksjon og kultur av egg, estimering av mutasjonshastighet på embryonale stadium, påvisning av mutanter samt passasje og bevaring av mutantene. Denne protokollen kan brukes som en basal referanse for manipulering av de aller fleste gresshoppegener og kan gi verdifulle referanser for genomredigering av andre insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Valg av målsted og sgRNA-design
- Samle så mye sekvensinformasjon som mulig for genet av interesse gjennom litteraturforskning og / eller søk etter mRNA eller kodende DNA-sekvens (CDS) av genet ved NCBI og gresshoppedatabase24.
- Sammenlign sekvensen av det interesserte genet med dets genomiske DNA-sekvens for å skille ekson- og intronområdene.
- Velg en kandidatregion for utforming av målområde basert på forskningsformålet. Design primerpar for å forsterke kandidatregionfragmentet og verifisere villtypesekvensen ved sekvenseringsanalyse av PCR-produktet.
MERK: Det finnes ulike strategier for valg av kandidatmålregion. For eksempel, i de fleste gen-/proteinfunksjonsforskninger, bruk eksonfragmentet nær startkodonet som kandidatregion for å sikre at hele proteinet / RNA-funksjonen går tapt etter genomredigeringen (dvs. genknock-out). Mens for funksjonsanalysen av et bestemt domene, velg kandidatregionen i begynnelsen (eller begge ender) av domenet. - Bruk nettressurser som E-CRISP Design25 til å søke etter potensielle målnettsteder i kandidatmålområdet.
- Velg "Drosophila melanogaster BDGP6" (eller et hvilket som helst annet insekt) i rullegardinlisten over referansegenomer og velg "Input is FASTA sequence" etterfulgt av å lime inn sekvensen av målområdet i tekstboksen (i FASTA-format).
- Start applikasjonen ved å trykke "Start sgRNA-søk" med "medium" og "single design" for å få de mulige målstedene. Velg 1-3 potensielle mål fra resultatene basert på deres forventede poengsum og utform de tilsvarende sgRNAene deretter.
MERK: Det er mange flere online plattformer for CRISPR-design, for eksempel CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT og så videre (se materialfortegnelse). Noen av dem har funksjonen til spesifisitetskontroll for arten hvis genomiske sekvensdata er i databasene deres. Den genomiske sekvensen av gresshopper har imidlertid ikke blitt funnet på noe nettsted på nettet. Det er bedre å bruke mer enn ett online verktøy for CRISPR-design i gresshopper. Omfattende, vurder resultatene fra forskjellige nettsteder og velg sgRNA fra resultatene på prinsippet om høyeste spesifisitet, høyeste effektivitet og minst mismatchrate (figur 1A, B).
2. Syntese og verifisering av sgRNA in vitro
- Syntetiser sgRNA ved hjelp av sgRNA-syntesesett i henhold til produsentens håndbok (materialfortegnelse). Denne prosedyren inkluderer vanligvis tre trinn: DNA-malamplifisering, in vitro-transkripsjon og sgRNA-rensing21. Fortynn det syntetiserte sgRNA med nukleasefritt vann til en lagringskonsentrasjon på 300 ng / μL for videre bruk.
- Forsterke og rense målgenfragmentet for å tjene som substrat for in vitro-spaltningsanalysen av CRISPR/Cas9-systemet. Utfør disse trinnene i henhold til produsentens instruksjoner.
- Fortynn det kjøpte Cas9-proteinet til 300 ng / μL med nukleasefritt vann. Inkuber 1 μL sgRNA (300 ng / μL) og 1 μL Cas9-protein (300 ng / μL) med 200 ng renset målfragment i spaltningsbufferen ved 37 ° C i 1 time (10 μL av totalt volum; se tabell 1). Beregn effektiviteten av sgRNA-indusert Cas9-spaltning ved agarosegelelektroforese (figur 1C). Velg sgRNA med høy aktivitet for følgende mikroinjeksjon.
MERK: Resultatene av agarosegelelektroforese kan konverteres til gråtonebilder med bildebehandlingsprogramvare, og spaltningseffektiviteten estimeres i henhold til gråtonene til båndene med spekulerte størrelser.
3. Mikroinjeksjon og dyrkning av eggene
- Klargjør kanylene ved å trekke i glasskapillærene med en mikropipettetrekker (materialfortegnelse). Still inn parametrene som følger: Varm til 588, Trekk til 90, Hastighet til 60 og Tid til 40. Slip spissen av kanylen med en mikrokvern (materialfortegnelse).
MERK: Ideelle nålespisser er åpne og skarpkantede (figur 2A). Det anbefales sterkt å forberede flere nåler for forsøkene fordi nåler noen ganger er blokkert eller ved et uhell ødelagt under injeksjoner. - Bland 1 μL Cas9-protein (300 ng / μL) med 1 μL av det verifiserte sgRNA (300 ng / μL) sammen for å oppnå RNPene til injeksjon. Tilsett 8 μL RNasefritt sterilt vann for å gjøre det endelige volumet av blandingen til 10 μL. Bland løsningen grundig og hold den på is.
MERK: De endelige konsentrasjonene av Cas9-proteinet og sgRNA kan optimaliseres i henhold til redigeringsresultatene. Unngå gjentatt frysing og tining av den tilberedte RNP-oppløsningen, og umiddelbar bruk anbefales. - Bak de mannlige og kvinnelige voksne gresshoppene sammen ved 30 ° C med en 16 (lys):8 (mørk) fotoperiode og gi dem tilstrekkelig ferske hveteplanter som mat. Observer disse gresshoppene daglig og legg en oviposisjonspotte (en plastblomsterpotte eller kopp fylt med våt steril sand) inn i oppdrettsburet for oviposisjon når gresshoppene parret seg.
MERK: Vanligvis er 100 par voksne gresshopper oppdrettet i et oppdrettsbur (40 cm x 40 cm x 40 cm) nok til å generere egg for å slå ut et enkelt gen. Dyrk flere gresshoppepar hvis det er behov for flere egg. - Samle de nylagte eggbelgene fra oviposisjonspotten og vent i ca 30 min for egggarging. Isoler eggene forsiktig fra eggbelgene i vann med en fin børste og vask dem med sterilt vann tre ganger. Oppbevar eggene i en petriskål og tilsett sterilt vann for å holde dem fuktige.
MERK: Soling av de nylagte eggene kan forbedre mutanteffektiviteten betydelig21. - Fyll en injeksjonsnål med den klargjorte RNP-løsningen og legg den på mikromanipulatoren (materialfortegnelse).
- Still inn mikroinjeksjonsparametrene som følger: 300 hPa av injeksjonstrykket (pi), 0,5 s av injeksjonstiden (ti) og 25 hPa av kompensasjonstrykket (pc).
- Trykk på pedalen for å evaluere volumet på den injiserte oppløsningen. Juster injeksjonstrykket og injeksjonstiden for å sikre at injeksjonsvolumet er ca. 50-100 nl.
MERK: Fjern restluften i nålen for å gjøre injeksjonsoppløsningen kontinuerlig og kontrollerbar så mye som mulig. Tilkoblingen av nålen og mikromanipulatoren må være tett.
- Ordne de sterile eggene regelmessig på injeksjonsputen (figur 2B,C) og plasser puten på objektbordet i mikroskopet (figur 3A). Juster forstørrelsen av mikroskopet til eggene blir observert. Juster mikroinjeksjonsnålen under mikroskopet til injeksjonsspissen kan sees, og plasser den nær egget som skal injiseres.
- Start injeksjonen i passende høyde og en vinkel på 30-45 grader. Sett spissen forsiktig inn i egget nær eggets mikropyler (figur 3B) og trykk på pedalen for å fullføre injeksjonen. Trekk nålen raskt inn og flytt injeksjonsbesetningen for injeksjon av neste egg.
MERK: En liten utvidelse av egget under mikroinjeksjonen bør observeres. En liten mengde cytoplasmatisk lekkasje ved pinhole er akseptabelt. Erstatt injeksjonskanylen med en ny eller juster injeksjonsvinkelen hvis væskeutstrømningen er for stor. - Overfør de injiserte eggene til en kulturskål (en petriskål med et stykke fuktig filterpapir), og legg dem i en inkubator ved 30 °C.
MERK: Det vil ta omtrent 13-14 dager før nymfene klekkes fra disse injiserte eggene (under forutsetning av at mutasjon av målgenet ikke påvirker embryoenes utvikling) (figur 3C). Injiser minst 100 egg for å sikre en tilstrekkelig klekke- og eklosjonsmengde for å slå ut et bestemt gen.
4. Estimering av mutasjonshastighet og screening av mutanter
- Kontroller utviklingen av de injiserte eggene hver dag etter injeksjonen. Overfør injiserte egg til en ny kulturrett hver 24. time de første 5 dagene.
- På den 6. dagen ( eller senere) etter injeksjon, tilfeldig plukke og overføre 10 egg i et rør og tilstrekkelig male eggene med to stålkuler ved 60 Hz i 6 minutter ved hjelp av en kvern (se materialtabell). Suspender ruskene med 1 ml PBS. Overfør 5 μL av blandingen til 45 μL 50 mM NaOH og lys ved 95 °C i 5 minutter. Tilsett 5 μL av 1 M Tris-HCl (pH = 8,0) i lysissystemet for å avslutte den alkaliske lysereaksjonen.
MERK: Egg kan plukkes ut for alkalisk lyse på en hvilken som helst dag etter siste overføring, og flere egg kan brukes som en prøve avhengig av deres utviklingssituasjon (f.eks. Fem 6 dager gamle embryoer kan brukes som en prøve, og to 10 dager gamle embryoer kan brukes som en prøve). Noen ganger er det ikke mulig å få genomisk DNA av egg ved hjelp av alkalisk lysemetode. Kommersielle genomiske DNA-ekstraksjonssett kan brukes som en alternativ metode for å isolere genomisk DNA fra eggene. - Ta 1 μL av lysisproduktet som PCR-mal for å amplifisere målgenfragmentet (tabell 2 og tabell 3) og send PCR-produktene til sekvensering. Sammenlign sekvenseringsresultatene med villtypesekvensen for å foreløpig evaluere om CRISPR/Cas9-systemet spaltet målgenet in vivo (figur 4A). Tillat resten av eggene for etterfølgende utvikling under forutsetning av at indels oppdages på embryonale stadium.
MERK: På denne måten kan mutasjonshastigheten foreløpig estimeres på embryostadiet. Hvis ingen indels blir funnet på dette trinnet, klargjør noen nye sgRNA for målgenet og gjenta utslagsprotokollen fra trinn 2.1. - Overfør de klekkede nymfene til et oppdrettsbur og dyrk dem som beskrevet i trinn 3.3. Når nymfene utviklet seg til det femte stjernestadiet, skiller du dem med plastkulturkopper (1 nymfe/kopp).
MERK: Det tar vanligvis omtrent 25-35 dager for nymfene å utvikle seg til sin femte stjerne, og den mest åpenbare fenotypen er at vingeknoppene strekker seg til fjerde eller femte abdominale segmenter. Videre anbefales det å registrere fenotypene til døde nymfer for å forutsi forholdet mellom målgenet og fenotyper i videre forskning. - Klipp av antennenes lengde på ca. 2 mm med dissekerende saks og lys den med alkalisk lysemetode (trinn 4.2). Analyser målgenfragmentsekvensen til disse nymfene som beskrevet ovenfor (trinn 4.3) for å identifisere G 0-mutantene (figur 4B).
MERK: Antennene som er kuttet for lysis kan være litt lengre, og sliping eller hakking av antennene er nyttig for lysis, selv om antennene kan fordøyes direkte. Personer med flere topper nær målstedet i sekvenseringsresultatet identifiseres som positive mutanter og tillates for etterfølgende utvikling og parring.
5. Etablering og passering av mutantlinjer
- Utfør kryssavl ved hjelp av G 0-mutanter og villtypegresshopper (figur 4B). Samle oocystene og inkuber disse oocystene separat ved 30 °C. Bruk 3-6 utviklede egg i hver oocyst for å oppdage mutasjoner som beskrevet i trinn 4.2 og 4.3. Hold mutasjonspositive oocyst for den etterfølgende utviklingen og forlat de mutasjonsnegative oocytter.
MERK: Mutasjonshastighetsestimering på embryonale stadium kan i stor grad akselerere screeningen av G1 mutanter. Vanligvis kan 3-6 utviklede egg blandes som en prøve for PCR-mediert genotyping som beskrevet ovenfor. - Bak G 1-nymfene som beskrevet i trinn 4.4. Klipp av ca. 2 mm antennelengde for å utføre PCR-basert genotyping som beskrevet i trinn 4.5 for påvisning av G1 heterozygoter. Utfør TA-kloning i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse) for å identifisere mutasjonene. Utfør in-cross ved hjelp av G1 heterozygoter med de samme mutasjonene for å oppnå G2 nymfer.
MERK: Sanger-sekvensering av PCR-produktene kan bare gi informasjon for å finne ut heterozygotene, men ikke nok informasjon til å identifisere de eksakte mutasjonene. Dermed er TA-kloning ved hjelp av PCR-produktene nødvendig for å tydelig identifisere mutasjonene og kan fremme etableringen av stabile mutantlinjer. - Bak G 2-nymfene til deres femte instar. Bruk den PCR-baserte genotypingen beskrevet i trinn 5.2 for å identifisere hvilke homozygoter og/eller heterozygoter som egner seg for videre forskning og stabil passering (figur 4B).
MERK: Vær oppmerksom på å unngå blanding av homozygoter og heterozygoter. Det anbefales å utføre PCR-basert genotyping i hver generasjon for å bekrefte homozygositeten og/eller heterozygositeten til hver populasjon. Antall gresshopper som brukes til denne kontrollen avhenger av populasjonsstørrelsen. Videre kan populasjonen av gresshopper utvides med in-cross-strategien.
6. Eggkryopreservering og gjenopplivning
- Vask eggene som skal kryopreserveres med sterilt vann og inkuber dem i en kulturskål som beskrevet ovenfor (trinn 3.8) i 5-6 dager. Samle disse eggene sammen i kulturskålen og dekk dem med filterpapirfragmenter. Pakk hele kulturfatet med en parafinfilm.
- Fatet skal oppbevares ved 25 °C i 2 dager, etterfulgt av ytterligere 2 dager ved relativt lavere temperatur (13-16 °C). Overfør deretter fatet til et kjøleskap på 6 °C. Tilsett vann i det hver 2. uke for å gi et fuktig miljø for eggene (figur 5A).
MERK: Embryoene spekuleres i å være på katatrepsisstadiet etter å ha blitt utviklet i 5-6 dager ved 30 °C26. Gradientkjøling er nyttig for kryopreservering av egg (tabell 5). - For gjenoppliving av de kryopreserverte eggene, ta petriskålen ut av kjøleskapet og oppbevar den ved 25 °C i 2 dager. Legg eggene i en rugemaskin på 30 °C til nymfene klekkes (figur 5B).
MERK: Det er nødvendig å sette de kryopreserverte eggene ved 25 °C før de overføres til en 30 °C inkubator. Embryoene kan kryopreserveres i minst fem måneder, selv om klekkehastigheten og eklosjonshastigheten kan reduseres på grunn av kryopreserveringen (tabell 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen inneholder de detaljerte trinnene for å generere homozygote mutanter av migrerende gresshopper med RNP bestående av Cas9-protein og in vitro syntetisert sgRNA. Følgende er noen representative resultater av CRISPR / Cas9-mediert målgenknockout i gresshopper, inkludert målvalg, sgRNA-syntese og verifisering (figur 1A), egginnsamling og injeksjon, mutant screening og passasje, kryopreservering og gjenopplivning av de homozygote eggene.
I denne studien er målstedet for CRISPR/Cas9-systemet valgt i henhold til resultatene fra tre nettbaserte programmer (E-CRISP, CRISPOR og ZiFit) og ligger i det første eksonet (figur 1B). Ifølge Cas9-spaltningsanalysen in vitro (tabell 1) kunne CRISPR/Cas9 RNP fordøye PCR-fragmentet (som inneholdt målstedet) med en spaltningsrate på ca. 55 % (figur 1C). Deretter ble denne RNP mikroinjisert i 120 befruktede egg på deres enkeltcellestadium ved bruk av standard mikroinjeksjonssystem (figur 2 og figur 3). Sekvenseringsresultatene for estimering av embryonale mutasjonshastigheter foreslo effektiv genomredigering på målstedet (figur 4A). Videre resulterte denne studien i en klekkefrekvens på 52,73 % nymfe og 66,7 % av G0-voksne var mosaikkmutanter (tabell 4).
Videre ble G 0-kimærene krysset med villtypegresshopper for å oppnå heterozygote G 1-individer, og G 1-heterozygotene med de samme mutasjonene (screenet ved TA-kloning) ble krysset for å generere G2-dyrene. PCR-basert fenotyping ble brukt for å påvise mutanter, og de oppnådde homozygotene ble krysset for å etablere stabile mutantlinjer (figur 4B).
I mellomtiden ble de overskytende homozygote eggene kryopreservert for å forbedre utnyttelsesgraden av homozygotene. Selv om klekkehastigheten til de kryopreserverte eggene ble redusert med forlengelsen av kryopreserveringstiden (tabell 5), var de korrigerende tiltakene, inkludert påføring av filterpapirfragmenter for å holde eggene våte og gjenvinning av disse konserverte eggene med en gradient av stigende temperatur, begge nyttige for gjenopplivningen (figur 5 og tabell 5). Til slutt ble den homozygote populasjonen av mutanter vellykket beholdt for senere forskning.
Figur 1: Design av målet og in vitro verifisering av sgRNA. (A) Flytdiagrammet for målvalg, sgRNA-syntese og bioaktivitetsverifisering in vitro (inkludert, men ikke begrenset til, gresshopper). (B) Skjematisk diagram over genstrukturen og målstedet. Eksonene til dette målgenet vises som blå domener og målstedet ble valgt nedstrøms for startkodonet i ekson 1. Målsekvensen er uthevet i rødt. (C) Agarosegelelektroforese er et resultat av in vitro Cas9 spaltningsanalyse. Et DNA-fragment som inneholder målsekvensen (ca. 400 bp i lengde) ble amplifisert og brukt som substrat for Cas9-fordøyelse. De forventede små båndene (ca. 100 bp og 300 bp her; merket med røde trekanter) antydet at det syntetiserte sgRNA kunne indusere effektiv Cas9-spaltning. Spaltningsraten var ca. 55 % ifølge gråtoneanalysen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Nålepreparering og mikroinjeksjonspute for gresshoppeegg. (A) Spiss av en forberedt nål for mikroinjeksjon av gresshoppeegg. Skala stang: 1 mm. (B) Bilde av en mikroinjeksjonspute med egg (indikert med en rød trekant) arrangert på den. Skalastangen representerer 1 cm. (C) Størrelsen på mikroinjeksjonsputeletten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mikroinjeksjoner av egg. (A) Et representativt mikroinjeksjonssystem merket med røde bokser som indikerer et mikroskop (midten) og en mikromanipulator (høyre) koblet til en mikroinjektor (venstre). Datamaskinen brukes til datalagring og for å gi hjelpeobservasjon. (B) Injeksjon av gresshoppeegget. Injeksjonsstedet er merket med en rød trekant. (C) En klekket nymfe under mikroskopet. Skalastengene representerer 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sekvenseringsresultatene av G 0-dyr og passasjestrategi for mutantlinjene . (A) Den typiske sekvenseringen resulterer i G0-screeningen. Flere topper nær målstedet (merket med et rødt rektangel i villtypesekvensen) indikerte at det testede egget/gresshoppen ble redigert av CRISPR/Cas9-systemet (som vist i G 0-1 og G0-2), mens individet uten noen endring i sekvenseringsresultatet ble ansett som ikke redigert og forlatt (f.eks. G0-3). (B) Passasjestrategien til mutantlinjene. G0-dyrene ble først screenet ved PCR-mediert genotyping, og de med flere topper i sekvenseringsresultatene ble krysset med villtypegresshopper for å generere G1-dyrene. PCR-mediert genotyping og TA-kloning ble brukt for å identifisere G 1-heterozygotene. Deretter ble heterozygoter med de samme mutasjonene krysset for å generere G2-dyrene (homozygoter og heterozygoter) for videre forskning og passasje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eggkryopreservering og gjenopplivning. (A) Prosedyren for kryopreservering: Isoler eggene fra eggebøtter og inkuber dem ved 30 °C i 5-6 dager etter vask med sterilt vann. Deretter samler du de utviklede eggene sammen i petriskålen og dekker dem med små utklipp av fuktig filterpapir. Pakk inn hele petriskålen med en parafinfilm og oppbevar den ved 25 °C i 2 dager, etterfulgt av ytterligere 2 dager ved relativt lavere temperatur (f.eks. 13-16 °C). Til slutt oppbevares i kjøleskap ved 6 °C. (B) Prosedyren for gjenopplivning: Ta petriskålene med kryopreserverte egg ut av kjøleskapet og oppbevar dem ved 25 °C i 2 dager etter at filterpapirrestene er fjernet. Deretter kan eggene dyrkes for senere utvikling ved 30 °C til nymfene klekkes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagent | Volum (μL) |
| Cas9-protein (300 ng/μL) | 1 |
| sgRNA (300 ng/μL) | 1 |
| PCR-produkt (200 ng/μL) | 1 |
| 10×NEBuffer r3.1 | 1 |
| Nukleasefritt vann | 6 |
Tabell 1: In vitro fordøyelsessystem. 200 ng renset målfragment (PCR-produkt) ble blandet med CRISPR / Cas9-systemet (300 ng av hver komponent) for å teste bioaktiviteten til de syntetiserte sgRNAene. En kommersiell buffer ble brukt og nukleasefritt vann ble tilsatt for å gjøre opp totalvolumet til 10 μL.
| Reagent | Volum (μL) |
| 2xEs Taq MasterMix | 12.5 |
| Forward primer | 0.5 |
| Omvendt primer | 0.5 |
| Mal (lysisprodukt) | 1 |
| Nukleasefritt vann | 10.5 |
Tabell 2: PCR-system for målgenfragmentamplifisering. For å forsterke det genomiske fragmentet av målgenet, ble en kommersiell Taq-blanding brukt og primere ble tilsatt i henhold til produsentens instruksjoner. 1 μL av lysisproduktet ble brukt som mal og nukleasefritt vann ble brukt til å gjøre totalvolumet til 25 μL.
| Temperatur (°C) | Tid | Sykluser |
| 95 | 5 min | 1 |
| 95 | 30 s | 35 |
| 55 | 30 s | |
| 72 | 40 s | |
| 72 | 10 min | 1 |
Tabell 3: PCR-program for målgenamplifisering. PCR-programmet for målgenamplifisering var: 95 °C i 5 min; 35 sykluser på 95 °C i 30 s, 55 °C i 30 s, 72 °C i 40 s; 72 °C i 10 min.
| Elementer | Data |
| Antall injiserte egg | 120 |
| Testede embryoer | 10 |
| Antall klekkede nymfer | 58 |
| Klekking rate | 52.73% |
| Antall G0 voksne | 12 |
| Antall G0 mutanter | 8 |
| Mutasjonseffektivitet hos G0 voksne | 66.67% |
Tabell 4: Sammendrag av redigeringseffektivitet. 120 egg ble injisert for å slå ut målgenet og 10 egg ble tatt for testing under embryostadiet. 58 nymfer klekket fra resten av embryoene (klekkehastigheten var 52,73%). Til slutt utviklet 12 G0 gresshopper til voksenstadiet, og 8 av dem ble vellykket redigert på målstedet. Mutasjonsraten hos voksne G0 var 66,67 %.
| Kontrollgruppe | Gruppe 1 | Gruppe 2 | Gruppe 3 | Gruppe 4 | |
| Antall egg | 120 | 120 | 120 | 120 | 120 |
| Temperaturbehandling for lagring | 30 °C | 30 °C (5–6 d)→6 °C | 30 °C (5–6 d)→25 °C (2 d)→13–16 °C (2 d)→6 °C | 30 °C (5–6 d)→25 °C (2 d)→13–16 °C (2 d)→6 °C | 30 °C (5–6 d)→25 °C (2 d)→13–16 °C (2 d)→6 °C |
| Lagringstid | 14 dager | 14 dager | 1 måned | 3 måneder | 5 måneder |
| Temperaturbehandling for gjenoppliving | 30 °C | 6 °C→30 °C | 6 °C→25 °C (2 d)→30 °C | 6 °C→25 °C (2 d)→30 °C | 6 °C→25 °C (2 d)→30 °C |
| Antall klekkede gresshopper | 108 | 0 | 96 | 86 | 78 |
| Klekking rate | 90.00% | 0 | 80.00% | 71.67% | 65.00% |
| Antall voksne gresshopper | 81 | 0 | 60 | 46 | 31 |
| Eclosion rate | 75.00% | 0 | 62.50% | 53.49% | 39.74% |
Tabell 5: Sammendrag av kryopreservering og gjenoppliving av egg. 600 egg ble delt inn i fem grupper for kryopreservering og gjenopplivningsstudie. Den første gruppen (kontrollgruppen) på 120 egg ble alltid ruget ved 30 °C og lagret i 14 dager. Den andre gruppen (gruppe 1) på 120 egg ble overført til kjøleskap etter ruging ved 30 °C i 5-6 dager og lagret ved 6 °C i 14 dager. Deretter ble disse eggene overført til 30 °C for gjenopplivning. De andre gruppene (gruppe 2, gruppe 3 og gruppe 4, hver gruppe inneholdt 120 egg) opplevde en gradientkjøling og gjenopprettingstemperaturbehandling som beskrevet i protokollen (trinn 6.1-6.3) med en annen lagringstid (1 måned for gruppe 2, 3 måneder for gruppe 3 og 5 måneder for gruppe 4). Til slutt klekket 108 nymfer fra kontrollgruppen (med en klekkehastighet på 90%) og 81 av dem utviklet seg til voksenstadiet (75% av eklosjonshastigheten). Ingen gresshopper klekket i den andre gruppen (gruppe 1). Klekkehastigheten og eklosjonsraten til de andre gruppene var lavere sammenlignet med kontrollgruppen og avtok med lagringstiden. 96 nymfer klekket i gruppe 2 og 60 av dem utviklet seg til voksenstadiet. 86 nymfer klekket i gruppe 3 og 46 av dem utviklet seg til voksenstadiet. I gruppe 4 klekket 78 nymfer og 31 av dem utviklet seg til voksenstadiet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gresshopper har vært blant de mest ødeleggende for landbruket siden sivilisasjonen av mennesker23. CRISPR/Cas9-basert genomredigeringsteknologi er et kraftig verktøy for å gi bedre kunnskap om de biologiske mekanismene i gresshopper, samt en lovende skadedyrbekjempelsesstrategi. Det er derfor til stor nytte å utvikle en effektiv og brukervennlig metode for CRISPR/Cas9-mediert konstruksjon av homozygote gresshoppemutanter. Selv om noen store arbeider har blitt rapportert og gitt noen grunnleggende arbeidsflyt for genomredigering i gresshopper 18,20,21,22, mangler det fortsatt en systematisk optimalisering av hele prosedyren. Generelt kan den homozygote gresshoppemutanten generert ved embryonal injeksjon av CRISPR / Cas9-systemet deles inn i tre hovedtrinn: a) sgRNA-design, syntese og screening in vitro, b) egginnsamling, forberedelse og injeksjon; og c) mutert screening og opprettholdelse av homozygot. Denne protokollen gir en optimalisert arbeidsflyt, og trinnene for valg av målsted, in vitro sgRNA-screening, mikroinjeksjon av eggene samt påvisning av mutanter er spesielt kritiske for effektivt å generere homozygote mutante gresshopper med CRISPR / Cas9-systemet.
For det første har målstedet, formen av tilsvarende sgRNA og konsentrasjonen av sgRNA blitt foreslått som de kritiske faktorene for genomredigeringseffektivitet hos insekter18,27,28. For å løse dette problemet anbefales det å først analysere genstrukturen og designe mer enn ett målsted på ekson 1 eller nær startkodonet ved hjelp av nettressursene. Deretter syntetiserer du sgRNA in vitro og blander det med Cas9-protein i forskjellige konsentrasjoner for å optimalisere skjæreeffektiviteten til RNP. Denne prosedyren vil bidra til å identifisere et sgRNA med høy bioaktivitet og optimalisere sammensetningen av RNP-komplekset for kandidatmålgenet.
For det andre er innsamling av så mange ferske egg som mulig på en begrenset tid og forbedring av klekkehastigheten samt mutasjonshastigheten også store utfordringer for genomredigeringsoperasjoner. De selskapelige voksne gresshoppene oppdrettet i tilstanden 16 (lys):8 (mørk) fotoperiode brukes til å samle nok egg på kort tid i løpet av 9:00-11:00. Det er viktig å forsiktig påføre nedadgående trykk mellom eggene ved hjelp av en pensel eller pinsett for å forsiktig isolere eggene fra belgen. Med nok øvelse kan flere brukere på en pålitelig måte skille individuelle egg fra belgen. Etter at hvert egg er isolert og vasket med sterilt vann, justeres eggene på de designede injeksjonsputene (figur 2B,C) for å stabilisere eggene under mikroinjeksjon. Egget injiseres med optimalisert RNP nær mikropylene. For å begrense den mekaniske skaden og minimere forurensningen av egg, får ferske egg bli i belgene i ca 30 minutter for å sikre at eggeskallgarvingen er ideell for mikroinjeksjon21, på grunn av sin kondenserte struktur og høye forsvarsevne ved invasjon etter nok soling 29,30. I mellomtiden indikerte en publisert rapport at syncytialdelingen31 av gresshoppeegg forekommer på et tidspunkt mellom 0 timer og 4 timer etter legging. Med dagens standard mikroinjeksjonsprotokoll kan injeksjon av ca. 100 egg oppnås innen 40 minutter. Til sammen kan prosedyren for soling og mikroinjeksjon av 100 befruktede egg fullføres innen 2 timer. Dermed er det minst 2 timer igjen for CRISRP/Cas9-mediert spaltning og reparasjon av målgener for å oppnå effektiv mutasjon i de injiserte eggene og fremtidige voksne gresshopper.
Til slutt er effektive strategier for passering og mutantidentifikasjon viktig for å generere homozygoter i de fleste mutante dyr. I gresshopper, for gener som er ikke-dødelige etter redigering, er kryssstrategien som foreslås her at G0 mutanter krysser med brede gresshopper og videre in-crosses kan utføres ved hjelp av G1 heterozygoter med de samme mutasjonene for å generere homozygote mutanter i neste generasjon. For å verifisere mutasjonen i hver gresshoppe under mutantarveprosessen, anbefales det å bruke alkalisk lysemetode for å fordøye et kort antennesegment som mal for PCR-basert genotyping. Til slutt, bruk de oppnådde homozygote voksne for videre kryss for å utvide befolkningen. Begrenset av populasjonsstørrelse og forskjeller i utviklingsstadiet mellom homozygote gresshopper, anbefales overskudd av egg til kryopreservering ved 6 °C og gjenoppliving ved gradienttemperaturstigning (figur 5), som er basert på prinsippet om lavtemperaturdiapause og høytemperatur diapausefrigjøring av migrerende gresshoppeegg32,33.
Kort sagt, CRISPR / Cas9-systemet har vist seg å være et pålitelig verktøy for å lette studiet av funksjonell genomikk av migrerende gresshopper. Denne detaljerte protokollen kan brukes som referanse for CRISPR / Cas9-baserte genredigeringsapplikasjoner i trekkende gresshopper så vel som i andre insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (32070502, 31601697, 32072419 og China Postdoctoral Science Foundation (2020M672205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×NEBuffer r3.1 | New England Biolabs | B7030S | The buffer of in vitro Cas9 cleavage assays |
| 2xEs Taq MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0690 | For gene amplification |
| 2xPfu MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0686 | For gene amplification |
| CHOPCHOP | Online website for designing sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/. | ||
| CRISPOR | Online website for designing sgRNAs, http://crispor.org. | ||
| CRISPRdirect | Online website for designing sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/. | ||
| Electrophoresis power supply | LIUYI BIOLOGY | DYY-6D | Separation of nucleic acid molecules of different sizes |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 30125177 | For sample collection, etc. |
| Fine brushes | Annigoni | 1235 | For cleaning and isolating eggs. Purchased online. |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | For making the microinjection needles |
| Gel Extraction Kit | Cwbio | CW2302 | DNA recovery and purification |
| Gel Imaging Analysis System | OLYMPUS | Gel Doc XR | Observe the electrophoresis results |
| GeneTouch Plus | Bioer | B-48DA | For gene amplification |
| Glass electrode capillary | Gairdner | GD-102 | For making injection needles with a micropipette Puller |
| Incubator | MEMMERT | INplus55 | For migratory locust embryo culture |
| Metal bath | TIANGEN | AJ-800 | For heating the sample |
| Micro autoinjector | Eppendorf | 5253000068 | Microinjection of embryos early in development |
| Micro centrifuge | Allsheng | MTV-1 | Used for mixing reagents |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | To ground the tip of injection needle |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | For loading solutions into the injection needles. |
| Micromanipulation system | Eppendorf | TransferMan 4r | An altinative manipulation system for microinjection |
| Microscope | cnoptec | SZ780 | For microinjection |
| Motor-drive Manipulator | NARISHIGE | MM-94 | For controling the position of the micropipette during the microinjection precedure |
| Multi-Sample Tissue Grinder | jingxin | Tissuelyser-64 | Grind and homogenize the eggs |
| ovipisition pot | ChangShengYuanYi | CS-11 | Filled with wet sterile sand for locust ovipositing in it. The oocysts are collected from this container. Purchased online. |
| Parafilm | ParafilmM | PM996 | For wrapping the petri dishes. |
| pEASY-T3 Cloning Kit | TransGen Biotech | CT301-01 | For TA cloning |
| Petri dish | NEST | 752001 | For culture and preservation of the eggs. |
| Pipettor | Eppendorf | Research plus | For sample loading |
| plastic culture cup | For rearing locusts seperately and any plastic cup big enough (not less than 1000 mL in volume) will do. Purchased online. | ||
| Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Primer Premier | PREMIER Biosoft | Primer Premier 5.00 | For primer design |
| SnapGene | Insightful Science | SnapGene®4.2.4 | For analyzing sequences |
| Steel balls | HuaXinGangQiu | HXGQ60 | For sample grinding.Purchased online. |
| Tips | bioleaf | D781349 | For sample loading |
| Trans DNA Marker II | TransGen Biotech | BM411-01 | Used to determine gene size |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo | A36496 | Cas9 protein |
| UniversalGen DNA Kit | Cwbio | CWY004 | For genomic DNA extraction |
| VANNAS Scissors | Electron Microscopy Sciences | 72932-01 | For cutting off the antennae |
| Wheat | To generate wheat seedlings as the food for locusts. Bought from local farmers. | ||
| ZiFiT | Online website for designing sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx. |
References
- Doudna, J. A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).
- van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechnology. 38 (7), 845-855 (2020).
- McCarty, N. S., Graham, A. E., Studena, L., Ledesma-Amaro, R. Multiplexed CRISPR technologies for gene editing and transcriptional regulation. Nature Communications. 11 (1), 1281 (2020).
- Manghwar, H., et al. CRISPR/Cas systems in genome editing: Methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects. Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., Nakata, A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology. 169 (12), 5429-5433 (1987).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa Armigera (Hubner). Journal of Visualized Experiments: JoVE1. (173), e62068 (2021).
- Huang, Y., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of the abdominal-A homeotic gene in the global pest, diamondback moth (Plutella xylostella). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 75, 98-106 (2016).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Xu, X., et al. BmHpo mutation induces smaller body size and late stage larval lethality in the silkworm, Bombyx mori. Insect Science. 25 (6), 1006-1016 (2018).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 60 (2018).
- Zhang, T., et al. Egg tanning improves the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated mutant locust production by enhancing defense ability after microinjection. Journal of Integrative Agriculture. 20 (10), 2716-2726 (2021).
- Guo, X., et al. 4-Vinylanisole is an aggregation pheromone in locusts. Nature. 584 (7822), 584-588 (2020).
- Zhang, L., Lecoq, M., Latchininsky, A., Hunter, D.
- Yang, P., Hou, L., Wang, X., Kang, L. Core transcriptional signatures of phase change in the migratory locust. , Available from: http://www.locustmine.org:8080/locustmine (2019).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. , Available from: http://www.e-crisp.org/E-CRISP/ (2014).
- Pétavy, G. Origin and development of the vitellophags during embryogenesis of the migratory locust, Locusta migratoria L. (Orthoptera : Acrididae). International Journal of Insect Morphology and Embryology. 14 (6), 361-379 (1985).
- Barry, S. K., et al.
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome editing in the cricket, Gryllus bimaculatus. Methods in Molecular Biology. 1630, 219-233 (2017).
- Du, M. H., et al. Suppression of Laccase 2 severely impairs cuticle tanning and pathogen resistance during the pupal metamorphosis of Anopheles sinensis (Diptera: Culicidae). Parasites & Vectors. 10 (1), 171 (2017).
- Eisner, T., Shepherd, J., Happ, G. M. Tanning of grasshopper eggs by an exocrine secretion. Science. 152 (3718), 95-97 (1966).
- Ho, K., Dunin-Borkowski, O. M., Akam, M. Cellularization in locust embryos occurs before blastoderm formation. Development. 124 (14), 2761-2768 (1997).
- Wang, X., et al. Interactive effect of photoperiod and temperature on the induction and termination of embryonic diapause in the migratory locust. Pest Managment Science. 77 (6), 2854-2862 (2021).
- Jarwar, A. R., et al. Comparative transcriptomic analysis reveals molecular profiles of central nervous system in maternal diapause induction of Locusta migratoria. G3-Genes Genomes Genetics. 9 (10), 3287-3296 (2019).
