Summary
Denna studie ger en systematiskt optimerad procedur för CRISPR/Cas9 ribonukleasbaserad konstruktion av homozygota gräshoppsmutanter samt en detaljerad metod för kryokonservering och återupplivning av gräshoppsäggen.
Abstract
Den migrerande gräshoppan, Locusta migratoria, är inte bara en av de världsomspännande pestgräshopporna som orsakade enorma ekonomiska förluster för människor utan också en viktig forskningsmodell för insektsmetamorfos. CRISPR / Cas9-systemet kan exakt lokaliseras vid en specifik DNA-plats och klyva inom målplatsen, vilket effektivt introducerar dubbelsträngsbrott för att inducera målgenknockout eller integrera nya genfragment i den specifika platsen. CRISPR/Cas9-medierad genomredigering är ett kraftfullt verktyg för att ta itu med frågor som uppstår i gräshoppsforskning samt en lovande teknik för gräshoppsbekämpning. Denna studie ger ett systematiskt protokoll för CRISPR/Cas9-medierad genknockout med komplexet av Cas9-protein och enkelstyrda RNA (sgRNA) i migrerande gräshoppor. Valet av målställen och design av sgRNA beskrivs i detalj, följt av in vitro-syntes och verifiering av sgRNA. Efterföljande procedurer inkluderar insamling av äggflottar och separation av garvade ägg för att uppnå framgångsrik mikroinjektion med låg dödlighet, äggodling, preliminär uppskattning av mutationshastigheten, gräshoppavel samt detektering, konservering och passage av mutanterna för att säkerställa populationsstabilitet hos de redigerade gräshopporna. Denna metod kan användas som referens för CRISPR/Cas9-baserade genredigeringsapplikationer i flyttgräshoppor såväl som hos andra insekter.
Introduction
Genredigeringsteknik kan användas för att införa infogningar eller deletioner i ett specifikt genomlokus för att artificiellt modifiera målgenen med syfte1. Under de senaste åren har CRISPR/Cas9-tekniken utvecklats snabbt och har ett växande tillämpningsområde inom olika områden av biovetenskap 2,3,4,5,6. CRISPR/Cas9-systemet upptäcktes redan 19877 och finns allmänt i bakterier och arkéer. Ytterligare forskning visade att det var ett prokaryot adaptivt immunsystem som är beroende av det RNA-styrda nukleaset Cas9 för att bekämpa fager8. Det artificiellt modifierade CRISPR/Cas9-systemet består huvudsakligen av två komponenter, ett enkelstyrt RNA (sgRNA) och Cas9-proteinet. SGRNA består av ett CRISPR-RNA (crRNA) som är komplementärt till målsekvensen och ett hjälptransaktiverande crRNA (tracrRNA), som är relativt bevarat. När CRISPR/Cas9-systemet aktiveras bildar sgRNA ett ribonukleoprotein (RNP) med Cas9-proteinet och leder Cas9 till sitt målställe via basparningen av RNA-DNA-interaktioner. Därefter kan dubbelsträngs-DNA klyvas av Cas9-proteinet och som ett resultat framträder dubbelsträngbrytningen (DSB) nära protospacer-intilliggande motiv (PAM) på målplatsen 9,10,11,12. För att mildra skadorna som orsakas av DSB: erna skulle celler aktivera omfattande DNA-skadesvar för att effektivt upptäcka genomiska skador och initiera reparationsproceduren. Det finns två distinkta reparationsmekanismer i cellen: icke-homolog ändfogning (NHEJ) och homologiriktad reparation (HDR). NHEJ är den vanligaste reparationsvägen som snabbt kan reparera DNA-dubbelsträngbrott och förhindrar cellapoptos. Det är dock felbenäget på grund av att det lämnar små fragment av infogningar och borttagningar (indels) nära DSB: erna, vilket vanligtvis resulterar i en öppen läsramförskjutning och därmed kan leda till genknock-out. Däremot är homolog reparation en ganska sällsynt händelse. Under förutsättning att det finns en reparationsmall med sekvenser som är homologa med DSB: s sammanhang, skulle celler ibland reparera det genomiska brottet enligt den närliggande mallen. Resultatet av HDR är att DSB repareras exakt. Speciellt om det finns en ytterligare sekvens mellan de homologa sekvenserna i mallen, skulle de integreras i genomet genom HDR, och på detta sätt kan de specifika geninsättningarna realiseras13.
Med optimering och utveckling av sgRNA-strukturerna och Cas9-proteinvarianterna har det CRISPR / Cas9-baserade genetiska redigeringssystemet också framgångsrikt tillämpats i forskning av insekter, inklusive men inte begränsat till Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostel och Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. Så vitt författarna vet, även om RNP bestående av Cas9-proteinet och in vitro-transkriberat sgRNA har använts för gräshoppsgenomredigering20,21,22, saknas fortfarande ett systematiskt och detaljerat protokoll för CRISPR / Cas9-ribonukleasmedierad konstruktion av homozygota mutanter av migrationsgräshoppan.
Den migrerande gräshoppan är en viktig jordbruksskadegörare som har en global distribution och utgör betydande hot mot livsmedelsproduktionen, vilket är särskilt skadligt för gräsväxter, såsom vete, majs, ris och hirs23. Genfunktionsanalys baserad på genomredigeringsteknik kan ge nya mål och nya strategier för kontroll av migrerande gräshoppor. Denna studie föreslår en detaljerad metod för att slå ut migrerande gräshoppsgener via CRISPR / Cas9-systemet, inklusive val av målplatser och design av sgRNA, in vitro-syntes och verifiering av sgRNA, mikroinjektion och odling av ägg, uppskattning av mutationshastighet vid embryonalstadiet, detektion av mutanter samt passage och bevarande av mutanterna. Detta protokoll kan användas som en basal referens för manipulation av de allra flesta gräshoppsgener och kan ge värdefulla referenser för genomredigering av andra insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Val av målplats och sgRNA-design
- Samla in så mycket sekvensinformation som möjligt för genen av intresse genom litteraturforskning och / eller sökning efter mRNA eller kodande DNA-sekvens (CDS) av genen vid NCBI och johannesbröddatabas24.
- Jämför sekvensen av den intresserade genen med dess genomiska DNA-sekvens för att skilja exon- och intronregionerna.
- Välj en kandidatregion för målplatsdesign baserat på forskningssyftet. Designa primerpar för att förstärka kandidatregionfragmentet och verifiera dess vildtypsekvens genom sekvensanalys av PCR-produkten.
OBS: Det finns olika strategier för valet av kandidatens målregion. Till exempel, i de flesta gen-/proteinfunktionsforskningar, använd exonfragmentet nära dess startkodon som kandidatregion för att säkerställa att hela protein/RNA-funktionen går förlorad efter genomredigeringen (dvs. genknock-out). För funktionsanalys av en specifik domän väljer du kandidatregionen i början (eller båda ändarna) av domänen. - Använd onlineresurser som E-CRISP Design25 för att söka efter potentiella målplatser i kandidatens målregion.
- Välj "Drosophila melanogaster BDGP6" (eller någon annan insekt) i listrutan med referensgenom och välj "Indata är FASTA-sekvens" följt av att klistra in sekvensen för målregionen i textrutan (i FASTA-format).
- Starta applikationen genom att trycka på "Starta sgRNA-sökning" med "medium" och "single design" för att få möjliga målplatser. Välj 1-3 potentiella mål från resultaten baserat på deras förutsagda poäng och utforma motsvarande sgRNA därefter.
OBS: Det finns många fler onlineplattformar för CRISPR-design, till exempel CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT och så vidare (se materialförteckning). Vissa av dem har funktionen av specificitetskontroll för de arter vars genomsekvensdata finns i deras databaser. Den genomiska sekvensen av gräshoppor har dock inte hittats på någon onlinewebbplats. Det är bättre att använda mer än ett onlineverktyg för CRISPR-designen i gräshoppor. Överväg, överväga resultaten från olika webbplatser och välj sgRNA från resultaten enligt principen om högsta specificitet, högsta effektivitet och minst felmatchningsgrad (figur 1A, B).
2. Syntes och verifiering av sgRNA in vitro
- Syntetisera sgRNA med hjälp av sgRNA-syntessatser enligt tillverkarens manual (Table of Materials). Denna procedur innehåller vanligtvis tre steg: DNA-mallamplifiering, in vitro-transkription och sgRNA-rening21. Späd det syntetiserade sgRNA med nukleasfritt vatten till en lagringskoncentration på 300 ng / μL för vidare användning.
- Amplifiera och rena målgenfragmentet för att fungera som substrat för in vitro-klyvningsanalysen av CRISPR/Cas9-systemet. Utför dessa steg enligt tillverkarens instruktioner.
- Späd det inköpta Cas9-proteinet till 300 ng/μl med nukleasfritt vatten. Inkubera 1 μl sgRNA (300 ng/μl) och 1 μl Cas9-protein (300 ng/μl) med 200 ng renat målfragment i klyvningsbufferten vid 37 °C i 1 h (10 μl total volym, se tabell 1). Uppskatta effektiviteten av sgRNA-inducerad Cas9-klyvning genom agarosgelelektrofores (figur 1C). Välj sgRNA med hög aktivitet för följande mikroinjektion.
OBS: Resultaten av agarosgelelektrofores kan omvandlas till gråskalebilder med bildbehandlingsprogram och klyvningseffektiviteten uppskattas enligt gråskalan för banden av spekulerade storlekar.
3. Mikroinjektion och odling av äggen
- Förbered injektionsnålarna genom att dra glaskapillärer med en mikropipettavdragare (Table of Materials). Ställ in parametrarna enligt följande: Värm till 588, Dra till 90, Hastighet till 60 och Tid till 40. Slipa spetsen på injektionsnålen med en mikrokvarn (Table of Materials).
OBS: Idealiska nålspetsar är öppna och skarpa kanter (figur 2A). Det rekommenderas starkt att förbereda ytterligare nålar för experimenten eftersom nålar ibland blockeras eller oavsiktligt bryts under injektioner. - Blanda 1 μl Cas9-protein (300 ng/μl) med 1 μl verifierat sgRNA (300 ng/μl) tillsammans för att erhålla RNP för injektion. Tillsätt 8 μL RNasfritt sterilt vatten så att den slutliga volymen av blandningen blir 10 μl. Blanda lösningen noggrant och håll den på is.
OBS: De slutliga koncentrationerna av Cas9-proteinet och sgRNA kan optimeras enligt redigeringsresultaten. Undvik upprepad frysning och upptining av den beredda RNP-lösningen och omedelbar användning rekommenderas. - Föd upp vuxna gräshoppor av hankön och honor tillsammans vid 30 °C med en fotoperiod på 16 (ljus):8 (mörk) och förse dem med tillräckligt med färska veteplantor som föda. Observera dessa gräshoppor dagligen och lägg en ovipositionskruka (en plastblomkruka eller kopp fylld med våt steril sand) i uppfödningsburen för äggplacering när gräshopporna parade sig.
OBS: Vanligtvis räcker det med 100 par vuxna gräshoppor som föds upp i en uppfödningsbur (40 cm x 40 cm x 40 cm) för att generera ägg för att slå ut en enda gen. Kultur ytterligare johannesbrödpar om fler ägg behövs. - Samla de nylagda äggskidorna från ovipositionsgrytan och vänta i cirka 30 minuter för ägggarvning. Isolera försiktigt äggen från äggskidorna i vatten med en fin borste och tvätta dem med sterilt vatten tre gånger. Förvara äggen i en petriskål och tillsätt sterilt vatten för att hålla dem fuktiga.
OBS: Garvning av de nyvärpta äggen kan avsevärt förbättra mutanteffektiviteten21. - Fyll en injektionsnål med den beredda RNP-lösningen och ladda den till mikromanipulatorn (Table of Materials).
- Ställ in mikroinjektionsparametrarna enligt följande: 300 hPa av injektionstrycket (pi), 0,5 s av injektionstiden (ti) och 25 hPa av kompensationstrycket (pc).
- Tryck på pedalen för att utvärdera volymen på den injicerade lösningen. Justera insprutningstrycket och injektionstiden för att säkerställa att injektionsvolymen är cirka 50-100 nL.
OBS: Töm kvarvarande luft i nålen för att göra injektionslösningen kontinuerlig och kontrollerbar så mycket som möjligt. Anslutningen av nålen och mikromanipulatorn måste vara tät.
- Ordna de sterila äggen regelbundet på injektionsdynan (figur 2B, C) och placera dynan på mikroskopets objekttabell (figur 3A). Justera förstoringen av mikroskopet tills äggen observeras. Justera mikroinjektionsnålen under mikroskopet tills injektionsspetsen syns och placera den nära ägget som ska injiceras.
- Starta injektionen i lämplig höjd och en vinkel på 30-45 grader. För försiktigt in spetsen i ägget nära äggets mikropyler (figur 3B) och tryck på pedalen för att genomföra injektionen. Dra snabbt tillbaka nålen och flytta injektionsdynan för injektion av nästa ägg.
OBS: En liten expansion av ägget under mikroinjektionen bör observeras. En liten mängd cytoplasmatisk läckage vid pinhålet är acceptabelt. Byt ut injektionsnålen mot en ny eller justera insprutningsvinkeln om utflödet av vätska är för mycket. - Överför de injicerade äggen till en odlingsskål (en petriskål med en bit fuktigt filterpapper) och lägg dem i en inkubator vid 30 °C.
OBS: Det tar cirka 13-14 dagar tills nymfer kläcks från dessa injicerade ägg (förutsatt att mutation av målgenen inte påverkar embryonernas utveckling) (figur 3C). Injicera minst 100 ägg för att säkerställa en tillräcklig kläcknings- och utsöndringsmängd för att slå ut en specifik gen.
4. Uppskattning av mutationshastighet och screening av mutanter
- Kontrollera utvecklingen av de injicerade äggen varje dag efter injektionen. Överför injicerade ägg till en ny odlingsrätt var 24: e timme under de första 5 dagarna.
- På den 6: e dagen (eller senare) efter injektionen, plocka slumpmässigt och överför 10 ägg i ett rör och mal äggen på lämpligt sätt med två stålkulor vid 60 Hz i 6 minuter med en kvarn (se materialtabell). Återsuspendera skräpet med 1 ml PBS. Överför 5 μl av blandningen till 45 μl 50 mM NaOH och lysera vid 95 °C i 5 minuter. Tillsätt 5 μL 1 M Tris-HCl (pH = 8,0) i lyssystemet för att avsluta den alkaliska lysreaktionen.
OBS: Ägg kan plockas ut för alkalisk lys vilken dag som helst efter den sista överföringen och flera ägg kan användas som ett prov beroende på deras utvecklingssituation (t.ex. fem 6 dagar gamla embryon kan användas som ett prov och två 10 dagar gamla embryon kan användas som ett prov). Ibland är det inte möjligt att få genomiskt DNA från ägg med hjälp av alkalisk lysmetod. Kommersiella genomiska DNA-extraktionssatser kan användas som en alternativ metod för att isolera genomiskt DNA från äggen. - Ta 1 μl av lysprodukten som PCR-mall för att amplifiera målgenfragmentet (tabell 2 och tabell 3) och skicka PCR-produkterna för sekvensering. Jämför sekvenseringsresultaten med vildtypssekvensen för att preliminärt utvärdera om CRISPR / Cas9-systemet klyvde målgenen in vivo (figur 4A). Tillåt resten av äggen för efterföljande utveckling under förutsättning att indels detekteras i embryonalstadiet.
OBS: På detta sätt kan mutationshastigheten preliminärt uppskattas i embryostadiet. Om inga indels hittas vid detta steg, förbered några nya sgRNA för målgenen och upprepa knock-out-protokollet från steg 2.1. - Överför de kläckta nymferna till en uppfödningsbur och odla dem enligt beskrivningen i steg 3.3. När nymferna utvecklades till det femte instarstadiet, separera dem med plastkulturkoppar (1 nymf/kopp).
OBS: Det tar vanligtvis cirka 25-35 dagar för nymferna att utvecklas till sin femte instar och den mest uppenbara fenotypen är att vingknopparna sträcker sig till det fjärde eller femte buksegmentet. Dessutom rekommenderas att registrera fenotyperna av döda nymfer för att förutsäga förhållandet mellan målgenen och fenotyperna i ytterligare forskning. - Klipp av antennernas ca 2 mm längd med dissekeringssaxen och lysera den med alkalisk lys (steg 4.2). Analysera målgenfragmentsekvensen för dessa nymfer enligt beskrivningen ovan (steg 4.3) för att identifiera G 0-mutanterna (figur 4B).
OBS: Antennskärningen för lys kan vara lite längre och slipning eller malning av antennerna är till hjälp för lys, även om antennerna kan smältas direkt. Individer med flera toppar nära målplatsen i sekvenseringsresultatet identifieras som positiva mutanter och tillåts för efterföljande utveckling och parning.
5. Upprättande och passage av mutantlinjer
- Utför korsning med G0-mutanter och vildtypgräshoppor (figur 4B). Samla upp oocystorna och inkubera dessa oocystor separat vid 30 °C. Använd 3-6 utvecklade ägg i varje oocysta för att upptäcka mutationer enligt beskrivningen i steg 4.2 och 4.3. Behåll mutationspositiva oocyster för den efterföljande utvecklingen och överge de mutationsnegativa oocysterna.
OBS: Uppskattning av mutationshastigheten i det embryonala stadiet kan kraftigt påskynda screeningen av G1-mutanter . Vanligtvis kan 3-6 utvecklade ägg blandas som ett prov för PCR-medierad genotypning enligt beskrivningen ovan. - Bak G 1-nymferna enligt beskrivningen i steg 4.4. Klipp av antennernas ca 2 mm längd för att utföra PCR-baserad genotypning enligt beskrivningen i steg 4.5 för detektering av G 1-heterozygoter. Utför TA-kloning enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning) för att identifiera deras mutationer. Utför in-cross med G1 heterozygoter med samma mutationer för att erhålla G2 nymfer.
OBS: Sanger-sekvensering av PCR-produkterna kan endast ge information för att ta reda på heterozygoterna, men inte tillräckligt med information för att identifiera de exakta mutationerna. Således krävs TA-kloning med PCR-produkterna för att tydligt identifiera mutationerna och kan främja upprättandet av stabila mutantlinjer. - Föd upp G 2-nymferna till deras femte instar. Använd den PCR-baserade genotypning som beskrivs i steg 5.2 för att identifiera de homozygoter och/eller heterozygoter som är lämpliga för vidare forskning och stabil passaging (Figur 4B).
OBS: Var uppmärksam på att undvika blandning av homozygoter och heterozygoter. Det rekommenderas PCR-baserad genotypning i varje generation för att bekräfta homozygositeten och/eller heterozygositeten hos varje population. Antalet gräshoppor som används för denna kontroll beror på populationens storlek. Dessutom kan gräshoppspopulationen utökas genom korsstrategin.
6. Kryokonservering och återupplivning av ägg
- Tvätta äggen som ska kryokonserveras med sterilt vatten och inkubera dem i en odlingsskål enligt beskrivningen ovan (steg 3.8) i 5-6 dagar. Samla dessa ägg tillsammans i odlingsskålen och täck dem med filterpappersfragment. Slå in hela kulturrätten med en paraffinfilm.
- Håll skålen vid 25 °C i 2 dagar följt av ytterligare 2 dagar vid en relativt lägre temperatur (13-16 °C). Överför sedan skålen till ett kylskåp på 6 °C. Tillsätt vatten i det varannan vecka för att ge en fuktig miljö för äggen (figur 5A).
OBS: Embryona spekuleras vara i katatrepsisstadiet efter att ha utvecklats i 5-6 dagar vid 30 ° C26. Gradientkylning är till hjälp för kryokonservering av ägg (tabell 5). - För återupplivning av de kryokonserverade äggen, ta ut petriskålen från kylskåpet och förvara den vid 25 ° C i 2 dagar. Placera dessa ägg i en 30 °C inkubator tills nymferna kläcks (figur 5B).
OBS: Det är nödvändigt att sätta de kryokonserverade äggen vid 25 °C innan de överförs till en 30 °C inkubator. Embryona kan fryskonserveras i minst fem månader, även om kläckningshastigheten och eclosionshastigheten kan minska på grund av kryokonserveringen (tabell 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll innehåller de detaljerade stegen för att generera homozygota mutanter av de migrerande gräshopporna med RNP bestående av Cas9-protein och in vitro-syntetiserat sgRNA. Följande är några representativa resultat av CRISPR / Cas9-medierad målgenknockout i gräshoppor, inklusive målval, sgRNA-syntes och verifiering (figur 1A), ägginsamling och injektion, mutant screening och passaging, kryokonservering och återupplivning av de homozygota äggen.
I denna studie väljs målplatsen för CRISPR/Cas9-systemet utifrån resultaten från tre onlineprogram (E-CRISP, CRISPOR och ZiFit) och lokaliseras i den första exonen (Figur 1B). Enligt Cas9-klyvningsanalysen in vitro (tabell 1) kunde CRISPR/Cas9 RNP smälta PCR-fragmentet (innehållande målstället) med en klyvningshastighet på cirka 55 % (figur 1C). Därefter mikroinjicerades denna RNP i 120 befruktade ägg i deras encellsstadium med hjälp av standardmikroinjektionssystemet (figur 2 och figur 3). Sekvenseringsresultaten för uppskattning av mutationshastighet i embryonalt stadium tydde på effektiv genomredigering på målplatsen (figur 4A). Vidare resulterade denna studie i en kläckningshastighet på 52,73% nymf och 66,7% av G0-vuxna var mosaikmutanter (tabell 4).
Vidare korsades G 0-chimärerna med gräshoppor av vildtyp för att erhålla heterozygotaG1-individer och G1-heterozygoterna med samma mutationer (screenade genom TA-kloning) korsades för att generera G2-djuren. PCR-baserad fenotypning användes för detektion av mutanter och de erhållna homozygoterna korsades för att etablera stabila mutantlinjer (figur 4B).
Under tiden kryokonserverades överskottet av homozygota ägg för att förbättra utnyttjandegraden av homozygoterna. Även om kläckningshastigheten för de kryokonserverade äggen minskade med förlängningen av kryokonserveringstiden (tabell 5), var de korrigerande åtgärderna, inklusive applicering av filterpappersfragment för att hålla ägg våta och återvinning av dessa konserverade ägg med en gradient av stigande temperatur, båda till hjälp för återupplivningen (figur 5 och tabell 5). Slutligen hölls den homozygota populationen av mutanter framgångsrikt för efterföljande forskning.
Figur 1: Måldesign och in vitro-verifiering av sgRNA. (A) Flödesschemat för målval, sgRNA-syntes och verifiering av bioaktivitet in vitro (inklusive men inte begränsat till gräshoppor). b) Schematiskt diagram över genstrukturen och målplatsen. Exonerna för denna målgen visas som blå domäner och målplatsen valdes nedströms om startkodonet i exon 1. Målsekvensen markeras med rött. c) Agarosgelelektroforesresultatet av Cas9-klyvningstest in vitro. Ett DNA-fragment som innehåller målsekvensen (cirka 400 bp i längd) amplifierades och användes som substrat för Cas9-digestion. De förväntade små banden (cirka 100 bp och 300 bp här; markerade med röda trianglar) föreslog att det syntetiserade sgRNA kunde inducera effektiv Cas9-klyvning. Klyvningsgraden var cirka 55% enligt gråskaleanalysen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Nålberedning och mikroinjektionsdyna för johannesbröd. a) Spetsen på en beredd nål för mikroinjektion av johannesbröd. Skalstång: 1 mm. (B) Bild av en mikroinjektionsdyna med ägg (markerade med en röd triangel) anordnade på den. Skalstången representerar 1 cm. (C) Storleken på mikroinjektionsdynan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Mikroinjektioner av ägg. (A) Ett representativt mikroinjektionssystem märkt med röda rutor som indikerar ett mikroskop (mitten) och en mikromanipulator (höger) ansluten till en mikroinjektor (vänster). Datorn används för datalagring och för att tillhandahålla extra observation. b) Injektion av gräshoppsägget. Injektionsstället är markerat med en röd triangel. (C) En kläckt nymf under mikroskopet. Skalstängerna representerar 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Sekvenseringsresultaten för G 0-djur och mutantlinjernas passeringsstrategi . (A) Den typiska sekvenseringen resulterar i G0-screeningen. Flera toppar nära målplatsen (markerade med en röd rektangel i vildtypsekvensen) indikerade att det testade ägget/gräshoppan framgångsrikt redigerades av CRISPR/Cas9-systemet (som visas i G 0-1 och G0-2), medan individen utan någon förändring i sekvenseringsresultatet ansågs inte redigerad och övergiven (t.ex. G0-3). (B) Mutantlinjernas passeringsstrategi. G0-djuren screenades först genom PCR-medierad genotypning och de med flera toppar i sina sekvenseringsresultat korsades med vildtypgräshoppor för att generera G1-djuren. PCR-medierad genotypning och TA-kloning användes för att identifiera G 1-heterozygoterna. Därefter korsades heterozygoter med samma mutationer för att generera G2-djuren (homozygoter och heterozygoter) för vidare forskning och passaging. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Kryokonservering och återupplivning av ägg. A) Förfarandet för kryokonservering: Isolera äggen från äggkapslarna och inkubera dem vid 30 °C i 5–6 dagar efter tvättning med sterilt vatten. Samla sedan de utvecklade äggen i petriskålen och täck dem med små rester av fuktigt filterpapper. Slå in hela petriskålen med en paraffinfilm och håll den vid 25 °C i 2 dagar, följt av ytterligare 2 dagar vid en relativt lägre temperatur (t.ex. 13–16 °C). Slutligen kyls den vid 6 °C. (B) Återupplivningsförfarandet: Ta ut petriskålarna med kryokonserverade ägg från kylskåpet och förvara dem vid 25 °C i 2 dagar efter att filterpappersresterna har tagits bort. Därefter kan äggen odlas för senare utveckling vid 30 °C tills nymferna kläcks. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Reagens | Volym (μL) |
| Cas9-protein (300 ng/μl) | 1 |
| sgRNA (300 ng/μl) | 1 |
| PCR-produkt (200 ng/μl) | 1 |
| 10×NEBuffer R3.1 | 1 |
| Nukleasfritt vatten | 6 |
Tabell 1: Matsmältningssystemet in vitro . 200 ng renat målfragment (PCR-produkt) blandades med CRISPR/Cas9-systemet (300 ng av varje komponent) för att testa bioaktiviteten hos de syntetiserade sgRNA:erna. En kommersiell buffert användes och nukleasfritt vatten tillsattes för att kompensera den totala volymen till 10 μl.
| Reagens | Volym (μL) |
| 2xEs Taq MasterMix | 12.5 |
| Framåt primer | 0.5 |
| Omvänd primer | 0.5 |
| Mall (lysprodukt) | 1 |
| Nukleasfritt vatten | 10.5 |
Tabell 2: PCR-system för amplifiering av målgenfragment. För att förstärka det genomiska fragmentet av målgenen användes en kommersiell Taq-blandning och primers tillsattes enligt tillverkarens instruktioner. 1 μL av lysprodukten användes som mall och nukleasfritt vatten användes för att göra den totala volymen till 25 μL.
| Temperatur (°C) | Tid | Cykler |
| 95 | 5 minuter | 1 |
| 95 | 30 sekunder | 35 |
| 55 | 30 sekunder | |
| 72 | 40 Sekunder | |
| 72 | 10 minuter | 1 |
Tabell 3: PCR-program för förstärkning av målgenen. PCR-programmet för målgenamplifiering var: 95 °C i 5 minuter; 35 cykler vid 95 °C vid 30 s, 55 °C vid 30 s, 72 °C vid 40 s. 72 °C i 10 min.
| Objekt | Data |
| Antal injicerade ägg | 120 |
| Testade embryon | 10 |
| Antal kläckta nymfer | 58 |
| Kläckningshastighet | 52.73% |
| Antal G0 vuxna | 12 |
| Antal G0-mutanter | 8 |
| Mutationseffektivitet hos G0 vuxna | 66.67% |
Tabell 4: Sammanfattning av redigeringseffektivitet. 120 ägg injicerades för att slå ut målgenen och 10 ägg togs för testning under embryostadiet. 58 nymfer kläcktes från resten embryon (kläckningsgraden var 52,73%). Slutligen utvecklades 12 G0 gräshoppor till vuxenstadiet och 8 av dem redigerades framgångsrikt på målplatsen. Mutationshastigheten hos vuxna G0 var 66,67 %.
| Kontrollgrupp | Grupp 1 | Grupp 2 | Grupp 3 | Grupp 4 | |
| Antal ägg | 120 | 120 | 120 | 120 | 120 |
| Temperaturbehandling för lagring | 30 °C | 30 °C (5–6 d)→6 °C | 30 °C (5–6 d)→25 °C (2 d)→13–16 °C (2 d)→6 °C | 30 °C (5–6 d)→25 °C (2 d)→13–16 °C (2 d)→6 °C | 30 °C (5–6 d)→25 °C (2 d)→13–16 °C (2 d)→6 °C |
| Lagringstid | 14 dagar | 14 dagar | 1 månad | 3 månader | 5 månader |
| Temperaturbehandling för återupplivning | 30 °C | 6°C→30 °C | 6 °C→25 °C (2 d)→30 °C | 6 °C→25 °C (2 d)→30 °C | 6 °C→25 °C (2 d)→30 °C |
| Antal kläckta gräshoppor | 108 | 0 | 96 | 86 | 78 |
| Kläckningshastighet | 90.00% | 0 | 80.00% | 71.67% | 65.00% |
| Antal vuxna gräshoppor | 81 | 0 | 60 | 46 | 31 |
| Stängningshastighet | 75.00% | 0 | 62.50% | 53.49% | 39.74% |
Tabell 5: Sammanfattning av kryokonservering och återupplivning av ägg. 600 ägg delades in i fem grupper för kryokonservering och återupplivningsstudie. Den första gruppen (kontrollgruppen) på 120 ägg ruvades alltid vid 30 °C och lagrades i 14 dagar. Den andra gruppen (grupp 1) med 120 ägg överfördes till kylskåp efter inkubation vid 30 °C i 5–6 dagar och förvarades vid 6 °C i 14 dagar. Därefter överfördes dessa ägg till 30 ° C för återupplivning. De andra grupperna (grupp 2, grupp 3 och grupp 4, varje grupp innehöll 120 ägg) upplevde en gradientkylning och återvinning av temperaturbehandling som beskrivs i protokollet (steg 6.1-6.3) med en annan lagringstid (1 månad för grupp 2, 3 månader för grupp 3 och 5 månader för grupp 4). Äntligen kläcktes 108 nymfer från kontrollgruppen (med en kläckningshastighet på 90%) och 81 av dem utvecklades till vuxenstadiet (75% av eclosionshastigheten). Inga gräshoppor kläcktes i den andra gruppen (grupp 1). Kläckningshastigheten och eclosionshastigheten för de andra grupperna var lägre jämfört med kontrollgruppen och minskade med lagringstiden. 96 nymfer kläcktes i grupp 2 och 60 av dem utvecklades till vuxenstadiet. 86 nymfer kläcktes i grupp 3 och 46 av dem utvecklades till vuxenstadiet. I grupp 4 kläcktes 78 nymfer och 31 av dem utvecklades till vuxenstadiet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gräshoppor har varit bland de mest förödande skadedjuren för jordbruket sedan människans civilisation23. CRISPR/Cas9-baserad genomredigeringsteknik är ett kraftfullt verktyg för att ge bättre kunskap om de biologiska mekanismerna hos gräshoppor samt en lovande skadedjursbekämpningsstrategi. Det är därför av stor fördel att utveckla en effektiv och lättanvänd metod för CRISPR/Cas9-medierad konstruktion av homozygota gräshoppsmutanter. Även om några bra verk har rapporterats och gett några grundläggande arbetsflöden för genomredigering i gräshoppor 18,20,21,22, saknas fortfarande en systematisk optimering av hela proceduren. I allmänhet kan den homozygota gräshoppsmutanten genererad genom embryonal injektion av CRISPR / Cas9-systemet delas in i tre huvudsteg: a) sgRNA-design, syntes och screening in vitro, b) ägginsamling, beredning och injektion; och c) mutant screening och homozygot underhåll. Detta protokoll ger ett optimerat arbetsflöde och stegen för val av målplats, in vitro sgRNA-screening, mikroinjektion av äggen samt detektering av mutanter är särskilt kritiska för att effektivt generera homozygota mutanta gräshoppor med CRISPR / Cas9-systemet.
För det första har målplatsen, formen av motsvarande sgRNA och koncentrationen av sgRNA föreslagits som de kritiska faktorerna för genomredigeringseffektivitet hos insekter18,27,28. För att lösa detta problem rekommenderas att du först analyserar genstrukturen och designar mer än en målplats på exon 1 eller nära startkodonet med hjälp av online-resurserna. Syntetisera sedan sgRNA in vitro och blanda det med Cas9-protein i olika koncentrationer för att optimera skäreffektiviteten hos RNP. Denna procedur hjälper till att identifiera ett sgRNA med hög bioaktivitet och optimera sammansättningen av RNP-komplexet för kandidatmålgenen.
För det andra är insamling av så många färska ägg som möjligt på en begränsad tid och förbättring av kläckningshastigheten samt mutationshastigheten också stora utmaningar för genomredigeringsoperationer. De sällskapliga vuxna gräshopporna som föds upp under 16 (ljus):8 (mörk) fotoperiod används för att samla tillräckligt med ägg under en kort period under 9:00-11:00. Det är viktigt att försiktigt applicera nedåtgående tryck mellan äggen med en pensel eller pincett för att försiktigt isolera äggen från baljan. Med tillräckligt med övning kan flera användare på ett tillförlitligt sätt separera enskilda ägg från baljan. Efter att varje ägg har isolerats och tvättats med sterilt vatten justeras äggen på de designade injektionskuddarna (figur 2B, C) för att stabilisera äggen under mikroinjektion. Ägget injiceras med den optimerade RNP nära mikropylen. För att begränsa den mekaniska skadan och minimera föroreningen av ägg får färska ägg stanna i baljorna i cirka 30 minuter för att säkerställa att äggskalgarvningen är idealisk för mikroinjektion21, på grund av dess kondenserade struktur och höga försvarsförmåga vid invasion efter tillräckligt med garvning 29,30. Under tiden indikerade en publicerad rapport att syncytial division31 av johannesbröd ägg inträffar någon gång mellan 0 h och 4 h efter läggning. Med det nuvarande standardprotokollet för mikroinjektion kan injektion av cirka 100 ägg åstadkommas inom 40 minuter. Sammantaget kan proceduren för garvning och mikroinjektion av 100 befruktade ägg slutföras inom 2 timmar. Således är det minst 2 timmar kvar för CRISRP/Cas9-medierad klyvning och reparation av målgener för att uppnå effektiv mutation i de injicerade äggen och framtida vuxna gräshoppor.
Slutligen är effektiva strategier för passaging och mutantidentifiering viktiga för att generera homozygoter hos de flesta mutanta djur. I gräshoppor, för gener som är icke-dödliga efter redigering, är korsstrategin som föreslås här att G0-mutanter korsar med gräshoppor av bred typ och ytterligare korsningar kan utföras med användning av G1-heterozygoterna med samma mutationer för att generera homozygota mutanter i följande generation. För att verifiera mutationen i varje gräshoppa under mutantärvningsprocessen rekommenderas att använda alkalisk lysmetod för att smälta ett kort segment av antenner som mall för PCR-baserad genotypning. Slutligen, använd de erhållna homozygota vuxna för ytterligare in-cross för att utöka populationen. Överskott av ägg begränsas av populationsstorlek och skillnader i utvecklingsstadier mellan homozygota gräshoppor och rekommenderas för kryokonservering vid 6 °C och återupplivning genom gradienttemperaturökning (figur 5), som bygger på principen om lågtemperaturdiapaus och högtemperaturfrisättning av flyttande gräshoppsägg32,33.
Kort sagt har CRISPR/Cas9-systemet visat sig vara ett tillförlitligt verktyg för att underlätta studier av funktionsgenomik hos flyttgräshoppor. Detta detaljerade protokoll kan användas som referens för CRISPR/Cas9-baserade genredigeringsapplikationer i flyttgräshoppor såväl som hos andra insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (32070502, 31601697, 32072419 och China Postdoctoral Science Foundation (2020M672205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×NEBuffer r3.1 | New England Biolabs | B7030S | The buffer of in vitro Cas9 cleavage assays |
| 2xEs Taq MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0690 | For gene amplification |
| 2xPfu MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0686 | For gene amplification |
| CHOPCHOP | Online website for designing sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/. | ||
| CRISPOR | Online website for designing sgRNAs, http://crispor.org. | ||
| CRISPRdirect | Online website for designing sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/. | ||
| Electrophoresis power supply | LIUYI BIOLOGY | DYY-6D | Separation of nucleic acid molecules of different sizes |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 30125177 | For sample collection, etc. |
| Fine brushes | Annigoni | 1235 | For cleaning and isolating eggs. Purchased online. |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | For making the microinjection needles |
| Gel Extraction Kit | Cwbio | CW2302 | DNA recovery and purification |
| Gel Imaging Analysis System | OLYMPUS | Gel Doc XR | Observe the electrophoresis results |
| GeneTouch Plus | Bioer | B-48DA | For gene amplification |
| Glass electrode capillary | Gairdner | GD-102 | For making injection needles with a micropipette Puller |
| Incubator | MEMMERT | INplus55 | For migratory locust embryo culture |
| Metal bath | TIANGEN | AJ-800 | For heating the sample |
| Micro autoinjector | Eppendorf | 5253000068 | Microinjection of embryos early in development |
| Micro centrifuge | Allsheng | MTV-1 | Used for mixing reagents |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | To ground the tip of injection needle |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | For loading solutions into the injection needles. |
| Micromanipulation system | Eppendorf | TransferMan 4r | An altinative manipulation system for microinjection |
| Microscope | cnoptec | SZ780 | For microinjection |
| Motor-drive Manipulator | NARISHIGE | MM-94 | For controling the position of the micropipette during the microinjection precedure |
| Multi-Sample Tissue Grinder | jingxin | Tissuelyser-64 | Grind and homogenize the eggs |
| ovipisition pot | ChangShengYuanYi | CS-11 | Filled with wet sterile sand for locust ovipositing in it. The oocysts are collected from this container. Purchased online. |
| Parafilm | ParafilmM | PM996 | For wrapping the petri dishes. |
| pEASY-T3 Cloning Kit | TransGen Biotech | CT301-01 | For TA cloning |
| Petri dish | NEST | 752001 | For culture and preservation of the eggs. |
| Pipettor | Eppendorf | Research plus | For sample loading |
| plastic culture cup | For rearing locusts seperately and any plastic cup big enough (not less than 1000 mL in volume) will do. Purchased online. | ||
| Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Primer Premier | PREMIER Biosoft | Primer Premier 5.00 | For primer design |
| SnapGene | Insightful Science | SnapGene®4.2.4 | For analyzing sequences |
| Steel balls | HuaXinGangQiu | HXGQ60 | For sample grinding.Purchased online. |
| Tips | bioleaf | D781349 | For sample loading |
| Trans DNA Marker II | TransGen Biotech | BM411-01 | Used to determine gene size |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo | A36496 | Cas9 protein |
| UniversalGen DNA Kit | Cwbio | CWY004 | For genomic DNA extraction |
| VANNAS Scissors | Electron Microscopy Sciences | 72932-01 | For cutting off the antennae |
| Wheat | To generate wheat seedlings as the food for locusts. Bought from local farmers. | ||
| ZiFiT | Online website for designing sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx. |
References
- Doudna, J. A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).
- van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechnology. 38 (7), 845-855 (2020).
- McCarty, N. S., Graham, A. E., Studena, L., Ledesma-Amaro, R. Multiplexed CRISPR technologies for gene editing and transcriptional regulation. Nature Communications. 11 (1), 1281 (2020).
- Manghwar, H., et al. CRISPR/Cas systems in genome editing: Methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects. Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., Nakata, A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology. 169 (12), 5429-5433 (1987).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa Armigera (Hubner). Journal of Visualized Experiments: JoVE1. (173), e62068 (2021).
- Huang, Y., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of the abdominal-A homeotic gene in the global pest, diamondback moth (Plutella xylostella). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 75, 98-106 (2016).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Xu, X., et al. BmHpo mutation induces smaller body size and late stage larval lethality in the silkworm, Bombyx mori. Insect Science. 25 (6), 1006-1016 (2018).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 60 (2018).
- Zhang, T., et al. Egg tanning improves the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated mutant locust production by enhancing defense ability after microinjection. Journal of Integrative Agriculture. 20 (10), 2716-2726 (2021).
- Guo, X., et al. 4-Vinylanisole is an aggregation pheromone in locusts. Nature. 584 (7822), 584-588 (2020).
- Zhang, L., Lecoq, M., Latchininsky, A., Hunter, D.
- Yang, P., Hou, L., Wang, X., Kang, L. Core transcriptional signatures of phase change in the migratory locust. , Available from: http://www.locustmine.org:8080/locustmine (2019).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. , Available from: http://www.e-crisp.org/E-CRISP/ (2014).
- Pétavy, G. Origin and development of the vitellophags during embryogenesis of the migratory locust, Locusta migratoria L. (Orthoptera : Acrididae). International Journal of Insect Morphology and Embryology. 14 (6), 361-379 (1985).
- Barry, S. K., et al.
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome editing in the cricket, Gryllus bimaculatus. Methods in Molecular Biology. 1630, 219-233 (2017).
- Du, M. H., et al. Suppression of Laccase 2 severely impairs cuticle tanning and pathogen resistance during the pupal metamorphosis of Anopheles sinensis (Diptera: Culicidae). Parasites & Vectors. 10 (1), 171 (2017).
- Eisner, T., Shepherd, J., Happ, G. M. Tanning of grasshopper eggs by an exocrine secretion. Science. 152 (3718), 95-97 (1966).
- Ho, K., Dunin-Borkowski, O. M., Akam, M. Cellularization in locust embryos occurs before blastoderm formation. Development. 124 (14), 2761-2768 (1997).
- Wang, X., et al. Interactive effect of photoperiod and temperature on the induction and termination of embryonic diapause in the migratory locust. Pest Managment Science. 77 (6), 2854-2862 (2021).
- Jarwar, A. R., et al. Comparative transcriptomic analysis reveals molecular profiles of central nervous system in maternal diapause induction of Locusta migratoria. G3-Genes Genomes Genetics. 9 (10), 3287-3296 (2019).
