Summary
Ici, nous introduisons une méthode de trempage détaillée de l’interférence ARN chez Bursaphelenchus xylophilus pour faciliter l’étude des fonctions des gènes.
Abstract
Le nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus, est l’une des espèces envahissantes les plus destructrices au monde, causant le flétrissement et éventuellement la mort des pins. Malgré la reconnaissance de leur importance économique et environnementale, il a été jusqu’à présent impossible d’étudier les fonctions génétiques détaillées des nématodes parasites des plantes (NPP) à l’aide de la génétique avancée conventionnelle et des méthodes transgéniques. Cependant, en tant que technologie de génétique inverse, l’interférence ARN (ARNi) facilite l’étude des gènes fonctionnels des nématodes, y compris B. xylophilus.
Cet article décrit un nouveau protocole pour l’ARNi du gène ppm-1 chez B. xylophilus, qui joue un rôle crucial dans le développement et la reproduction d’autres nématodes pathogènes. Pour l’ARNi, le promoteur T7 a été lié au 5'-terminal du fragment cible par réaction en chaîne de la polymérase (PCR), et l’ARN double brin (ARNds) a été synthétisé par transcription in vitro . Par la suite, l’administration d’ARNds a été accomplie en trempant les nématodes dans une solution d’ARNds mélangée à des neurostimulants synthétiques. Des juvéniles synchronisés de B. xylophilus (environ 20 000 individus) ont été lavés et trempés dans de l’ARNds (0,8 μg/mL) dans le tampon de trempage pendant 24 heures dans l’obscurité à 25 °C.
La même quantité de nématodes a été placée dans un tampon de trempage sans ARNds comme témoin. Pendant ce temps, une autre quantité identique de nématodes a été placée dans un tampon de trempage avec le gène dsRNA de la protéine fluorescente verte (gfp) comme témoin. Après trempage, le niveau d’expression des transcrits cibles a été déterminé à l’aide de la PCR quantitative en temps réel. Les effets de l’ARNi ont ensuite été confirmés à l’aide d’une observation microscopique des phénotypes et d’une comparaison de la taille corporelle des adultes parmi les groupes. Le protocole actuel peut aider à faire progresser la recherche pour mieux comprendre les fonctions des gènes de B. xylophilus et d’autres nématodes parasites vers l’élaboration de stratégies de contrôle par génie génétique.
Introduction
Les nématodes phytoparasites (NPP) constituent une menace permanente pour la sécurité alimentaire et les écosystèmes forestiers. Ils causent environ 100 milliards USD de pertes économiques chaque année1, dont les plus problématiques sont principalement les nématodes à galles, les nématodes à kystes et les nématodes du pin. Le nématode du pin, Bursaphelenchus xylophilus, est un nématode endoparasite migrateur, qui est l’agent pathogène causal de la maladie du flétrissement du pin2. Il a causé de grands dommages aux forêts de pins dans le mondeentier 3. En utilisant la terminologie de Van Megen et al.4, B. xylophilus est un membre des Parasitaphelenchidae et appartient au clade 10, alors que la plupart des autres parasites végétaux majeurs appartiennent au clade 12.
En tant que parasite végétal indépendant et récemment évolué, B. xylophilus est un modèle attrayant pour les études comparatives. À ce jour, il y a eu des recherches substantielles sur les nématodes à galles et les nématodes à kystes appartenant au clade 12, qui sont des endoparasites sédentaires obligatoires et qui sont parmi les nématodes les plus étudiés. Cependant, mener d’autres recherches dans ce domaine important s’accompagne d’un défi majeur: la fonction des gènes du parasitisme est un goulot d’étranglement de la recherche. Les études fonctionnelles comprennent généralement des expériences d’expression ectopique et de knockdown/out, mais reposent sur des protocoles de transformation génétique efficaces pour le nématode. En conséquence, la génétique inverse dans les NPP repose presque exclusivement sur le silençage génique par l’ARNi.
L’ARNi, un mécanisme largement présent dans les cellules eucaryotes, réduit au silence l’expression des gènes en introduisant de l’ARN double brin (ARNds)5. À ce jour, le mécanisme de silençage génique post-transcriptionnel induit par l’ARNds a été trouvé chez tous les eucaryotes étudiés, et la technologie ARNi, en tant qu’outil de recherche en génomique fonctionnelle et d’autres applications, s’est développée rapidement dans de nombreux organismes. Depuis la découverte de la machinerie ARNi chez Caenorhabditis elegans en 19986, les techniques ARNi sont devenues des méthodes efficaces pour identifier la fonction génique des nématodes et sont proposées comme une nouvelle façon de lutter efficacement contre les nématodes pathogènes7.
L’ARNi est techniquement facile - tremper les juvéniles dans l’ARNds peut suffire; Cependant, l’efficacité et la reproductibilité de cette approche varient considérablement selon l’espèce de nématode et le gène cible8. Le silençage de 20 gènes impliqués dans les voies ARNi du nématode à galles, Meloidogyne incognita, a été étudié en utilisant de longs ARNd comme déclencheurs, entraînant diverses réponses, y compris une augmentation et aucun changement dans l’expression de certains gènes9. Ces résultats montrent que les gènes cibles peuvent réagir différemment à l’ARNi knockdown, ce qui nécessite une évaluation exhaustive de leur aptitude en tant que cibles pour la lutte contre les nématodes via l’ARNi. Cependant, il y a actuellement peu de recherches sur la biologie du développement et de la reproduction de B. xylophilus.
Dans la continuité des travaux précédents10,11,12,13, nous décrivons ici un protocole d’application de l’ARNi pour étudier la fonction du gène ppm-1 de B. xylophilus, y compris la synthèse de l’ARNds, le trempage des neurostimulants synthétiques et la détection de la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR). Les connaissances acquises grâce à cette approche expérimentale contribueront probablement de façon marquée à la compréhension des systèmes biologiques de base et à la prévention de la maladie du flétrissement du pin.
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Protocol
L’étude a été approuvée par le conseil pour l’expérimentation animale de l’Université agricole et forestière du Zhejiang. L’isolat NXY61 de B. xylophilus a été extrait à l’origine d’un Pinus massoniana malade dans la région de Ningbo de la province du Zhejiang, en Chine11.
1. Clonage génétique
REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur les amorces utilisées dans ce protocole.
- Collectez des nématodes.
- Culture de la souche de B. xylophilus sur le mycélium de Botrytis cinerea sur des plaques de gélose au dextrose de pomme de terre (PDA) à 25 °C pendant 3 à 5 jours.
- Recueillir les nématodes en utilisant la méthode de l’entonnoir de Bellman14.
- Placez un tube en caoutchouc serré sous un entonnoir et placez deux couches de papier filtre dans l’embouchure de l’entonnoir. Transférez les cultures fongiques dans l’entonnoir et ajoutez de l’eau pour immerger le tapis fongique. Attendez 2 h, puis ramassez les nématodes.
- Extraire l’ARN total des nématodes à l’aide d’un réactif d’extraction d’ARN total (voir le tableau des matériaux)11 selon les étapes suivantes.
- Ajouter 500 μL de réactif d’extraction et 100 μL de billes magnétiques à un tube centrifuge de 2 mL. Aspirer 20 μL des nématodes et transférer l’échantillon dans un broyeur pour le broyer à 9 000 × g pendant 30 s. Incuber pendant 5 min puis centrifuger pendant 10 min à 12 000 × g et 4 °C.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger. Ajouter 100 μL de chloroforme, boucher le tube et mélanger en retournant le tube plusieurs fois. Incuber pendant 3 min puis centrifuger pendant 10 min à 12 000 × g à 4 °C.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger. Ajouter 250 μL d’alcool isopropylique et vortex vigoureusement. Centrifuger à 12 000 × g pendant 10 min.
- Jetez le surnageant. Ajouter 500 μL d’éthanol à 75% pour laver l’ARN, puis vortex l’échantillon. Centrifuger pendant 5 min à 12 000 × g et 4 °C.
- Sécher à l’air libre la pastille d’ARN pendant 5 min.
- Remettez la pastille en suspension dans 30 μL d’eau sans RNase.
- Calculer la concentration d’ARN à l’aide de la formule : A260 × dilution × 40 = μg ARN/mL. Calculez le ratio A260/A280.
REMARQUE: Un rapport de ~2 est considéré comme pur.
- Effectuer une transcription inverse d’ARN de bonne qualité pour obtenir le modèle d’ADNc.
- Concevoir et utiliser une paire d’amorces spécifiques, ppm-1-F/R (voir le tableau des matériaux), pour amplifier la séquence codante partielle du gène Bx-ppm-1 chez B. xylophilus (numéro d’acquisition GenBank QTZ96795).
- Cloner les séquences du gène ppm-1 dans le vecteur pGEM-Teasy contenant le promoteur T7 en suivant un protocole de clonage standard11.
- Configurez les réactions PCR comme suit : 2 μL d’ADNc, 25 μL de 2x Prémélange de polymérase Ex Taq, 2 μL de chaque apprêt (10 pmol / l) et eau distillée stérile jusqu’à un volume final de 50 μL.
- Effectuer la procédure d’amplification comme suit: 5 min à 94 °C; suivi de 35 cycles de 30 s à 94 °C, 30 s à 55 °C et 1 min à 72 °C; et une dernière étape d’extension à 72 °C pendant 5 min.
- Cloner les produits amplifiés dans un vecteur pGEM-T Easy pour le séquençage.
2. Synthèse de l’ARNds
- Préparer le modèle d’ADN pour la synthèse de l’ARNds en utilisant la PCR avec des amorces conçues pour ajouter des sites promoteurs T7 aux deux extrémités. Ajouter la séquence promotrice T7 à l’extrémité 5' des amorces.
- Utiliser le plasmide contenant le fragment du gène ppm-1 (894 pb) comme matrice pour la PCR et récupérer le fragment contenant le promoteur T711. Utilisez la procédure et le système de PCR décrits ci-dessus.
- Utilisez un kit de transcription in vitro pour synthétiser dsRNA11.
- Décongeler les réactifs congelés sur la glace.
- Ajouter 2 μL de tampon de réaction 10x, 2 μL de mélange d’enzymes et 1 μg d’ADN dans un tube centrifugeur. Ajouter de l’eau sans nucléase pour produire une réaction standard de 4 μL. Ensuite, mélanger des volumes égaux des quatre solutions de ribonucléotides (ATP, CTP, GTP et UTP) ensemble et ajouter 8 μL du mélange dans le tube. Bien mélanger et incuber à 37 °C pendant 4 h.
- Ajouter 1 μL de DNase, bien mélanger et incuber pendant 15 min à 37 °C.
- Arrêter la réaction et ajouter 30 μL d’eau sans nucléase et 30 μL de solution de précipitation LiCl pour précipiter l’ARN. Mélanger. Incuber à -20 °C pendant une nuit.
- Centrifuger pendant 15 min à 12 000 × g et 4 °C. Jetez le surnageant.
- Ajouter 1 mL d’éthanol à 75% pour laver l’ARN. Tourbillonner l’échantillon et le centrifuger pendant 10 min à 12 000 × g et 4 °C.
- Sécher à l’air la pastille d’ARN pendant 3 min.
- Remettez la pastille en suspension dans 30 μL d’eau sans RNase.
- Analyser la qualité de l’ARNds à l’aide d’un spectrophotomètre. Pipeter 1 μL de l’échantillon dsRNA sur le piédestal de mesure et régler la longueur d’onde à 340 nm. Visualisez les produits sur un gel d’agarose à 1,0 %.
3. ARNi par trempage
- Mélanger 4 μL de tampon de trempage 5x (gélatine à 0,05 %, 5,5 mM KH 2 PO 4, NaCl2,1mM,4,7 mMNH4Cl, 3 mM de spermidine) avec l’ARNds et le ddH2O pour obtenir un volume total de 20 μL etune concentration finale d’ARN de 0,8 μg/mL.
- Acquérir des larves J2.
- Recueillir les nématodes des cultures fongiques et les transférer dans une boîte de Petri en verre de 6 cm de diamètre. Ajouter 10 ml d’eau dans le plat pour que les nématodes puissent nager librement. Gardez les nématodes dans le plat pendant 30 minutes et attendez que les œufs adhèrent au fond.
- Retirez soigneusement l’eau et les nématodes, en veillant à ne pas déranger les œufs. Répétez les étapes jusqu’à ce que toutes les larves et les adultes soient enlevés, ne laissant que les œufs dans le plat.
- Faire éclore les œufs collectés pendant 24 h dans l’obscurité à 25 °C pour obtenir des larves J2. Recueillir les larves J2, les placer dans un tube et les laver trois fois avec ddH2O pour l’expérience ARNi15.
- Transférer les larves J2 dans le tube de 2 mL contenant la solution d’ARNds et ajouter la solution de résorcinol (enveloppée dans du papier d’aluminium et dissoute dans l’eau) pour obtenir une concentration finale de 1,0%. Incuber les larves par centrifugation à 15 × g sur une table à agiter pendant 24 h à 25 °C pour s’assurer que les larves absorbent efficacement l’ARNds.
- Trempez la même quantité de nématodes dans le tampon de trempage sans la sonde dsRNA ou avec une sonde dsRNA GFP comme témoin. Utiliser le gène GFP (gfp, M62653.1) comme témoin non endogène et synthétiser l’ARNds du gfp à l’aide d’amorces spécifiques au gène T7-GFP-F/R.
4. Détection qPCR
- Nettoyez les larves J2 avec ddH2O, y compris celles présentant une interférence du gène cible, une interférence du gène GFP et le groupe témoin non perturbé. Extraire les ARN totaux de chaque groupe en utilisant la méthode décrite ci-dessus.
- Démarrez la qPCR.
- Concevez les amorces q-ppm-1-F/R à l’aide du logiciel souhaité (voir le tableau des matériaux).
- Mettre en place la réaction qPCR dans 12 μL contenant 1 μL d’ADNc, 6 μL de prémélange fluorescent, 0,4 μL de chaque apprêt (10 pmol / l) et de l’eau distillée stérile.
- Effectuer la qPCR comme suit : 2 min à 95 °C ; suivi de 40 cycles de 10 s à 95 °C, 30 s à 55 °C et 1 min à 72 °C.
- Utiliser le gène actb (numéro d’acquisition GenBank EU100952) et le gène tbb-2 (numéro d’accession GenBank MT769316), ou d’autres gènes, comme gènes de référence internes pour évaluer les changements dans le niveau d’expression génique après ARNi15.
- Selon la valeur du seuil de cycle (Ct) et la courbe de dissolution, utilisez la méthode 2-ΔΔCt pour estimer le niveau d’expression relative du gène cible et vérifier l’efficacité d’interférence.
- Soustrayez la valeur Ct du gène de référence interne de chaque échantillon de la valeur Ct du gène cible pour obtenir la valeur ΔCt. Ensuite, soustrayez la valeur ΔCt du groupe d’interférence de la valeur ΔCt du groupe témoin pour obtenir la valeur ΔΔCt.
REMARQUE : Une valeur ΔΔCt supérieure à 0 indique que l’interférence est effective.
- Soustrayez la valeur Ct du gène de référence interne de chaque échantillon de la valeur Ct du gène cible pour obtenir la valeur ΔCt. Ensuite, soustrayez la valeur ΔCt du groupe d’interférence de la valeur ΔCt du groupe témoin pour obtenir la valeur ΔΔCt.
5. Évaluer la longueur corporelle des nématodes adultes après l’ARNi
- Après ARNi, cultiver les larves J2 jusqu’à l’âge adulte sur des pelouses de B. cinerea dans des plaques PDA pendant 60 h à 25 °C15.
- Recueillir les adultes à l’aide de la méthode de l’entonnoir de Bellman (voir étape 1.1.2.1)14.
- Obtenez des images des nématodes adultes au microscope et utilisez le logiciel ImageJ (ou un autre logiciel de mesure) pour mesurer la longueur du corps.
- Mesurez la longueur à l’aide d’ImageJ en sélectionnant Analyser | Définir l’échelle. Si la distance est connue, entrez la valeur de longueur de la ligne droite tracée. Entrez l’unité de longueur.
- Cochez la case Global (utilisez cette norme pour toutes les images), puis cliquez sur OK pour sélectionner la longueur à mesurer avec une ligne droite sur l’image à mesurer.
- Utilisez la commande Ctrl+M (mesure) pour afficher les résultats et les enregistrer dans la fenêtre de résultats .
- Prendre des mesures de 50 nématodes mâles et de 50 nématodes femelles pour analyse statistique12.
- Analysez les données en calculant la moyenne et l’écart-type pour chaque échantillon. Comparez les moyennes des échantillons des différents groupes à l’aide du test t de Student.
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Representative Results
Analyse de l’expression ppm-1 de B. xylophilus après ARNi
Le niveau d’expression relative du gène ppm-1 de B. xylophilus imbibé d’ARNds GFP et celui imbibé du gène cible dsRNA était respectivement de 0,92 et 0,52 (le niveau d’expression génique ppm-1 du groupe témoin traité par ddH2O a été fixé à 1) (Figure 1). Ainsi, l’ARNds exogène n’a aucun effet sur l’expression ppm-1 de B. xylophilus; cependant, ppm-1 dsRNA peut inhiber efficacement l’expression du gène cible.
Effet de l’expression de ppm-1 sur la croissance et le développement de B. xylophilus
Après l’ARNi, la taille des adultes a nettement diminué (Figure 2), ce qui a entraîné le phénotype mutant SMA (petite taille corporelle). Bien que les individus traités par ARNi se soient développés jusqu’à la maturité sexuelle, leur longueur corporelle était considérablement plus petite que celle des adultes normaux. Plus précisément, après l’ARNi chez les nématodes au stade J2, la longueur corporelle moyenne des femelles et des mâles était de 544,61 μm et 526,24 μm, respectivement. En revanche, la longueur corporelle moyenne des femelles et des mâles du groupe témoin était de 971,86 μm et 912,31 μm, respectivement (figure 3), ce qui représente des différences significatives (P = 0,0322).
Figure 1 : Expression du gène ppm-1 suivant l’ARNi de Bursaphelenchus xylophilus. **P < 0,001. Abréviations : ARNi = interférence ARN; GFP = protéine fluorescente verte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Réduction de la longueur corporelle des adultes après l’interférence de ppm-1 chez Bursaphelenchus xylophilus. Images d’un mâle adulte (A) et d’une femelle (C) du groupe ARNi. Images d’un homme adulte (B) et d’une femelle (D) du groupe témoin. Barres d’échelle = 50 μm. Abréviation : ARNi = interférence ARN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Quantification et analyse statistique de la longueur corporelle des adultes de Bursaphelenchus xylophilus après ARNi du gène ppm-1. (*P = 0,0322). Abréviation : ARNi = interférence ARN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Bien que le cycle biologique et l’environnement parasitaire de B. xylophilus soient différents de ceux d’autres nématodes, il y a eu peu de recherches sur la pathogenèse moléculaire de ce phytopathogène. Malgré de grands progrès réalisés dans l’application de la technologie d’édition du génome CRISPR/Cas9 chez C. elegans et d’autres nématodes, seule la technologie ARNi appliquée à B. xylophilus a été publiée à ce jour17. L’ARNi est l’un des outils les plus puissants disponibles pour étudier la fonction génique des nématodes et a été largement utilisé dans la recherche élucidant la fonction du gène B. xylophilus, les voies de transduction du signal et la thérapie génique18,19,20. Contrairement aux approches d’élimination des gènes utilisées dans les modèles d’invertébrés, l’élimination médiée par l’ARNi des gènes cibles chez les nématodes permet une évaluation rapide de la fonction des gènes.
Il existe trois façons de conduire l’ARNi chez C. elegans: injection 6, trempage21 et alimentation6. Étant donné que les larves J2 ne se nourrissent qu’après l’infection, la méthode de trempage est généralement utilisée pour l’ARNi des nématodes phytoparasitaires. L’étape clé de la méthode de trempage consiste à ajouter un agent neurotoxique pour stimuler l’alimentation des nématodes. Urwin a d’abord utilisé l’octopamine pour stimuler le J2 de deux espèces de nématodes à kystes buccaux, Globodera pallida et Heterodera glycines, ce qui a entraîné l’absorption de l’ARNds de la solution de trempage22. La même méthode a été utilisée avec succès pour induire J2 du nématode à galles Meloidogyne incognita à absorber l’ARNds 23. Le résorcinol peut également induire l’absorption de l’ARNds par J2 de M. incognita et peut être plus efficace que l’octopamine pour ce nématode24. De plus, l’ajout de spermidine au tampon de trempage avec un temps d’incubation prolongé a amélioré l’efficacité de l’ARNi chez les nématodes25. Après 24 heures de trempage, l’ARNds pénètre efficacement dans B. xylophilus, réduisant ainsi au silence le gène ppm-1.
Ce protocole fournit donc une référence pour l’étude future de l’ARNi d’autres nématodes phytoparasites ayant un comportement phagocytose. De plus, l’effet de suspension de la table vibrante joue un rôle important dans la maximisation de l’avantage de la méthode de trempage. Cette méthode peut permettre le traitement simultané d’un grand nombre de nématodes. L’ARNi est plus facile à utiliser lorsqu’il se concentre sur les gènes cibles pour lesquels les mutants ne peuvent pas être facilement obtenus et pour évaluer les effets à différents stades du développement, car les nématodes peuvent être trempés à n’importe quel stade de la vie. Ainsi, l’ARNi peut être utilisé pour étudier la fonction d’un gène spécifique à un stade de développement spécifique. Wang et al. ont analysé l’influence du MAPK sur la fécondité de B. xylophilus et son rôle important dans la croissance et le développement des nématodes en utilisant le trempage dsRNA26. Qiu et al. ont constaté que la vitesse de migration et la fécondité de B. xylophilus chez les pins diminuaient après la régulation négative du gène Bxpel1, ce qui indique que ce gène est un facteur pathogène important de B. xylophilus27.
Cependant, tous les ARNi chez les nématodes ne fonctionnent pas par l’intermédiaire de l’ARNds. Dulovic et Streit ont appliqué de petits ARN interférents (siRNA) plutôt que les ARNd plus longs pour interférer avec succès avec Strongyloides ratti28. La limitation de l’utilisation de l’ARNds pour l’ARNi chez les Strongyloides peut être liée à l’absence de gènes tels que rsd-6, sid-1 ou sid-2 connus pour être impliqués dans l’absorption de l’ARNds. L’ARNi est également associé aux inconvénients d’un effet positionnel et d’un knockout temporaire et incomplet et a une efficacité limitée pour certains gènes et types de cellules (tels que les neurones)29. Cependant, jusqu’à ce qu’une percée dans la technologie transgénique de B. xylophilus soit réalisée, l’ARNi représente une stratégie de recherche relativement efficace.
L’ARNi a montré un grand potentiel pour la protection des cultures. À l’aide de la technologie ARNi, des pommes de terre transgéniques capables de produire de l’ARNds ciblant les gènes des nématodes à galles ont été sélectionnées pour produire une résistance complète aux nématodes à galles30. L’expression d’ARNds qui ciblent les gènes des insectes peut assurer la protection des cultures en l’absence d’insecticides chimiques et offre l’avantage supplémentaire de ne pas produire de protéines étrangères, avec un nombre presque illimité de gènes cibles31. Par conséquent, la recherche accélérée dans le domaine de l’ARNi appliqué à la lutte antiparasitaire assurera une meilleure biosécurité pour la lutte contre les nématodes des plantes que les méthodes transgéniques ou d’autres méthodes de lutte chimique.
En conclusion, ce protocole décrit la préparation de l’ARNds du gène ppm-1 pour obtenir l’ARNi en trempant directement les larves de B. xylophilus dans une solution d’ARNds. L’effet d’interférence a été confirmé sur la base d’une réduction significative de la taille corporelle des larves après leur développement en adultes par rapport à celle du témoin, démontrant que le gène ppm-1 exerce des effets sur la croissance et le développement de B. xylophilus. Cette étude fournit une base théorique pour révéler davantage la fonction de ppm-1 avec une valeur pratique supplémentaire pour guider la lutte biologique contre ce parasite végétal. On pense qu’avec la divulgation et l’amélioration du mécanisme de la technologie ARNi, son application dans le domaine de la lutte contre B. xylophilus aura de larges perspectives.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31870637, 31200487) et cofinancée par le Zhejiang Key Research Plan (2019C02024, LGN22C160004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baermann funnel | n/a | n/a | to isolate nematodes |
| Beacon Designer 7.9 | Shanghai kangyusheng information technology co. | n/a | to design qPCR primers |
| Botrytis cinerea | n/a | n/a | as food for nematodes |
| Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China. |
| constant temperature incubator | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. | H1703544 | to cultur nematodes |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad Laboratories | 1704466 | to achieve electrophoretic analysis |
| Ethanol, 75% | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | to extract RNA |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR030A | for PCR |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR390A | for PCR |
| Gel imager | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | to make nucleic acid bands visible |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | n/a | to analyze the data and make figurs |
| High Speed Centrifuge | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | centrifug |
| High-flux tissue grinder | Bertin | to extract RNA | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | n/a | to measure the body lengths |
| isopropyl alcohol | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. | L1909022 | to extract RNA |
| Leica DM4B microscope | Leica Microsystems Inc. | to observe nematodes | |
| magnetic beads | Aoran science technology co. | 150010C | to extract RNA |
| MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | to synthesize dsRNA in vitro |
| NanoDrop ND-2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | to analyze the quality of the dsRNA |
| PCR Amplifier | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | to amplify nucleic acid sequence |
| Petri dishes | n/a | n/a | to cultur nematodes |
| pGEM-T Easy vector | Promega Corporation | A1360 | for cloning |
| Potato Dextrose Agar (Medium) | n/a | n/a | to cultur Botrytis cinerea |
| Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio Inc. | RR047B | to synthetic cDNA |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | to design PCR primers |
| primers:ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
| Real-time thermal cycler qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. | for qPCR | |
| shaking table | Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co. | to soak nematodes | |
| stereoscopic microscope | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | to observe nematodes |
| T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| T7 promoter | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit | Takara Bio Inc. | 9762 | to recover DNA |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | for qPCR |
| trichloroethane | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | to extract RNA | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | total RNA extraction reagent,to extract RNA |
References
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