Summary
Burada, gen fonksiyonlarının incelenmesini kolaylaştırmak için Bursaphelenchus xylophilus'ta RNA girişiminin ayrıntılı bir ıslatma yöntemini tanıtıyoruz.
Abstract
Çam ağacı nematodu Bursaphelenchus xylophilus, dünya çapında en yıkıcı istilacı türlerden biridir ve çam ağaçlarının solmasına ve nihayetinde ölümüne neden olur. Ekonomik ve çevresel önemlerinin tanınmasına rağmen, geleneksel ileri genetik ve transgenik yöntemler kullanarak bitki-parazitik nematodların (PPN'ler) ayrıntılı gen fonksiyonlarını incelemek şimdiye kadar imkansız olmuştur. Bununla birlikte, ters genetik bir teknoloji olarak, RNA girişimi (RNAi), B. xylophilus da dahil olmak üzere nematodların fonksiyonel genlerinin incelenmesini kolaylaştırır.
Bu makalede, diğer patojenik nematodların gelişiminde ve çoğaltılmasında önemli rol oynadığı bildirilen B. xylophilus'taki ppm-1 geninin RNAi için yeni bir protokol özetlenmektedir. RNAi için, T7 promotörü polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile hedef fragmanın 5'-terminaline bağlandı ve çift sarmallı RNA (dsRNA) in vitro transkripsiyon ile sentezlendi. Daha sonra, dsRNA dağıtımı, nematodların sentetik nörostimülanlarla karıştırılmış bir dsRNA çözeltisine batırılmasıyla gerçekleştirildi. B. xylophilus'un senkronize yavruları (yaklaşık 20.000 kişi) yıkandı ve 25 ° C'de karanlıkta 24 saat boyunca ıslatma tamponunda dsRNA'ya (0.8 μg / mL) batırıldı.
Aynı miktarda nematod, kontrol olarak dsRNA olmadan ıslatıcı bir tampona yerleştirildi. Bu arada, aynı miktarda nematod, kontrol olarak yeşil floresan protein (gfp) geni dsRNA ile ıslatma tamponuna yerleştirildi. Islattıktan sonra, hedef transkriptlerin ekspresyon seviyesi gerçek zamanlı kantitatif PCR kullanılarak belirlendi. RNAi'nin etkileri daha sonra fenotiplerin mikroskobik gözlemi ve yetişkinler arasındaki vücut büyüklüğünün karşılaştırılması kullanılarak doğrulandı. Mevcut protokol, genetik mühendisliği yoluyla kontrol stratejileri geliştirmeye yönelik B. xylophilus ve diğer parazitik nematodların genlerinin işlevlerini daha iyi anlamak için araştırmaların ilerlemesine yardımcı olabilir.
Introduction
Bitki-paraziter nematodlar (PPN'ler) gıda güvenliği ve orman ekosistemleri için devam eden bir tehdittir. Her yıl tahmini 100 milyar ABD doları ekonomik kayba neden olurlar1, bunların en sorunlu olanları öncelikle kök-düğüm nematodları, kist nematodları ve çam ağacı nematodlarıdır. Çam ağacı nematodu Bursaphelenchus xylophilus, çam solgunluğu hastalığının nedensel patojeni olan göçmen, endoparaziter bir nematoddur2. Dünya çapında çam ormanlarına büyük zarar vermiştir3. Van Megen ve ark.4'ün terminolojisini kullanarak, B. xylophilus Parasitaphelenchidae'nin bir üyesidir ve klad 10'a aittir, oysa diğer büyük bitki parazitlerinin çoğu klad 12'ye aittir.
Bağımsız ve yakın zamanda evrimleşmiş bir bitki paraziti olan B. xylophilus , karşılaştırmalı çalışmalar için çekici bir modeldir. Bugüne kadar, zorunlu, sedanter endoparazitler olan ve en yoğun çalışılan nematodlardan bazıları olan klad 12'ye ait kök-düğüm nematodları ve kist nematodları hakkında önemli araştırmalar yapılmıştır. Bununla birlikte, bu önemli alanda daha fazla araştırma yapmak büyük bir zorlukla birlikte gelir: parazitizm genlerinin işlevi bir araştırma darboğazıdır. Fonksiyonel çalışmalar genellikle ektopik ekspresyon ve nakavt / çıkış deneylerini içerir, ancak nematod için etkili genetik dönüşüm protokollerine dayanır. Sonuç olarak, PPN'lerdeki ters genetik neredeyse sadece RNAi tarafından gen susturulmasına dayanır.
Ökaryotik hücrelerde yaygın olarak bulunan bir mekanizma olan RNAi, çift sarmallı RNA (dsRNA)5 ekleyerek gen ekspresyonunu susturur. Bugüne kadar, dsRNA tarafından indüklenen posttranskripsiyonel gen susturma mekanizması, çalışılan tüm ökaryotlarda bulunmuştur ve fonksiyonel genomik araştırmaların ve diğer uygulamaların bir aracı olarak RNAi teknolojisi, birçok organizmada hızla gelişmiştir. 1998 yılında Caenorhabditis elegans'ta RNAi makinesinin keşfinden bu yana6, RNAi teknikleri nematodların gen fonksiyonunu tanımlamak için etkili yöntemler haline gelmiştir ve patojenik nematodları etkili bir şekilde kontrol etmenin yeni bir yolu olarak önerilmiştir7.
RNAi teknik olarak gençleri dsRNA'ya batırmak yeterli olabilir; Bununla birlikte, bu yaklaşımın etkinliği ve tekrarlanabilirliği, nematod türleri ve hedef gen8 ile büyük ölçüde değişmektedir. Kök-düğüm nematodunun RNAi yollarında yer alan 20 genin susturulması, Meloidogyne incognita, tetikleyici olarak uzun dsRNA'lar kullanılarak araştırıldı ve bazı genlerin ekspresyonunda bir artış ve hiçbir değişiklik olmaması da dahil olmak üzere çeşitli tepkilerle sonuçlandı9. Bu sonuçlar, hedef genlerin RNAi nakavtına farklı tepki verebileceğini ve RNAi yoluyla nematod kontrolü için hedef olarak uygunluklarının kapsamlı bir değerlendirmesini gerektirdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, şu anda B. xylophilus'un gelişim ve üreme biyolojisi üzerine araştırma yetersizliği vardır.
Önceki çalışmanın devamı olarak10,11,12,13, burada dsRNA sentezi, sentetik nörostimülan ıslatma ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) tespiti dahil olmak üzere B. xylophilus'un ppm-1 geninin işlevini incelemek için RNAi'nin uygulanması için bir protokol açıklıyoruz. Bu deneysel yaklaşımdan elde edilen bilgiler muhtemelen temel biyolojik sistemlerin anlaşılmasına ve çam solgunluğu hastalığının önlenmesine önemli ölçüde katkıda bulunacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma, Zhejiang Tarım ve Ormancılık Üniversitesi hayvan deneyleri konseyi tarafından onaylandı. B. xylophilus izolatı NXY61, başlangıçta Çin'in Zhejiang eyaletinin Ningbo bölgesindeki hastalıklı bir Pinus massoniana'dan çıkarıldı11.
1. Gen klonlama
NOT: Bu protokolde kullanılan astarlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
- Nematodları toplayın.
- Kültür B. xylophilus , 3-5 gün boyunca 25 ° C'de Patates Dekstroz Agar (PDA) plakaları üzerindeki Botrytis cinerea'nın miselyası üzerinde gerilir.
- Bellman huni yöntemi14'ü kullanarak nematodları toplayın.
- Bir huninin altına kelepçelenmiş bir lastik tüp yerleştirin ve huninin ağzına iki kat filtre kağıdı yerleştirin. Mantar kültürlerini huniye aktarın ve mantar paspasını batırmak için su ekleyin. 2 saat bekleyin, ardından nematodları toplayın.
- Aşağıdaki adımlara göre, toplam RNA ekstraksiyon reaktifi kullanarak nematodlardan toplam RNA'yı çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız)11 .
- 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne 500 μL ekstraksiyon reaktifi ve 100 μL manyetik boncuk ekleyin. Nematodların 20 μL'sini aspire edin ve numuneyi 30 s için 9.000 × g'da öğütmek üzere bir öğütücüye aktarın. 5 dakika boyunca inkübe edin ve ardından 12.000 × g ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. 100 μL kloroform ekleyin, tüpü kapatın ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın. 3 dakika boyunca inkübe edin ve ardından 4 ° C'de 12.000 × g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. 250 μL izopropil alkol ve vorteksi kuvvetli bir şekilde ekleyin. 10 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj.
- Süper natantı atın. RNA'yı yıkamak için 500 μL% 75 etanol ekleyin ve ardından numuneyi vorteksleyin. 12.000 × g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüj yapın.
- RNA peletini 5 dakika boyunca hava ile kurutun.
- Peleti 30 μL RNaz içermeyen suda yeniden askıya alın.
- Formülü kullanarak RNA konsantrasyonunu hesaplayın: A260 × seyreltme × 40 = μg RNA / mL. A260/A280 oranını hesaplayın.
NOT: ~2 oranı saf olarak kabul edilir.
- cDNA şablonunu elde etmek için kaliteli RNA'nın ters transkripsiyonunu gerçekleştirin.
- B. xylophilus'taki Bx-ppm-1 geninin kısmi kodlama dizisini yükseltmek için ppm-1-F / R (Malzeme Tablosuna bakınız) bir çift spesifik primer tasarlayın ve kullanın (GenBank katılım numarası QTZ96795).
- ppm-1 gen dizilerini, standart bir klonlama protokolü11'i izleyerek T7 promotörünü içeren pGEM-Teasy vektörüne klonlayın.
- PCR reaksiyonlarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 2 μL cDNA, 25 μL 2x Ex Taq Polimeraz Premiks, her astardan 2 μL (10 pmol / l) ve steril damıtılmış su 50 μL'lik son hacme kadar.
- Amplifikasyon prosedürünü aşağıdaki gibi uygulayın: 94 ° C'de 5 dakika; bunu 94 °C'de 30 sn, 55 °C'de 30 s ve 72 °C'de 1 dk'lık 35 döngü izledi; ve 5 dakika boyunca 72 °C'de son bir uzatma adımı.
- Güçlendirilmiş ürünleri sıralama için bir pGEM-T Kolay vektöre klonlayın.
2. dsRNA sentezi
- Her iki uca T7 promotör bölgeleri eklemek için tasarlanmış primerlerle PCR kullanarak dsRNA sentezi için DNA şablonunu hazırlayın. T7 promotör dizisini astarların 5' ucuna ekleyin.
- PCR şablonu olarak ppm-1 gen fragmanını (894 bp) içeren plazmidi kullanın ve T7 promotörü11'i içeren parçayı kurtarın. Yukarıda açıklanan PCR prosedürünü ve sistemini kullanın.
- DsRNA11'i sentezlemek için bir in vitro transkripsiyon kiti kullanın.
- Dondurulmuş reaktifleri buz üzerinde çözün.
- Bir santrifüj tüpüne 2 μL 10x reaksiyon tamponu, 2 μL enzim karışımı ve 1 μg DNA ekleyin. Standart bir 4 μL reaksiyon üretmek için nükleaz içermeyen su ekleyin. Daha sonra, dört ribonükleotid çözeltisinin (ATP, CTP, GTP ve UTP) eşit hacimlerini karıştırın ve karışımın 8 μL'sini tüpe ekleyin. İyice karıştırın ve 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- 1 μL DNaz ekleyin, iyice karıştırın ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Reaksiyonu durdurun ve RNA'yı çökeltmek için 30 μL nükleaz içermeyen su ve 30 μL LiCl çökeltme çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın. Gece boyunca -20 ° C'de inkübe edin.
- 12.000 × g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüj. Süper natantı atın.
- RNA'yı yıkamak için 1 mL% 75 etanol ekleyin. Numuneyi vorteksleyin ve 12.000 × g ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
- RNA peletini 3 dakika boyunca hava ile kurutun.
- Peleti 30 μL RNaz içermeyen suda yeniden askıya alın.
- Bir spektrofotometre kullanarak dsRNA'nın kalitesini analiz edin. Ölçüm kaidesine dsRNA numunesinin 1 μL'lik pipeti ve dalga boyunu 340 nm olarak ayarlayın. Ürünleri %1.0'lık bir agaroz jeli üzerinde görselleştirin.
3. Sırılsıklam ederek RNAi
- Toplam 20 μL hacim ve 0,8 μg / mL'lik bir son RNA konsantrasyonu üretmek için dsRNA ve ddH 2 O ile 4 μL 5x ıslatma tamponunu (% 0,05 jelatin, 5,5 mM KH 2PO 4, 2,1 mM NaCl, 4,7 mM NH4Cl, 3 mM spermidin) karıştırın.
- J2 larvalarını edinin.
- Nematodları mantar kültürlerinden toplayın ve 6 cm çapında bir cam Petri kabına aktarın. Nematodların serbestçe yüzebilmelerini sağlamak için yemeğe 10 mL su ekleyin. Nematodları 30 dakika boyunca tabakta tutun ve yumurtaların dibe yapışmasını bekleyin.
- Yumurtaları rahatsız etmediğinizden emin olarak suyu ve nematodları dikkatlice çıkarın. Tüm larvalar ve yetişkinler çıkarılana kadar adımları tekrarlayın, sadece yumurtaları tabakta bırakın.
- J2 larvalarını elde etmek için toplanan yumurtaları karanlıkta 25 ° C'de 24 saat boyunca yumurtadan çıkarın. J2 larvalarını toplayın, bir tüpe yerleştirin ve RNAi deneyi15 için ddH2O ile üç kez yıkayın.
- J2 larvalarını dsRNA çözeltisini içeren 2 mL tüpe aktarın ve% 1.0'lık bir nihai konsantrasyon üretmek için resorsinol çözeltisi (infoil içine sarılmış ve suda çözülmüş) ekleyin. Larvaların dsRNA'yı etkili bir şekilde emmesini sağlamak için larvaları 25 ° C'de 24 saat boyunca sallanan bir masada 15 × g'de santrifüjleme ile inkübe edin.
- Aynı miktarda nematodları, dsRNA probu olmadan veya kontrol olarak bir GFP dsRNA probu ile ıslatma tamponuna batırın. GFP genini (gfp, M62653.1) endojen olmayan bir kontrol olarak kullanın ve gen-spesifik primerler T7-GFP-F / R kullanarak gfp'nin dsRNA'sını sentezleyin.
4. qPCR algılama
- J2 larvalarını, hedef gen girişimi, GFP gen girişimi ve bozulmamış kontrol grubu olanlar da dahil olmak üzere ddH2O ile temizleyin. Yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak her gruptan toplam RNA'ları çıkarın.
- qPCR'yi başlatın.
- İstenilen yazılımı kullanarak q-ppm-1-F/R astarlarını tasarlayın (bkz.
- qPCR reaksiyonunu 1 μL cDNA, 6 μL floresan premiks, her astarın 0,4 μL'si (10 pmol/l) ve steril damıtılmış su içeren 12 μL'de ayarlayın.
- qPCR'yi aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 95 °C'de 2 dakika; bunu 95 °C'de 10 sn, 55 °C'de 30 sn ve 72 °C'de 1 dk'lık 40 döngü izledi.
- RNAi15'ten sonra gen ekspresyon seviyesindeki değişiklikleri değerlendirmek için actb genini (GenBank katılım numarası EU100952) ve tbb-2 genini (GenBank katılım numarası MT769316) veya diğer genleri dahili referans genleri olarak kullanın.
- Döngü eşiği (Ct) değerine ve çözünme eğrisine göre, hedef genin göreceli ekspresyon seviyesini tahmin etmek ve girişim verimliliğini doğrulamak için 2-ΔΔCt yöntemini kullanın.
- ΔCt değerini elde etmek için her numunenin iç referans geninin Ct değerini hedef genin Ct değerinden çıkarın. Ardından, ΔΔCt değerini elde etmek için girişim grubunun ΔCt değerini kontrol grubunun ΔCt değerinden çıkarın.
NOT: 0'dan büyük bir ΔΔCt değeri, girişimin etkili olduğunu gösterir.
- ΔCt değerini elde etmek için her numunenin iç referans geninin Ct değerini hedef genin Ct değerinden çıkarın. Ardından, ΔΔCt değerini elde etmek için girişim grubunun ΔCt değerini kontrol grubunun ΔCt değerinden çıkarın.
5. RNAi'yi takip eden nematod yetişkinlerinin vücut uzunluğunu değerlendirin
- RNAi'den sonra, J2 larvalarını yetişkinliğe kadar PDA plakalarındaki B. cinerea çimlerinde 25 ° C15'te 60 saat boyunca kültürleyin.
- Bellman huni yöntemini kullanarak yetişkinleri toplayın (bkz. adım 1.1.2.1)14.
- Yetişkin nematodların görüntülerini mikroskop altında elde edin ve vücut uzunluklarını ölçmek için ImageJ yazılımını (veya başka bir ölçüm yazılımını) kullanın.
- Analiz Et'i seçerek ImageJ'yi kullanarak uzunluğu ölçün | Ölçeği ayarlayın. Mesafe biliniyorsa, çizilen düz çizginin uzunluk değerini girin. Uzunluk birimini girin.
- Genel onay kutusunu işaretleyin (tüm resimler için bu standardı kullanın) ve ölçülecek görüntü üzerinde düz bir çizgiyle ölçülecek uzunluğu seçmek için Tamam'ı tıklatın.
- Sonuçları görüntülemek ve sonuçlar penceresine kaydetmek için Ctrl+M (ölçüm) komutunu kullanın.
- İstatistiksel analiz için 50 erkek ve 50 dişi nematodun ölçümlerini alın12.
- Her numune için ortalama ve standart sapmayı hesaplayarak verileri analiz edin. Öğrencinin t-testini kullanarak farklı gruplardan örneklerin araçlarını karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RNAi sonrası B. xylophilus'un ppm-1 ekspresyonunun analizi
GFP dsRNA ile ıslatılmış ve hedef gen dsRNA ile ıslatılmış olan B. xylophilus'un ppm-1 geninin göreceli ekspresyon seviyesi sırasıyla 0.92 ve 0.52 idi (ddH2O ile tedavi edilen kontrol grubunun ppm-1 gen ekspresyon seviyesi 1 olarak ayarlandı) (Şekil 1). Bu nedenle, eksojen dsRNA'nın B. xylophilus'un ppm-1 ekspresyonu üzerinde hiçbir etkisi yoktur; Bununla birlikte, ppm-1 dsRNA, hedef genin ekspresyonunu etkili bir şekilde inhibe edebilir.
PPM-1 ekspresyonunun B. xylophilus'un büyümesi ve gelişimi üzerine etkisi
RNAi'den sonra, yetişkinlerin boyutu belirgin bir şekilde azaldı (Şekil 2), SMA (küçük vücut boyutu) mutant fenotipine neden oldu. RNAi ile tedavi edilen bireyler cinsel olgunluğa kadar gelişmiş olsalar da, vücut uzunlukları normal yetişkinlerden önemli ölçüde daha küçüktü. Spesifik olarak, J2 evre nematodlarda RNAi'den sonra, kadın ve erkeklerin ortalama vücut uzunluğu sırasıyla 544.61 μm ve 526.24 μm idi. Buna karşılık, kontrol grubundaki kadın ve erkeklerin ortalama vücut uzunlukları sırasıyla 971.86 μm ve 912.31 μm idi (Şekil 3), anlamlı farklılıkları temsil ediyordu (P = 0.0322).
Şekil 1: Bursaphelenchus xylophilus'un RNAi'sini takiben ppm-1 geninin ekspresyonu. **P 0,001 <. Kısaltmalar: RNAi = RNA girişimi; GFP = yeşil floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bursaphelenchus xylophilus'ta ppm-1'in girişiminden sonra yetişkinlerin vücut uzunluklarının azalması. RNAi grubunun yetişkin bir erkek (A) ve dişi (C) görüntüleri. Kontrol grubundan yetişkin bir erkek (B) ve dişi (D) görüntüleri. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltma: RNAi = RNA girişimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bursaphelenchus xylophilus'un yetişkinlerinin ppm-1 geninin RNAi'sinden sonra vücut uzunluğunun nicelleştirilmesi ve istatistiksel analizi. (*P = 0,0322). Kısaltma: RNAi = RNA girişimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
B. xylophilus'un yaşam öyküsü ve paraziter ortamı diğer nematodlarınkinden farklı olmasına rağmen, bu bitki patojeninin moleküler patogenezi hakkında sınırlı araştırma yapılmıştır. C. elegans ve diğer nematodlarda CRISPR / Cas9 genom düzenleme teknolojisinin uygulanmasında büyük ilerleme kaydedilmesine rağmen, bugüne kadar sadece B. xylophilus'a uygulanan RNAi teknolojisiyayınlanmıştır 17. RNAi, nematodların gen fonksiyonunu incelemek için mevcut en güçlü araçlardan biridir ve B. xylophilus gen fonksiyonunu, sinyal iletim yollarını ve gen terapisini aydınlatan araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır18,19,20. Omurgasız modellerde kullanılan gen nakavt yaklaşımlarının aksine, nematodlarda hedef genlerin RNAi aracılı nakavtları, gen fonksiyonunun hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
C. elegans'ta RNAi'yi iletmenin üç yolu vardır: enjeksiyon 6,ıslatma 21 ve besleme6. J2 larvaları sadece enfeksiyondan sonra beslendiğinden, ıslatma yöntemi tipik olarak bitki-parazitik nematodların RNAi'si için kullanılır. Islatma yöntemindeki en önemli adım, nematodları beslenmeye teşvik etmek için bir sinir ajanı eklemektir. Urwin ilk olarak iki oral kist nematod türü olan Globodera pallida ve Heterodera glisinlerinin J2'sini uyarmak için ahtapotamin kullandı ve bu da dsRNA'nın ıslatma çözeltisi22'den alınmasına neden oldu. Aynı yöntem, dsRNA 23'ü emmek için kök-düğüm nematodu Meloidogyne incognita'nın J2'sini indüklemek için başarıyla kullanılmıştır. Resorsinol ayrıca M. incognita'nın J2'si tarafından dsRNA alımını indükleyebilir ve bu nematod24 için ahtapotandan daha etkili olabilir. Ayrıca, uzun bir kuluçka süresi ile ıslatma tamponuna spermidin eklenmesi, nematodlarda RNAi'nin etkinliğini arttırmıştır25. 24 saatlik ıslatmadan sonra, dsRNA etkili bir şekilde B. xylophilus'a girer, böylece ppm-1 genini susturur.
Bu nedenle bu protokol, fagositoz davranışı olan diğer bitki-parazitik nematodların RNAi'sinin gelecekteki çalışması için bir referans sağlar. Ek olarak, sallama tablasının süspansiyon etkisi, ıslatma yönteminin avantajını en üst düzeye çıkarmada önemli bir rol oynar. Bu yöntem, çok sayıda nematodun eşzamanlı tedavisine izin verebilir. RNAi, mutantların kolayca elde edilemediği hedef genlere odaklandığında ve gelişimin farklı noktalarındaki etkileri değerlendirmek için daha kolaydır, çünkü nematodlar herhangi bir yaşam aşamasında ıslatılabilir. Böylece, RNAi, belirli bir gelişim aşamasında belirli bir genin işlevini incelemek için kullanılabilir. Wang ve ark., MAPK'nin B. xylophilus'un doğurganlığı üzerindeki etkisini ve dsRNA ıslatma26 kullanarak nematodların büyümesi ve gelişmesindeki önemli rolünü analiz ettiler. Qiu ve ark., B. xylophilus'un çam ağaçlarında göç hızının ve doğurganlığının, Bxpel1 geninin aşağı regülasyonundan sonra azaldığını bulmuşlardır, bu da bu genin B. xylophilus 27'nin önemli bir patojenik faktörü olduğunu göstermektedir.
Bununla birlikte, nematodlardaki tüm RNAi'ler dsRNA ile çalışmaz. Dulovic ve Streit, Strongyloides ratti28'e başarılı bir şekilde müdahale etmek için daha uzun dsRNA'lar yerine küçük müdahale eden RNA'lar (siRNA'lar) uyguladılar. Strongyloides'te RNAi için dsRNA kullanmanın sınırlandırılması, dsRNA alımında rol oynadığı bilinen rsd-6, sid-1 veya sid-2 gibi genlerin yokluğu ile ilişkili olabilir. RNAi ayrıca konumsal bir etkinin ve geçici ve eksik nakavtın dezavantajları ile ilişkilidir ve bazı genler ve hücre tipleri (nöronlar gibi) için sınırlı etkinliğe sahiptir29. Bununla birlikte, B. xylophilus'un transgenik teknolojisinde bir atılım sağlanana kadar, RNAi nispeten etkili bir araştırma stratejisini temsil eder.
RNAi, mahsul koruması için büyük bir potansiyel göstermiştir. RNAi teknolojisini kullanarak, kök-düğüm nematod genlerini hedef alan dsRNA üretebilen transgenik patatesler, kök-düğüm nematodlarına karşı tam direnç üretmek için yetiştirilmiştir30. Böcek genlerini hedef alan dsRNA'ların ekspresyonu, kimyasal böcek öldürücülerin yokluğunda mahsul koruması sağlayabilir ve neredeyse sınırsız sayıda hedef gen ile yabancı proteinler üretmemenin ek avantajını sunar31. Bu nedenle, haşere kontrolü için uygulanan RNAi alanında hızlandırılmış araştırmalar, bitki nematodu kontrolü için transgenik yöntemlerden veya diğer kimyasal kontrol yöntemlerinden daha iyi biyogüvenlik sağlayacaktır.
Sonuç olarak, bu protokol, B. xylophilus larvalarını doğrudan dsRNA çözeltisine batırarak RNAi'yi elde etmek için ppm-1 geninin dsRNA'sının hazırlanmasını açıklar. Girişim etkisi, larvaların yetişkinlere dönüştükten sonra vücut büyüklüğünde, kontrole kıyasla önemli bir azalmaya dayanarak doğrulandı ve ppm-1 geninin B. xylophilus'un büyümesi ve gelişimi üzerinde etkileri olduğunu gösterdi. Bu çalışma, ppm-1'in işlevini, bu bitki parazitinin biyolojik kontrolüne rehberlik etmede ek pratik değerle daha da ortaya çıkarmak için teorik bir temel sunmaktadır. RNAi teknoloji mekanizmasının daha fazla açıklanması ve iyileştirilmesiyle, B. xylophilus kontrolü alanındaki uygulamasının geniş umutlara sahip olacağına inanılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Herhangi bir çıkar çatışması ilan edilmedi.
Acknowledgments
Bu araştırma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31870637, 31200487) tarafından finanse edildi ve Zhejiang Anahtar Araştırma Planı (2019C02024, LGN22C160004) tarafından ortaklaşa finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baermann funnel | n/a | n/a | to isolate nematodes |
| Beacon Designer 7.9 | Shanghai kangyusheng information technology co. | n/a | to design qPCR primers |
| Botrytis cinerea | n/a | n/a | as food for nematodes |
| Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China. |
| constant temperature incubator | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. | H1703544 | to cultur nematodes |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad Laboratories | 1704466 | to achieve electrophoretic analysis |
| Ethanol, 75% | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | to extract RNA |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR030A | for PCR |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR390A | for PCR |
| Gel imager | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | to make nucleic acid bands visible |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | n/a | to analyze the data and make figurs |
| High Speed Centrifuge | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | centrifug |
| High-flux tissue grinder | Bertin | to extract RNA | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | n/a | to measure the body lengths |
| isopropyl alcohol | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. | L1909022 | to extract RNA |
| Leica DM4B microscope | Leica Microsystems Inc. | to observe nematodes | |
| magnetic beads | Aoran science technology co. | 150010C | to extract RNA |
| MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | to synthesize dsRNA in vitro |
| NanoDrop ND-2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | to analyze the quality of the dsRNA |
| PCR Amplifier | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | to amplify nucleic acid sequence |
| Petri dishes | n/a | n/a | to cultur nematodes |
| pGEM-T Easy vector | Promega Corporation | A1360 | for cloning |
| Potato Dextrose Agar (Medium) | n/a | n/a | to cultur Botrytis cinerea |
| Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio Inc. | RR047B | to synthetic cDNA |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | to design PCR primers |
| primers:ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
| Real-time thermal cycler qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. | for qPCR | |
| shaking table | Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co. | to soak nematodes | |
| stereoscopic microscope | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | to observe nematodes |
| T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| T7 promoter | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit | Takara Bio Inc. | 9762 | to recover DNA |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | for qPCR |
| trichloroethane | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | to extract RNA | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | total RNA extraction reagent,to extract RNA |
References
- Nicol, J. M., et al. Current nematode threats to world agriculture. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C. , Springer. Dordrecht. 21-43 (2011).
- Jones, J. T., et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).
- Kikuchi, T., et al. Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219 (2011).
- Megen, H. V., et al. A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences. Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).
- Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes. African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).
- Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).
- Marmonier, A., et al. In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266 (2019).
- Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes. Frontiers in Plant Science. 11, 328 (2020).
- Zhou, L. F., et al. Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pathology. 51 (1), 12647 (2021).
- Zhou, L. F., et al. The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).
- Tang, J., et al. Bxy-fuca encoding α-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).
- Wang, J. H., et al. Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Forestry Research. , (2021).
- Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications. Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).
- Zhu, N., et al. Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842 (2016).
- Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages. Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).
- Wang, M., et al. Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants. International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).
- Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference. Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).
- Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).
- Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215 (2019).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
- Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).
- Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).
- Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).
- Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).
- Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese). Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).
- Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125 (2016).
- Dulovic, A., Streit, A. RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705 (2019).
- Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. Research progress of gene editing technology. Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).
- Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection. Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).
- Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection. Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).
