Summary
Her introducerer vi en detaljeret blødgøringsmetode for RNA-interferens i Bursaphelenchus xylophilus for at lette undersøgelsen af genfunktioner.
Abstract
Fyrretræsnematoden, Bursaphelenchus xylophilus, er en af de mest destruktive invasive arter på verdensplan, der forårsager visning og eventuel død af fyrretræer. På trods af anerkendelsen af deres økonomiske og miljømæssige betydning har det hidtil været umuligt at studere de detaljerede genfunktioner af planteparasitiske nematoder (PPN'er) ved hjælp af konventionel fremadrettet genetik og transgene metoder. Som en omvendt genetikteknologi letter RNA-interferens (RNAi) imidlertid undersøgelsen af de funktionelle gener af nematoder, herunder B. xylophilus.
Dette papir skitserer en ny protokol for RNAi af ppm-1-genet i B. xylophilus, som er blevet rapporteret at spille afgørende roller i udviklingen og reproduktionen af andre patogene nematoder. For RNAi var T7-promotoren forbundet med 5′-terminalen af målfragmentet ved polymerasekædereaktion (PCR), og dobbeltstrenget RNA (dsRNA) blev syntetiseret ved in vitro-transkription . Efterfølgende blev dsRNA-levering opnået ved at blødgøre nematoderne i en dsRNA-opløsning blandet med syntetiske neurostimulerende midler. Synkroniserede unge b . xylophilus (ca. 20.000 individer) blev vasket og gennemblødt i dsRNA (0,8 μg/ml) i blødgøringsbufferen i 24 timer i mørke ved 25 °C.
Den samme mængde nematoder blev anbragt i en blødgøringsbuffer uden dsRNA som en kontrol. I mellemtiden blev en anden identisk mængde nematoder anbragt i en blødgøringsbuffer med grønt fluorescerende protein (gfp) gen dsRNA som en kontrol. Efter blødgøring blev ekspressionsniveauet for måludskrifterne bestemt ved hjælp af kvantitativ PCR i realtid. Virkningerne af RNAi blev derefter bekræftet ved hjælp af mikroskopisk observation af fænotyperne og en sammenligning af kropsstørrelsen hos de voksne blandt grupperne. Den nuværende protokol kan hjælpe med at fremme forskning for bedre at forstå funktionerne i generne af B. xylophilus og andre parasitære nematoder mod udvikling af kontrolstrategier gennem genteknologi.
Introduction
Planteparasitiske nematoder (PPN'er) er en fortsat trussel mod fødevaresikkerheden og skovøkosystemerne. De forårsager anslået 100 milliarder USD i økonomiske tab hvert år1, hvoraf de mest problematiske primært er rodknude nematoder, cyste nematoder og fyrretræ nematoder. Pinewood nematoden, Bursaphelenchus xylophilus, er en vandrende, endoparasitisk nematode, som er årsagspatogenet for pine wilt disease2. Det har forårsaget stor skade på fyrreskove over hele verden3. Ved hjælp af terminologien i Van Megen et al.4 er B. xylophilus medlem af Parasitaphelenchidae og tilhører klade 10, mens de fleste andre større planteparasitter tilhører klade 12.
Som en uafhængig og nyligt udviklet planteparasit er B. xylophilus en attraktiv model for sammenlignende undersøgelser. Til dato har der været betydelig forskning på rodknude nematoder og cyste nematoder tilhørende klade 12, som er obligatoriske, stillesiddende endoparasitter og er nogle af de mest intenst studerede nematoder. At udføre yderligere forskning på dette vigtige område kommer imidlertid med en stor udfordring: funktionen af parasitismegener er en forskningsflaskehals. Funktionelle undersøgelser omfatter generelt ektopisk ekspression og knockdown / out eksperimenter, men er afhængige af effektive genetiske transformationsprotokoller for nematoden. Som følge heraf er omvendt genetik i PPN'er næsten udelukkende afhængig af genhæmning af RNAi.
RNAi, en mekanisme, der er bredt til stede i eukaryote celler, dæmper genekspression ved at indføre dobbeltstrenget RNA (dsRNA)5. Til dato er den posttranskriptionelle genhæmningsmekanisme induceret af dsRNA fundet i alle studerede eukaryoter, og RNAi-teknologi, som et værktøj til funktionel genomforskning og andre applikationer, har udviklet sig hurtigt i mange organismer. Siden opdagelsen af RNAi-maskineriet i Caenorhabditis elegans i 19986 er RNAi-teknikker blevet effektive metoder til at identificere nematoders genfunktion og foreslås som en ny måde til effektivt at kontrollere patogene nematoder7.
RNAi er teknisk letkøbt at blødgøre de unge i dsRNA kan være tilstrækkeligt; Effektiviteten og reproducerbarheden af denne tilgang varierer imidlertid meget med nematodearten og målgenet8. Hæmning af 20 gener involveret i RNAi-veje i rodknude nematoden, Meloidogyne incognita, blev undersøgt ved hjælp af lange dsRNA'er som udløsere, hvilket resulterede i forskellige reaktioner, herunder en stigning og ingen ændring i ekspressionen af nogle gener9. Disse resultater viser, at målgener kan reagere forskelligt på RNAi knockdown, hvilket nødvendiggør en udtømmende vurdering af deres egnethed som mål for nematodekontrol via RNAi. Imidlertid er der i øjeblikket en mangel på forskning om udviklings- og reproduktionsbiologi af B. xylophilus.
Som en fortsættelse af tidligere arbejde 10,11,12,13 beskriver vi her en protokol til anvendelse af RNAi til at studere funktionen af ppm-1-genet af B. xylophilus, herunder syntesen af dsRNA, syntetisk neurostimulerende blødgøring og kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) detektion. Den viden, der opnås fra denne eksperimentelle tilgang, vil sandsynligvis bidrage markant til at forstå grundlæggende biologiske systemer og forebygge pine wilt sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen blev godkendt af rådet for dyreforsøg ved Zhejiang Agricultural &forestry university. B. xylophilus-isolatet NXY61 blev oprindeligt ekstraheret fra en syg Pinus massoniana i Ningbo-området i Zhejiang-provinsen, Kina11.
1. Kloning af gen
BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer om de primere, der anvendes i denne protokol.
- Saml nematoder.
- B. xylophilus-stammen dyrkes på mycelia af Botrytis cinerea på Kartoffel Dextrose Agar (PDA) plader ved 25 °C i 3-5 dage.
- Saml nematoderne ved hjælp af Bellman-tragtmetoden14.
- Anbring et fastspændt gummirør under en tragt, og læg to lag filterpapir i tragtens munding. Overfør svampekulturerne til tragten og tilsæt vand for at nedsænke svampemåtten. Vent i 2 timer, og saml derefter nematoderne.
- Ekstraher det samlede RNA fra nematoderne ved hjælp af et totalt RNA-ekstraktionsreagens (se materialetabellen)11 i henhold til følgende trin.
- Der tilsættes 500 μL ekstraktionsreagens og 100 μL magnetiske perler til et 2 ml centrifugerør. Symat 20 μL af nematoderne og overfør prøven til en slibemaskine til slibning ved 9.000 × g i 30 s. Inkuberes i 5 minutter, og centrifuger derefter i 10 minutter ved 12.000 × g og 4 °C.
- Overfør supernatanten til et nyt centrifugerør. Tilsæt 100 μL chloroform, dæk røret, og bland ved at invertere røret flere gange. Inkuberes i 3 minutter, og centrifuger derefter i 10 minutter ved 12.000 × g ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til et nyt centrifugerør. Der tilsættes 250 μL isopropylalkohol og hvirvel kraftigt. Centrifuger ved 12.000 × g i 10 min.
- Kassér supernatanten. Tilsæt 500 μL 75% ethanol for at vaske RNA'et og hvirvel derefter prøven. Centrifuger den i 5 minutter ved 12.000 × g og 4 °C.
- Lufttør RNA-pelleten i 5 min.
- Resuspender pelleten i 30 μL RNase-frit vand.
- Rna-koncentrationen beregnes ved hjælp af formlen: A260 × fortynding × 40 = μg RNA / ml. Beregn A260/A280-forholdet.
BEMÆRK: Et forhold på ~ 2 betragtes som rent.
- Udfør omvendt transkription af RNA af god kvalitet for at opnå cDNA-skabelonen.
- Design og brug et par specifikke primere, ppm-1-F / R (se materialetabellen), til at forstærke den delvise kodningssekvens af Bx-ppm-1-genet i B. xylophilus (GenBank-tiltrædelsesnummer QTZ96795).
- Klon ppm-1-gensekvenserne i pGEM-Teasy-vektoren, der indeholder T7-promotoren efter en standardkloningsprotokol11.
- PCR-reaktionerne indstilles som følger: 2 μL cDNA, 25 μL 2x Ex Taq Polymerase Premix, 2 μL af hver primer (10 pmol/l) og sterilt destilleret vand til et slutvolumen på 50 μL.
- Udfør forstærkningsproceduren som følger: 5 minutter ved 94 °C; efterfulgt af 35 cyklusser på 30 s ved 94 °C, 30 s ved 55 °C og 1 min ved 72 °C og et sidste forlængelsestrin ved 72 °C i 5 min.
- Klon de forstærkede produkter til en pGEM-T Easy vektor til sekventering.
2. Syntese af dsRNA
- Forbered DNA-skabelonen til dsRNA-syntese ved hjælp af PCR med primere designet til at tilføje T7-promotorsteder i begge ender. Tilføj T7-promotorsekvensen til 5'-enden af primerne.
- Brug plasmidet indeholdende ppm-1-genfragmentet (894 bp) som skabelon for PCR, og genvind fragmentet indeholdende T7-promotoren11. Brug PCR-proceduren og systemet beskrevet ovenfor.
- Brug et in vitro transkriptionssæt til at syntetisere dsRNA11.
- Optø de frosne reagenser på is.
- Der tilsættes 2 μL 10x reaktionsbuffer, 2 μL enzymblanding og 1 μg DNA til et centrifugerør. Der tilsættes nukleasefrit vand for at opnå en standardreaktion på 4 μL. Derefter blandes lige store mængder af de fire ribonukleotidopløsninger (ATP, CTP, GTP og UTP) sammen og tilsættes 8 μL af blandingen til røret. Bland grundigt og inkuber ved 37 °C i 4 timer.
- Der tilsættes 1 μL DNase, blandes godt, og der inkuberes i 15 minutter ved 37 °C.
- Stop reaktionen og tilsæt 30 μL nukleasefrit vand og 30 μL LiCl udfældningsopløsning for at udfælde RNA'et. Bland grundigt. Inkuberes ved -20 °C natten over.
- Centrifuger i 15 minutter ved 12.000 × g og 4 °C. Kassér supernatanten.
- Tilsæt 1 ml 75% ethanol for at vaske RNA. Tryk prøven, og centrifuger den i 10 minutter ved 12.000 × g og 4 °C.
- Lufttør RNA-pelleten i 3 min.
- Resuspender pelleten i 30 μL RNase-frit vand.
- Analyser kvaliteten af dsRNA'et ved hjælp af et spektrofotometer. Pipetter 1 μL af dsRNA-prøven på målepiedestalen, og indstil bølgelængden til 340 nm. Visualiser produkterne på en 1,0% agarosegel.
3. RNAi ved blødgøring
- Bland 4 μL 5x blødgøringsbuffer (0,05% gelatine, 5,5 mM KH2PO4, 2,1 mM NaCl, 4,7 mM NH4Cl, 3 mM spermidin) med dsRNA og ddH2O for at producere et samlet volumen på 20 μL og en endelig RNA-koncentration på 0,8 μg / ml.
- Erhverv J2 larver.
- Saml nematoderne fra svampekulturerne og overfør dem til en glas petriskål 6 cm i diameter. Tilsæt 10 ml vand til skålen for at sikre, at nematoderne kan svømme frit. Opbevar nematoderne i skålen i 30 minutter og vent på, at æggene klæber til bunden.
- Fjern vandet og nematoderne omhyggeligt, og sørg for ikke at forstyrre æggene. Gentag trinene, indtil alle larver og voksne er fjernet, så kun æggene er i skålen.
- Klæk de opsamlede æg i 24 timer i mørke ved 25 °C for at opnå J2-larver. Saml J2 larverne, læg dem i et rør, og vask dem tre gange med ddH2O til RNAi-eksperimentet15.
- J2-larverne overføres til 2 ml-røret indeholdende dsRNA-opløsningen, og der tilsættes resorcinolopløsning (indpakket i stanniol og opløst i vand) for at opnå en slutkoncentration på 1,0%. Larverne inkuberes med centrifugering ved 15 × g på et rystebord i 24 timer ved 25 °C for at sikre, at larverne effektivt absorberer dsRNA'et.
- Blødgør den samme mængde nematoder i blødgøringsbufferen uden dsRNA-sonden eller med en GFP dsRNA-sonde som kontrol. Brug GFP-genet (gfp, M62653.1) som en ikke-hygiejnisk kontrol og syntetisere dsRNA af gfp ved hjælp af genspecifikke primere T7-GFP-F / R.
4. qPCR-detektion
- Rens J2-larverne med ddH2O, herunder dem med målgeninterferens, GFP-geninterferens og den uforstyrrede kontrolgruppe. Uddrag de samlede RNA'er fra hver gruppe ved hjælp af metoden beskrevet ovenfor.
- Start qPCR.
- Design q-ppm-1-F/R primere ved hjælp af den ønskede software (se materialetabellen).
- QPCR-reaktionen opsættes i 12 μL indeholdende 1 μL cDNA, 6 μL fluorescerende forblanding, 0,4 μL af hver primer (10 pmol/l) og sterilt destilleret vand.
- Udfør qPCR som følger: 2 min ved 95 °C; efterfulgt af 40 cyklusser på 10 s ved 95 °C, 30 s ved 55 °C og 1 min ved 72 °C.
- Brug actb-genet (GenBank-tiltrædelsesnummer EU100952) og tbb-2-genet (GenBank-tiltrædelsesnummer MT769316) eller andre gener som interne referencegener til at evaluere ændringerne i genekspressionsniveau efter RNAi15.
- I henhold til cyklustærskelværdien (Ct) og opløsningskurven skal du bruge 2-ΔΔCt-metoden til at estimere det relative ekspressionsniveau for målgenet og verificere interferenseffektiviteten.
- Træk Ct-værdien af det interne referencegen for hver prøve fra målgenets Ct-værdi for at opnå ΔCt-værdien. Træk derefter ΔCt-værdien af interferensgruppen fra ΔCt-værdien for kontrolgruppen for at opnå ΔΔCt-værdien.
BEMÆRK: En ΔΔCt-værdi større end 0 indikerer, at interferensen er effektiv.
- Træk Ct-værdien af det interne referencegen for hver prøve fra målgenets Ct-værdi for at opnå ΔCt-værdien. Træk derefter ΔCt-værdien af interferensgruppen fra ΔCt-værdien for kontrolgruppen for at opnå ΔΔCt-værdien.
5. Evaluer kropslængden af nematode voksne efter RNAi
- Efter RNAi dyrkes J2-larverne indtil voksenalderen på B. cinerea-græsplæner i PDA-plader i 60 timer ved 25 °C15.
- Saml de voksne ved hjælp af Bellman-tragtmetoden (se trin 1.1.2.1)14.
- Anskaf billeder af de voksne nematoder under et mikroskop, og brug ImageJ-software (eller anden målesoftware) til at måle kropslængderne.
- Mål længden ved hjælp af ImageJ ved at vælge Analysér | Indstil skala. Hvis afstanden er kendt, skal du indtaste længdeværdien for den tegnede lige linje. Indtast længdeenheden.
- Markér afkrydsningsfeltet Global (brug denne standard til alle billeder), og klik på OK for at vælge den længde, der skal måles, med en lige linje på det billede, der skal måles.
- Brug kommandoen Ctrl+M (måling) til at få vist resultaterne og registrere dem i resultatvinduet .
- Tag målinger af 50 mandlige og 50 kvindelige nematoder til statistisk analyse12.
- Analyser dataene ved at beregne middel- og standardafvigelsen for hver prøve. Sammenlign midlerne til prøverne fra de forskellige grupper ved hjælp af Student's t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse af ppm-1 ekspression af B. xylophilus efter RNAi
Det relative ekspressionsniveau for ppm-1-genet af B. xylophilus gennemblødt med GFP dsRNA og det gennemblødt med målgenet dsRNA var henholdsvis 0,92 og 0,52 ( ppm-1-genekspressionsniveauet for den ddH2O-behandlede kontrolgruppe blev indstillet til 1) (figur 1). Eksogent dsRNA har således ingen effekt på ppm-1-ekspressionen af B. xylophilus; ppm-1 dsRNA kan dog effektivt hæmme ekspressionen af målgenet.
Virkning af ppm-1 ekspression på vækst og udvikling af B. xylophilus
Efter RNAi faldt størrelsen af de voksne markant (figur 2), hvilket resulterede i SMA (lille kropsstørrelse) mutant fænotype. Selvom RNAi-behandlede individer udviklede sig til seksuel modenhed, var deres kropslængde væsentligt mindre end normale voksne. Specifikt efter RNAi i J2-trin nematoder var den gennemsnitlige kropslængde for kvinder og mænd henholdsvis 544,61 μm og 526,24 μm. I modsætning hertil var den gennemsnitlige kropslængde for kvinder og mænd i kontrolgruppen henholdsvis 971,86 μm og 912,31 μm (figur 3), hvilket repræsenterer signifikante forskelle (P = 0,0322).
Figur 1: Ekspression af ppm-1 genet efter RNAi af Bursaphelenchus xylophilus. **P < 0,001. Forkortelser: RNAi = RNA-interferens; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Reduktion af kropslængde af voksne efter interferens af ppm-1 i Bursaphelenchus xylophilus. Billeder af en voksen mand (A) og kvinde (C) i RNAi-gruppen. Billeder af en voksen mand (B) og kvinde (D) i kontrolgruppen. Skalastænger = 50 μm. Forkortelse: RNAi = RNA-interferens. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kvantificering og statistisk analyse af kropslængden hos voksne af Bursaphelenchus xylophilus efter RNAi af ppm-1-genet . (*P = 0,0322). Forkortelse: RNAi = RNA-interferens. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom livshistorien og det parasitære miljø af B. xylophilus er forskellige fra andre nematoder, har der været begrænset forskning på den molekylære patogenese af dette plantepatogen. På trods af store fremskridt med anvendelsen af CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknologi i C. elegans og andre nematoder er kun RNAi-teknologi anvendt på B. xylophilus blevet offentliggjort til dato17. RNAi er et af de mest kraftfulde værktøjer til rådighed til at studere genfunktionen af nematoder og har været meget udbredt i forskning, der belyser B. xylophilus genfunktion, signaltransduktionsveje og genterapi 18,19,20. I modsætning til de gen knockout-tilgange, der anvendes i hvirvelløse modeller, muliggør RNAi-medieret knockdown af målgener i nematoder hurtig evaluering af genfunktionen.
Der er tre måder at udføre RNAi på i C. elegans: injektion6, blødning21 og fodring6. Fordi J2-larver kun fodrer efter infektion, anvendes blødgøringsmetoden typisk til RNAi af planteparasitiske nematoder. Nøgletrinnet i blødgøringsmetoden er at tilføje en nervegift for at stimulere nematoderne til at fodre. Urwin brugte først octopamin til at stimulere J2 af to orale cyste nematodearter, Globodera pallida og Heterodera glyciner, hvilket resulterede i optagelsen af dsRNA fra blødgøringsopløsningen22. Den samme metode er med succes blevet anvendt til at inducere J2 af rodknude nematoden Meloidogyne incognita til at absorbere dsRNA 23. Resorcinol kan også inducere optagelsen af dsRNA af J2 af M. incognita og kan være mere effektiv end octopamin for denne nematode24. Desuden forbedrede tilsætningen af spermidin til blødgøringsbufferen med en forlænget inkubationstid effektiviteten af RNAi i nematoder25. Efter 24 timers blødning kommer dsRNA effektivt ind i B. xylophilus og derved dæmper ppm-1-genet .
Denne protokol giver derfor en reference til den fremtidige undersøgelse af RNAi af andre planteparasitære nematoder med fagocytoseadfærd. Derudover spiller suspensionseffekten af rystebordet en vigtig rolle i at maksimere fordelen ved blødgøringsmetoden. Denne metode kan muliggøre samtidig behandling af et stort antal nematoder. RNAi er lettere at betjene, når det fokuseres på målgenerne, for hvilke mutanter ikke let kan opnås, og til evaluering af virkningerne på forskellige udviklingspunkter, fordi nematoder kan gennemblødes på ethvert livsstadium. Således kan RNAi bruges til at studere funktionen af et specifikt gen på et specifikt udviklingsstadium. Wang et al. analyserede MAPK's indflydelse på Fecundity af B. xylophilus og dens vigtige rolle i vækst og udvikling af nematoder ved anvendelse af dsRNA-blødning26. Qiu et al. fandt, at migrationshastigheden og fecunditeten af B. xylophilus i fyrretræer faldt efter nedregulering af Bxpel1-genet , hvilket indikerer, at dette gen er en vigtig patogen faktor for B. xylophilus27.
Imidlertid virker ikke alle RNAi i nematoder gennem dsRNA. Dulovic og Streit anvendte små interfererende RNA'er (siRNA'er) i stedet for de længere dsRNA'er for med succes at forstyrre Strongyloides ratti28. Begrænsningen af at bruge dsRNA til RNAi i Strongyloides kan være relateret til fraværet af gener såsom rsd-6, sid-1 eller sid-2 , der vides at være involveret i dsRNA-optagelse. RNAi er også forbundet med ulemperne ved en positionel effekt og midlertidig og ufuldstændig knockout og har begrænset effektivitet for nogle gener og celletyper (såsom neuroner)29. Men indtil et gennembrud i den transgene teknologi af B. xylophilus er opnået, repræsenterer RNAi en relativt effektiv forskningsstrategi.
RNAi har vist et stort potentiale for afgrødebeskyttelse. Ved hjælp af RNAi-teknologi er transgene kartofler, der er i stand til at producere dsRNA, der er målrettet mod rodknude nematodegener, blevet opdrættet for at producere fuldstændig resistens over for rodknude nematoder30. Ekspression af dsRNA'er, der er målrettet mod insektgener, kan give afgrødebeskyttelse i fravær af kemiske insekticider og giver den yderligere fordel, at der ikke produceres fremmede proteiner med et næsten ubegrænset antal målgener31. Derfor vil accelereret forskning inden for anvendt RNAi til skadedyrsbekæmpelse give bedre biosikkerhed til bekæmpelse af plante nematoder end transgene metoder eller andre kemiske bekæmpelsesmetoder.
Afslutningsvis beskriver denne protokol fremstillingen af dsRNA af ppm-1-genet for at opnå RNAi ved direkte blødning af larverne af B. xylophilus i dsRNA-opløsning. Interferenseffekten blev bekræftet baseret på en signifikant reduktion i larvernes kropsstørrelse, efter at de udviklede sig til voksne sammenlignet med kontrolvirkningen, hvilket viser, at ppm-1-genet udøver virkninger på væksten og udviklingen af B. xylophilus. Denne undersøgelse giver et teoretisk grundlag for yderligere at afsløre funktionen af ppm-1 med yderligere praktisk værdi til at styre den biologiske kontrol af denne planteparasit. Det antages, at med den yderligere offentliggørelse og forbedring af RNAi-teknologimekanismen vil dens anvendelse inden for B. xylophilus-kontrol have brede udsigter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der blev ikke erklæret interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (31870637, 31200487) og finansieret i fællesskab af Zhejiang Key Research Plan (2019C02024, LGN22C160004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baermann funnel | n/a | n/a | to isolate nematodes |
| Beacon Designer 7.9 | Shanghai kangyusheng information technology co. | n/a | to design qPCR primers |
| Botrytis cinerea | n/a | n/a | as food for nematodes |
| Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | its number was NXY61 and was it was originally extracted from diseased Pinus massoniana in Ningbo, Zhejiang province, China. |
| constant temperature incubator | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. | H1703544 | to cultur nematodes |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad Laboratories | 1704466 | to achieve electrophoretic analysis |
| Ethanol, 75% | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | to extract RNA |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR030A | for PCR |
| Ex Taq Polymerase Premix | Takara Bio Inc. | RR390A | for PCR |
| Gel imager | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | to make nucleic acid bands visible |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Prism | n/a | to analyze the data and make figurs |
| High Speed Centrifuge | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | centrifug |
| High-flux tissue grinder | Bertin | to extract RNA | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | n/a | to measure the body lengths |
| isopropyl alcohol | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. | L1909022 | to extract RNA |
| Leica DM4B microscope | Leica Microsystems Inc. | to observe nematodes | |
| magnetic beads | Aoran science technology co. | 150010C | to extract RNA |
| MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | to synthesize dsRNA in vitro |
| NanoDrop ND-2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | to analyze the quality of the dsRNA |
| PCR Amplifier | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | to amplify nucleic acid sequence |
| Petri dishes | n/a | n/a | to cultur nematodes |
| pGEM-T Easy vector | Promega Corporation | A1360 | for cloning |
| Potato Dextrose Agar (Medium) | n/a | n/a | to cultur Botrytis cinerea |
| Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio Inc. | RR047B | to synthetic cDNA |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | to design PCR primers |
| primers:ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
| Real-time thermal cycler qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Beijing) Co. | for qPCR | |
| shaking table | Shanghai Zhicheng analytical instrument manufacturing co. | to soak nematodes | |
| stereoscopic microscope | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | to observe nematodes |
| T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| T7 promoter | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit | Takara Bio Inc. | 9762 | to recover DNA |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | for qPCR |
| trichloroethane | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | to extract RNA | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | total RNA extraction reagent,to extract RNA |
References
- Nicol, J. M., et al. Current nematode threats to world agriculture. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C. , Springer. Dordrecht. 21-43 (2011).
- Jones, J. T., et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 14 (9), 946-961 (2013).
- Kikuchi, T., et al. Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphelenchus xylophilus. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002219 (2011).
- Megen, H. V., et al. A phylogenetic tree of nematodes based on about 1200 full-length small subunit ribosomal DNA sequences. Nematology. 11 (6), 927-950 (2009).
- Niu, J. H., Jian, H., Xu, J. M., Guo, Y. D., Liu, Q. RNAi technology extends its reach: Engineering plant resistance against harmful eukaryotes. African Journal of Biotechnology. 9 (45), 7573-7582 (2010).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 91 (6669), 806-811 (1998).
- Shahid, M., Imran, A., Mazhar, H., Yusuf, Z., Rob, W. B. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in Plant Science. 11 (11), 559-565 (2006).
- Marmonier, A., et al. In vitro acquisition of specific small interfering RNAs inhibits the expression of some target genes in the plant ectoparasite Xiphinema index. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3266 (2019).
- Iqbal, S., Fosu-Nyarko, J., Jones, M. G. K. Attempt to silence genes of the RNAi pathways of the root-knot nematode, Meloidogyne incognita results in diverse responses including increase and no change in expression of some genes. Frontiers in Plant Science. 11, 328 (2020).
- Zhou, L. F., et al. Molecular characterization and functional analysis of akt-1 in pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pathology. 51 (1), 12647 (2021).
- Zhou, L. F., et al. The role of mab-3 in spermatogenesis and ontogenesis of pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 77 (1), 138-147 (2021).
- Tang, J., et al. Bxy-fuca encoding α-L-fucosidase plays crucial roles in development and reproduction of the pathogenic pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Pest Management Science. 76 (1), 205-214 (2020).
- Wang, J. H., et al. Molecular characterization and functional analysis of daf-8 in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Forestry Research. , (2021).
- Viglierchio, D. R., Schmitt, R. V. On the methodology of nematode extraction from field samples: Baermann funnel modifications. Journal of Nematology. 15 (3), 438-444 (1983).
- Zhu, N., et al. Observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54842 (2016).
- Zhou, L. F., Chen, F. M., Ye, J. R., Pan, H. Y. Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis of Bursaphelenchus mucronatus gene expression from different habitats and developmental stages. Frontiers in Genetics. 9, 269-279 (2018).
- Wang, M., et al. Double-stranded RNA-mediated interference of dumpy genes in Bursaphelenchus xylophilus by feeding on filamentous fungal transformants. International Journal for Parasitology. 46 (5-6), 351-360 (2016).
- Ma, H. B., Lu, Q., Liang, J., Zhang, X. Y. Functional analysis of the cellulose gene of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, using RNA interference. Genetics and Molecular Research: GMR. 10 (3), 1931-1941 (2011).
- Cheng, X. Y., Dai, S. M., Xiao, L., Xie, B. Y. Influence of cellulase gene knock down by dsRNA interference on the development and reproduction of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Nematology. 12 (12), 225-233 (2010).
- Xue, Q., Wu, X. Q., Zhang, W. J., Deng, L. N., Wu, M. M. Cathepsin L-like cysteine proteinase genes are associated with the development and pathogenicity of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 215 (2019).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: Soaking in the genome sequence. Science. 282 (5388), 430-431 (1998).
- Urwin, P. E., Lilley, C. J., Atkinson, H. J. Ingestion of double-stranded RNA by pre parasitic juvenile cyst nematodes leads to RNA interference. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 15 (8), 747-752 (2002).
- Bakhetia, M., Charlton, W., Atkinson, H. J., McPherson, M. J. RNA interference of dual oxidase in the plant nematode Meloidogyne incognita. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (10), 1099-1106 (2005).
- Rosso, M. N., Dubrana, M. P., Cimbolini, N., Jaubert, S., Abad, P. Application of RNA interference to root-knot nematode genes encoding esophageal gland proteins. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 615-620 (2005).
- Chen, Q., Rehman, S., Smant, G., Jones, J. T. Functional analysis of pathogenicity proteins of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis using RNAi. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 18 (7), 621-625 (2005).
- Wang, D. D., Li, Y., Li, J., Xie, B. Y., Chen, G. H. Molecular clone and its RNAi interference effect analysis of mapk gene in Bursaphelenchus xylophilus ( in Chinese). Acta Phytopathologica Sinica. 46 (5), 662-669 (2016).
- Qiu, X., Wu, X., Huang, L., Ye, J. R. Influence of Bxpel1 gene silencing by dsRNA interference on the development and pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 125 (2016).
- Dulovic, A., Streit, A. RNAi-mediated knockdown of daf-12 in the model parasitic nematode Strongyloides ratti. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007705 (2019).
- Li, L., Zhao, H., Cui, Y., Wei, H., Li, M. Research progress of gene editing technology. Life Science Research. 21 (3), 268-274 (2017).
- Bindhya, C. Y., Karuppannan, V., Kuppuswamy, S. Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection. Molecular and Biochemical Parasitology. 148 (2), 219-222 (2006).
- Jiang, Z., Sher, A. K., David, G. H., Ralph, B. Next-generation insect-resistant plants: RNAi-mediated crop protection. Trends in Biotechnology. 35 (9), 871-882 (2017).
