Summary
מיקרוסקופ פוטואקוסטי אולטרה סגול במהירות גבוהה ופתוח שיכול לספק תמונות היסטולוגיות תוך ניתוחיות לניתוח שוליים כירורגיים מודגם, כולל תצורת המערכת, יישור אופטי, הכנת דגימות והליכים ניסיוניים.
Abstract
ניתוח שוליים כירורגיים (SMA), הליך חיוני לאישור כריתה מלאה של רקמה סרטנית בניתוח כריתה של גידול, דורש כלי אבחון תוך ניתוחיים כדי להימנע מניתוחים חוזרים ונשנים עקב שולי ניתוח חיוביים. לאחרונה, על ידי ניצול הקליטה האופטית הפנימית הגבוהה של DNA/RNA באורך גל של 266 ננומטר, פותחה מיקרוסקופיה פוטואקוסטית אולטרה סגולה (UV-PAM) כדי לספק תמונות היסטולוגיות ברזולוציה גבוהה ללא תיוג, מה שמראה הבטחה גדולה ככלי תוך-ניתוחי ל-SMA. כדי לאפשר את הפיתוח של UV-PAM עבור SMA, כאן, מוצגת מערכת UV-PAM במהירות גבוהה ופתוחה, אשר ניתן להפעיל באופן דומה microscopies אופטיים קונבנציונליים. מערכת UV-PAM מספקת רזולוציה רוחבית גבוהה של 1.2 מיקרומטר, ומהירות הדמיה גבוהה של קצב קו A של 55 קילוהרץ עם סריקת מראה גלוונומטר בעלת ציר אחד. יתר על כן, כדי להבטיח שתמונות UV-PAM יוכלו להתפרש בקלות על ידי פתולוגים ללא הכשרה נוספת, תמונות ה- UV-PAM המקוריות בגווני אפור מוכתמות כמעט לחלוטין על ידי אלגוריתם למידה עמוקה כדי לחקות את התמונות הסטנדרטיות המוכתמות בהמטוקסילין וב- eosin, מה שמאפשר ניתוח היסטולוגי ללא אימון. הדמיית פרוסות מוח של עכברים מתבצעת כדי להדגים את הביצועים הגבוהים של מערכת ה-UV-PAM הפתוחה, מה שממחיש את הפוטנציאל הגדול שלה ליישומי SMA.
Introduction
ניתוח שוליים כירורגיים (SMA), הדורש בדיקה של דגימות רקמה תחת מיקרוסקופ, הוא הליך חיוני כדי לקבוע אם כל התאים הסרטניים מוסרים מגופו של המטופל בניתוח כריתה1. לכן, מיקרוסקופ שיכול לספק במהירות תמונות היסטולוגיות הוא בעל חשיבות מכרעת עבור SMA כדי למנוע ניתוחים חוזרים ונשנים הנגרמים על ידי הסרה לא מלאה של תאים סרטניים. עם זאת, על פי השיטה הנוכחית של תקן הזהב המבוססת על מיקרוסקופיה אופטית בשדה בהיר, הרקמה שנכרתה נדרשת להיות קבועה בפורמלין, משובצת בפרפין, מחולקת לפרוסות דקות (4-7 מיקרומטר), ולאחר מכן מוכתמת על ידי המטוקסילין ואוזין (H&E) לפני ההדמיה, אשר גוזלת זמן רב (3-7 ימים) ומייגעת 2,3 . חתך קפוא הוא חלופה מהירה ל-SMA על ידי הקפאה מהירה, חיתוך וכתם של הרקמה, מה שיכול לספק תמונות היסטולוגיות תוך 20-30 דקות4. עם זאת, התכונות ההיסטולוגיות מעוותות לעתים קרובות ודורשות הכשרה מיומנת, מה שמעכב את תחולת הטכניקה על סוגים רבים של איברים5.
טכניקות מיקרוסקופיה אופטית שיכולות לספק תמונות תאיות ללא או עם כמה שלבים של עיבוד רקמות פותחו עבור SMA. עם זאת, כל אחד מהם סובל מבעיות שונות. לדוגמה, טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית6 ומיקרוסקופיית רפלקציה קונפוקלית7 סובלות מספציפיות נמוכה בגלל ניגודיות הפיזור הפנימית הנמוכה שלהן. למרות שמיקרוסקופיה עם עירור פני שטח אולטרה סגול8 ומיקרוסקופיה של יריעות אור9 יכולה לספק תמונות ברזולוציה גבוהה וניגודיות גבוהה עבור SMA, בדרך כלל לא ניתן לבצע את הליך הכתם הרעיל והנדיף בחדר ניתוח, מה שמאריך את זמן ההפניה. מיקרוסקופיה מרובת פוטונים10 ומיקרוסקופיית ראמאןמגורה 11 יכולות לספק מידע עשיר עבור SMA. עם זאת, העלות הגבוהה של הלייזרים האולטרה-מהירים הנדרשים המשמשים ליצירת אפקטים לא ליניאריים מונעת את תחולתם הרחבה.
לאחרונה, על ידי ניצול הקליטה האופטית הפנימית, פותחה מיקרוסקופיה פוטואקוסטית אולטרה סגולה ללא תוויות (UV-PAM) כדי לספק תמונות היסטולוגיות ברזולוציה גבוהה12. ב-UV-PAM, אנרגיית הפוטון של אור ה-UV של העירור (למשל, 266 ננומטר) נספגת תחילה על ידי ה-DNA/RNA בגרעיני התא13 ולאחר מכן מומרת לחום, מה שגורם לפליטת גלים אקוסטית באמצעות התפשטות תרמית-אלסטית14. על ידי גילוי הגלים האקוסטיים שנוצרו, ניתן לקבל תמונות UV-PAM דו-ממדיות (דו-ממדיות) של גרעיני תאים באמצעות הקרנת משרעת מקסימלית של האותות האקוסטיים, המספקת מידע היסטולוגי עבור SMA. כדי לאפשר את היישומים הקליניים של UV-PAM, פותח UV-PAM במהירות גבוהה המבוססת על סריקת מראה גלוונומטר כדי לספק תמונות היסטולוגיות לדגימת ביופסיה מוחית (5 מ"מ x 5 מ"מ) תוך 18 דקות, מה שמראה פוטנציאל גדול ביישומים רגישים לזמן15. כדי לאמת עוד יותר את האפשרות של UV-PAM להדמיית רקמות עבות, הוצעה מערכת UV-PAM במצב השתקפות עם סורק מערכות מיקרואלקטרומכניות עמיד למים עם ציר אחד, המדגים בהצלחה בדיקה היסטופתולוגית תוך ניתוחית של רקמות המעי הגס והכבד האנושיות16. מכיוון שתמונת UV-PAM המקורית היא בגווני אפור ואילו התמונה המוכתמת H&E בתקן הזהב היא בצבעים ורודים וסגולים, קשה לפתולוגים לפרש תמונות UV-PAM ישירות. כדי לטפל בבעיה זו, הוצע אלגוריתם למידה עמוקה להעברת תמונות UV-PAM בגווני אפור לתמונות מוכתמות H&E וירטואליות כמעט בזמן אמת, כך שהפתולוגים יוכלו להבין את התמונות ללא כל הכשרה נוספת17.
עבודה זו מדווחת על מערכת UV-PAM מהירה ופתוחה הניתנת להפעלה בדומה למיקרוסקופים אופטיים קונבנציונליים, המספקת הן תמונות היסטולוגיות מקוריות בגווני אפור והן תמונות מוכתמות כמעט בסיוע אלגוריתם למידה עמוקה. פרוסת מוח עכבר קבועה פורמלין ומוטמעת פרפין (FFPE) מצולמת על ידי מערכת UV-PAM כדי להדגים את הדמיון בין ה-UV-PAM המוכתם כמעט שלנו לבין תמונות סטנדרטיות מוכתמות H&E,E,, מה שמראה את הפוטנציאל שלו ליישומי SMA.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים המבוצעים בעבודה זו מאושרים על ידי הוועדה לאתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת הונג קונג למדע וטכנולוגיה.
1. מערכת UV-PAM עם גג פתוח (איור 1)
- תאורה אופטית
- השתמש בלייזר מצב מוצק שאוב על ידי דיודה Q-switch (אורך גל של 266 ננומטר) כמקור עירור.
- השתמש בשתי עדשות קמורות כדי להרחיב את קרן הלייזר ולמקם חור סיכה קרוב לנקודת המוקד של העדשה הקמורה הראשונה כדי לבצע סינון מרחבי.
- שקף את קרן הלייזר כלפי מעלה באמצעות מראה גלוונומטר 1D (1D GM).
- השתמש בעדשה אובייקטיבית כדי למקד את קרן הלייזר ולעבור דרך מרכזו של מתמר על-קולי בצורת טבעת (UT) לפני שתתמקד בחוזקה בדגימה.
- זיהוי על-קולי
- השתמש ב-UT ממוקד בצורת טבעת כדי לזהות גלים על-קוליים. הקטרים הפנימיים והחיצוניים של האזור הפעיל UT הם 3 מ"מ ו -6 מ"מ, בהתאמה. אורך מוקד: 6.3 מ"מ; תדר מרכזי: 40 מגה-הרץ; -6 רוחב פס dB: 84%.
- תקן את ה-UT למיכל מים מעשה ידי מעבדה עם חלון שקוף אופטית בתחתית, המכוסה בכיסוי קוורץ דק כדי לאפשר לאור UV לעבור דרכו. ודא שהאזור הפעיל של ה- UT פונה כלפי מעלה. חברו את מיכל המים לשלב ידני בעל שני צירים לשליטה במיקום הצדדי של ה-UT.
- הפעל את לייזר ה- UV, התאם את מיקום ה- UT כדי לאפשר לקרן הלייזר לעבור ממרכז ה- UT. כבה את לייזר ה- UV. לאחר מכן, מלאו את מיכל המים במים שעברו דה-יוניזציה כדי לטבול את ה-UT במלואו.
- חבר את הפלט של ה- UT לשני מגברים (רווח כולל = 56 dB) וחבר את הפלט של המגבר השני לכרטיס רכישת נתונים (DAQ).
- חברו מחזיק דגימה לשלב ידני עם ציר z המחובר לשלבים ממונעים ב-xy. למחזיק הדגימה יש חור ריק המאפשר לאור UV לעבור דרכו. חברו ארבע חתיכות של סרט דו-צדדי המקיף את החור.
- יישור המערכת
- הצמידו סרט שחור לשקופית זכוכית והניחו את מגלשת הזכוכית כדי לכסות את החור של מחזיק הדגימה, כאשר הסרט השחור פונה כלפי מטה. לחץ על שקופית הזכוכית כדי לוודא שהיא קבועה על מחזיק הדגימה. לאחר מכן, הנמיכו את מחזיק הדגימה כדי לטבול את החלקת הזכוכית למים.
- נתק את ה-UT והמגברים בצורת טבעת, חבר את ה-UT לפולס/מקלט, וחבר את הפלט של הפולס/מקלט לאוסצילוסקופ. הפעל את הפולס/מקלט למצב Pulse-Echo. הגדר את משרעת הדופק ואת הרווח של הפולס/מקלט ל-6 ו-20 dB, בהתאמה.
- אפשרו לפולס/מקלט והתאימו את מיקום ה-z של מחזיק הדגימה כדי למצוא את המיקום של מישור המוקד האקוסטי שבו האותות העל-קוליים הם מרביים.
- שנה את הדופק/מקלט למצב השידור והגדר את הרווח ל-60 dB. הפעל את יציאת הלייזר. התאם את מיקום z של העדשה האובייקטיבית כדי למקסם את אותות ה- PA הנמדדים על ידי האוסצילוסקופ.
- התאם את המיקום הצדדי של ה- UT בצורת טבעת כדי להפוך את אות ה- PA שנוצר לסימטרי ומקסימלי, המייצג את העובדה שהמוקדים האופטיים והאקוסטיים מתואמים בפחם במישור הצדדי. לאחר מכן, התאם את מיקום z של בעל הדגימה כדי למקסם את אותות ה- PA.
- חזור על שלבים 1.4.3 ו- 1.4.4 כדי למטב הן את הסימטריה והן את המשרעת של אותות ה- PA. תעד את עיכוב הזמן (כלומר, הזמן שלוקח לגלי הרשות להגיע ל-UT) באוסצילוסקופ כאשר אותות ה-PA ממוטבים.
- הזז את מחזיק הדגימה כדי לצלם מיקומים שונים של הסרט השחור. התאם את שטוחותו של בעל הדגימה כך שאותות ה- PA הנוצרים מכל מיקום של הסרט השחור יהיו בעלי עיכוב זמן זהה לזה שנמדד בשלב 1.4.5.
- כבה את הלייזר וחבר את ה- UT לשני המגברים.
2. הכנת דוגמאות
- פרוסת מוח של עכבר FFPE
- להקריב עכבר עם מנת יתר של הרדמה. לאחר מכן, קחו את מוח העכבר בהתאם לפרוטוקול המתואר בהפניה18.
- תקן את המוח שנקטף בפורמלין נייטרלי של 10% במשך 24 שעות.
- לעבד את המוח הקבוע על ידי התייבשות עם אלכוהול מדורג, ניקוי עם קסילן, והטמעה עם פרפין כמתואר בהתייחסות19.
הערה: לעבד את הדגימה במכסה אדים. - פורסים את המוח המוטבע לפרוסות דקות (בעובי של 5 מיקרומטר) באמצעות מיקרוטום. הניחו את הפרוסות לדוגמה על שקופיות קוורץ. מייבשים את המגלשות בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
- הפחיתו את המקטעים באמצעות חומר סליקה (ראו טבלת חומרים), אשר מסיר את הפרפין כדי למנוע אותות רקע גבוהים, שכן פרפין סופג מאוד עם עירור UV.
הערה: לעבד את הדגימה במכסה אדים.
- פרוסת מוח טרייה של עכבר
- להקריב עכבר עם מנת יתר של הרדמה. לאחר מכן, קטפו את מוח העכבר בהתאם לפרוטוקול שצוין בהפניה18.
- לשטוף את מוח העכבר עם מלוחים מאגרי פוספט (PBS) כדי להסיר את הדם.
- חותכים פרוסה של דגימת המוח (בעובי של כ-5 מ"מ) ביד, ולאחר מכן שוטפים את הדגימה עם PBS כדי להסיר את הדם על החתך.
3. הליכים ניסיוניים
- מיקום לדוגמה
- הכן מיכל דגימה מעשה ידי מעבדה עם קרום שקוף UV (פוליאתילן, ∼10 מיקרומטר בעובי). מוסיפים טיפת מים לממברנה ואז מניחים את הדגימה הביולוגית על מיכל הדגימה כדי לכסות את המים. במקרה של דגימת פרוסת FFPE, השתמש בסרט הדבקה כדי לתקן את מגלשת הזכוכית על הממברנה.
- הניחו את מיכל הדגימה המכיל דגימה על מחזיק הדגימה, והקפידו לכסות את החור הריק של בעל הדגימה.
- הגדר את לייזר ה- UV למצב ההדק החיצוני. באמצעות תוכנית LabVIEW שנבנתה במעבדה (ראה טבלת חומרים), הגדר את פרמטרי הסריקה באופן הבא.
- הגדר את קצב החזרה בלייזר ל-55 קילוהרץ; הגדר את שגיאת האותe של מנהל ההתקן GM למשולש ואת טווח מתח הנהיגה ל- 0.018 V (המייצג ±0.018 V; גורם קנה מידה: 1 V / °). הגדר את GMnum ל- 22 ו - dy ל- 2 כך שאחרי כל 22 טריגרים בלייזר, ה- GM מסיים רבע מתקופת הסריקה, ומנוע ציר ה- y נע בגודל צעד של 0.3125 מיקרומטר. הגדר את dx ל- 192 כך שכאשר מנוע ציר ה- y מגיע למצב שנקבע מראש (למשל, 5 מ"מ), מנוע ציר ה- x נע בגודל צעד של 30 מיקרומטר.
הערה: גודל הצעד המצטבר הקטן ביותר מוגדר להיות 0.15625 מיקרומטר עבור מנועי ציר x ו- y. לכן, כאשר dy = 2, גודל הצעד שווה ל- 0.15625 x 2 = 0.3125 μm, וכאשר dx = 192, גודל הצעד שווה ל- 0.15625 x 192 = 30 μm. כדי לסרוק את כל השטח של 5 x 5 מ"מ2, מנוע ציר x ינוע 5000 μm /30 μm = 167 פעמים, כלומר 167 תתפור 167 תמונות משנה כדי לקבל תמונה שלמה. ראו איור 2 למסלול הסריקה של מערכת ה-UV-PAM.
- הגדר את קצב החזרה בלייזר ל-55 קילוהרץ; הגדר את שגיאת האותe של מנהל ההתקן GM למשולש ואת טווח מתח הנהיגה ל- 0.018 V (המייצג ±0.018 V; גורם קנה מידה: 1 V / °). הגדר את GMnum ל- 22 ו - dy ל- 2 כך שאחרי כל 22 טריגרים בלייזר, ה- GM מסיים רבע מתקופת הסריקה, ומנוע ציר ה- y נע בגודל צעד של 0.3125 מיקרומטר. הגדר את dx ל- 192 כך שכאשר מנוע ציר ה- y מגיע למצב שנקבע מראש (למשל, 5 מ"מ), מנוע ציר ה- x נע בגודל צעד של 30 מיקרומטר.
- התחל סריקת ניסוי על אזור קטן על ידי הגדרת מספר הצעדים הנעים של מנועי ציר x ו- y (xn = 10 ו - yn = 1000). התאם את השלב הידני של ציר z כדי למקם את הדגימה במישור המוקד לקבלת אותות PA מרביים.
- הזז את מנועי ציר x ו- y לנקודת ההתחלה הרצויה, הגדר את אזור הסריקה על-ידי הגדרת ערכי xn ו- yn ולאחר מכן התחל את תוכנית רכישת התמונה (ראה טבלת חומרים).
- לאחר רכישת התמונה, כבו את הלייזר, הסירו את בעל הדגימה ואחסנו את הדגימות הביולוגיות.
- עבור רקמות ביולוגיות טריות, אחסנו את הדגימות בפורמלין נייטרלי ב-10% נייטרלי.
- עבור פרוסות המוח של עכבר FFPE, כתם עם H&E בעקבות הפרוטוקול שצוין בהפניה20 כדי לקבל את התמונות המתאימות המוכתמות ב- H&E.
- השתמש באותות PA שנאספו כדי לשחזר את תמונת הקרנת המשרעת המרבית באמצעות אלגוריתם עיבוד תמונה שנבנה במעבדה (ראה טבלת חומרים).
Representative Results
איור 1 מראה את השרטוט של מערכת UV-PAM במהירות גבוהה. בהגדרה זו, נתיבי העירור האופטי והזיהוי העל-קולי נמצאים באותו צד ומתחת לדוגמה, ויוצרים מצב מחזיר אור ומערכת פתוחה. לפיכך, הוא ידידותי למשתמש ומתאים להדמיית דגימות עבות.
איור 2 מראה את מסלול הסריקה של מערכת UV-PAM במהלך ההדמיה. תמונת משנה של כל מקטע (לדוגמה, שטח של 5 מ"מ x 30 מיקרומטר) נוצרת תחילה באמצעות אלגוריתם אינטרפולציה מפוזר, ולאחר מכן, תמונה שלמה (למשל, שטח של 5 מ"מ x 5 מ"מ) מתקבלת על ידי תפירת כל תתי-התמונות באמצעות אלגוריתם עיבוד תמונה מותאם אישית (ראו טבלת חומרים).
איור 3A ואיור 3B מראים את תמונות ה-UV-PAM וה-H&E של פרוסת מוח של עכבר FFPE, בהתאמה, שלשתיהן יש שדה ראייה של 5 x 5 מ"מ2. ניתן לגשת לאלגוריתם עיבוד התמונה מ- Github באמצעות הקישור המופיע בטבלת החומרים. זמן רכישת התמונה היה פחות מ-18 דקות. איור 3C-F מראה את התמונות המוגדלות של האזורים המסומנים באיור 3A, שבהן ניתן לפתור בבירור את גרעיני התאים הבודדים. חשוב מכך, ניתן למצוא את גרעיני התא המתאימים בתמונות הסטנדרטיות המוכתמות ב-H&E (איור 3G-J), המציגות את הדיוק הגבוה של המערכת הנוכחית להדמיה תאית. כדי להעביר את תמונת UV-PAM בגווני אפור לתמונה וירטואלית מוכתמת H&E, הוחל אלגוריתם למידה עמוקה17 (ראה טבלת חומרים), שייקח פחות מ-30 שניות עבור תמונה עם 8000 x 8000 פיקסלים. התמונות המוגדלות המתאימות מוצגות באיור 3K-N. תמונות ה-UV-PAM המוכתמות כמעט מספקות מידע מבני כמעט זהה לזה של התמונות המוכתמות ב-H&E, מראות הבטחה לתרגום קליני של מערכת ה-UV-PAM הנוכחית.
איור 1: השרטוט של מערכת ה-UV-PAM המהירה והפתוחה. (א) הגדרת המערכת. (ב) תצלום של בעל הדגימה ומיכל מים המחובר לבמה ידנית בעלת שני צירים. (C) תצלום של המתמר העל-קולי בצורת טבעת הקבוע במיכל המים ומיכל הדגימה המכסה את החור של בעל הדגימה. (ד) תצלום של מיכל הדגימה עם הממברנה והדגימה שיונחו על בעל הדגימה. UV: אולטרה סגול; DAQ: כרטיס רכישת נתונים; GM: מראה גלוונומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: מסלול הסריקה של מערכת ה-UV-PAM במהלך ההדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תוצאות ניסיוניות של הדמיית UV-PAM עם צביעה וירטואלית מבוססת למידה עמוקה. (A) תמונת UV-PAM של פרוסת מוח של עכבר FFPE. (B) תמונה מוכתמת H&E סטנדרטית של אותה פרוסה. סרגלי קנה מידה: 1 מ"מ. (C-F) תמונות מוגדלות של האזורים המסומנים ב-A. (ג'י-ג') תמונות תואמות מוכתמות H&E של האזורים המסומנים ב- B. (ק-נ) התאמת תמונות כמעט מוכתמות באמצעות אלגוריתם למידה עמוקה. סרגלי קנה מידה: 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
לסיכום, הודגמה מערכת UV-PAM במהירות גבוהה ופתוחה להדמיה היסטולוגית. מוצגות ההוראות המפורטות לגבי תצורת המערכת, יישור אופטי, הכנת דגימה והליכי ניסוי. ניתן לגשת לתוכנית רכישת התמונות מ- Github באמצעות הקישור המופיע בטבלת החומרים. הרזולוציה הצידית של המערכת הנוכחית היא ~ 1.2 מיקרומטר אשר נמדדה בניסוי בפרסום21 שפורסם לאחרונה. פרוסת מוח של עכבר צולמה כדי להדגים שהמערכת הנוכחית יכולה לקבל תמונה היסטולוגית תוך 18 דקות עבור שטח של 5 x 5 מ"מ2, שהוא גודל אופייני לביופסיה של המוח22. למרות שהתמונה המקורית היא בגווני אפור, בעזרת כלי צביעה וירטואלי דיגיטלי המתאפשר על ידי אלגוריתם למידה עמוקה, המערכת הנוכחית יכולה לספק עוד יותר תמונות מוכתמות כמעט בזמן אמת, מה שמבטיח הסתגלות קלה לפתולוגים לפרש את התמונות. כטכניקת תמונה נטולת תוויות, מערכת UV-PAM הנוכחית יכולה גם לספק תמונות היסטולוגיות לדגימות רקמות טריות לא מעובדות. דוגמאות נוספות (כולל דגימות רקמות קפואות וטריות) הודגמו בפרסום קודם17. תוצאות הניסוי מראות את הפוטנציאל הגבוה של מערכת UV-PAM הנוכחית בסיוע למידה עמוקה ביישומי SMA.
אחד היתרונות של מערכת UV-PAM הוא שהמערכת מיושמת במצב השתקפות, ומאפשרת הדמיה של רקמות עבות. חוץ מזה, מערכת UV-PAM הפתוחה מאפשרת למקם את הדגימה על חלון הסריקה (הממברנה של מיכל הדגימה), שיש לו פעולה דומה למיקרוסקופים אופטיים מסורתיים. לכן, מערכת זו ידידותית יותר למשתמש מאשר מערכות אחרות הדורשות דגימות להיות דחוקות על ידי שתי ממברנות11,14. יתר על כן, על ידי שימוש ב- 1D GM עם לייזר UV בקצב חזרות גבוה, מערכת UV-PAM הנוכחית יכולה להשיג מהירות הדמיה גבוהה עם עלות-תועלת גבוהה יותר בהשוואה למערכת באמצעות עירור מולטיפוקלי23.
נכון לעכשיו, מהירות ההדמיה מוגבלת בעיקר על ידי קצב החזרה של תקציב הלייזר והפוטונים. עם לייזר בעל קצב חזרות גבוה ואנרגיית דופק גבוהה, ניתן לקצר עוד יותר את זמן ההדמיה. מגבלה נוספת של המערכת היא שניתן להתאים את הדגימה באופן גס רק למישור המוקד של העדשה האובייקטיבית על ידי מציאת אותות ה- PA המרביים, במקום להציג תמונה בזמן אמת כדי שהמשתמשים יוכלו לדמיין אם הדגימה נמצאת בפוקוס. כדי להציג תמונה כמעט בזמן אמת, ניתן להחיל GM דו-ממדי.
ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול: (א) יש לייעל את הדרישה הקונפוקלית של המוקדים האופטיים והאקוסמטיים כדי להשיג רגישות גילוי גבוהה; (ב) טווח הסריקה של ה-GM על ציר ה-x צריך להיות קטן יותר מנקודת המוקד האקוסטית של ה-UT בצורת טבעת כדי לשמור על רגישות זיהוי גבוהה דומה (בהתקנה הנוכחית, טווח הסריקה הוא כ-30 מיקרומטר ±15 מיקרומטר). אחרת, אפקטים ברורים של התזה סביב הקצוות יתרחשו כאשר מספר תתי-תמונות תפורות יחד כדי לקבל תמונה שלמה.
Disclosures
ל- T. T. W. W. ו- V. T. C. T. יש אינטרס כספי ב- PhoMedics Limited, אשר, עם זאת, לא תמכה בעבודה זו. המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות על התמיכה הכספית של ועדת החדשנות והטכנולוגיה של הונג קונג (ITS/036/19).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Sigma Aldrich | PHR1373 | Sample dehydration |
| Amplifier | Mini Circuit | ZFL-500LN-BNC+ | Ultrasonic signal amplification |
| Controller | National Instruments | NI myRIO | System controller |
| Data acquisition card | Alazar Technologies | ATS9350 | Ultrasonic signal collection |
| Deep-learning algorithm | For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM | ||
| Formalin | Sigma Aldrich | R04586 | Sample fixation |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | Sample staining |
| Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | Sample deparaffinization |
| Image acquisition program | National Instruments | LabVIEW | Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM |
| Image processing algorithm | Mathworks | MATLAB | Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM |
| Kinematic platform mounts | Thorlabs | KM200B | Adjust the sample to be flat |
| Membrane | Glad | Cling wrap | Sandwiched in sample tank |
| Microscope objective lens | Thorlabs | LMU- 5X-NUV | Objective lens |
| Motorized stages | Physik Instrumente | L-509.10SD00 | Scanning stages |
| One-dimensional galvanometer mirror | Thorlabs | GVS411 | Fast scanning mirror |
| Oscilloscope | RIGOL Technologies | DS1102E | Ultrasonic signal readout |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P3813 | Sample washing |
| Pinhole | Edmund Optics | #59–257 | Spatial filtering |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA-4600-UV | Focusing lens |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA-4663-UV | Collimating lens |
| Pulser/receiver | Imaginant | DPR300 | Pulse echo amplifier |
| Q-switch diode-pumped solid-state laser | Bright Solutions | WEDGE HF 266 nm | 266-nm laser |
| Ring-shaped ultrasonic transducer | University of Southern California | Ultrasonic signal detection | |
| Sample holder | Lab-made | Hold the sample tank | |
| Sample tank | Lab-made | Hold biological samples | |
| Single-axis Z-translational stage | Thorlabs | PT1 | Manual stage |
| Two-axis manual stage | Thorlabs | LX20 | Manual stage |
| Water tank | Lab-made | Ultrasonic signal transmission | |
| Xylene | Sigma Aldrich | XX0060 | Sample clearing |
References
- Kunos, C., et al. Breast conservation surgery achieving ≥ 2 mm tumor-free margins results in decreased local-regional recurrence rates. The Breast Journal. 12, 28-36 (2006).
- Rosai, J. Why microscopy will remain a cornerstone of surgical pathology. Laboratory Investigation. 87 (5), 403-408 (2007).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Analytical Chemistry. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Jaafar, H. Intra-operative frozen section consultation: concepts, applications and limitations. The Malaysian Journal of Medical Sciences: MJMS. 13 (1), 4 (2006).
- Rastogi, V., et al. Artefacts: a diagnostic dilemma - a review. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 7 (10), 2408-2413 (2013).
- Carrasco-Zevallos, O. M., et al. Review of intraoperative optical coherence tomography: technology and applications [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (3), 1607 (2017).
- Gareau, D. S., Jeon, H., Nehal, K. S., Rajadhyaksha, M. Rapid screening of cancer margins in tissue with multimodal confocal microscopy. Journal of Surgical Research. 178 (2), 533-538 (2012).
- Fereidouni, F., et al. Microscopy with ultraviolet surface excitation for rapid slide-free histology. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 957-966 (2017).
- Tanaka, N., et al. Whole-tissue biopsy phenotyping of three-dimensional tumours reveals patterns of cancer heterogeneity. Nature Biomedical Engineering. 1 (10), 796-806 (2017).
- Jain, M., et al. Multiphoton microscopy: A potential intraoperative tool for the detection of carcinoma in situ in human bladder. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 139 (6), 796-804 (2015).
- Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1 (2), 0027 (2017).
- Wong, T. T. W., et al. Fast label-free multilayered histology-like imaging of human breast cancer by photoacoustic microscopy. Science Advances. 3 (5), 1602168 (2017).
- Shen, C. -H. Detection and analysis of nucleic acids. Diagnostic Molecular Biology. , 167-185 (2019).
- Yao, J., Wang, L. V.
- Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Optics Letters. 45 (19), 5401 (2020).
- Baik, J. W., et al. Intraoperative label-free photoacoustic histopathology of clinical specimens. Laser & Photonics Reviews. 15 (10), 2100124 (2021).
- Kang, L., Li, X., Zhang, Y., Wong, T. T. W. Deep learning enables ultraviolet photoacoustic microscopy based histological imaging with near real-time virtual staining. Photoacoustics. 25, 100308 (2022).
- Sterile Tissue Harvest | Protocol. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10298/sterile-tissue-harvest (2022).
- Steps to Tissue Processing for Histopathology. , Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/ (2022).
- An Intro to H&E Staining: Protocol, Best Practices, Steps & More. , Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/ (2022).
- Li, X., et al. Ultraviolet photoacoustic microscopy with tissue clearing for high-contrast histological imaging. Photoacoustics. 25, 100313 (2022).
- Leinonen, V., et al. Assessment of β-amyloid in a frontal cortical brain biopsy specimen and by positron emission tomography with carbon 11-labeled pittsburgh compound B. Archives of Neurology. 65 (10), 1304-1309 (2008).
- Imai, T., et al. High-throughput ultraviolet photoacoustic microscopy with multifocal excitation. Journal of Biomedical Optics. 23 (03), (2018).
