Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

זיהוי זן וולבצ'יה wAlbB ב Aedes albopictus קווי תאים

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63662
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1
1Guizhou Medical University, 2Guizhou Health Vocational College
* These authors contributed equally

Summary

ארבע שיטות שימשו לאיתור וולבצ'יה תוך-תאית, אשר השלימו זו את זו ושיפרו את דיוק הזיהוי של זיהום וולבצ'יה של Aa23 שמקורו ב-Aedes albopictus ו-Aa23-T שנרפאו מזיהום וולבצ'יה מקומי באמצעות אנטיביוטיקה.

Abstract

כאנדוסימביונטית בעלת נמל אימהי, וולבצ'יה מדביקה שיעורים גדולים של אוכלוסיות חרקים. מחקרים דיווחו לאחרונה על ויסות מוצלח של העברת נגיפי RNA באמצעות יתושים שעברו טרנספקציה של וולבצ'יה. אסטרטגיות מרכזיות לשליטה בווירוסים כוללות מניפולציה של רבייה של מארח באמצעות אי-תאימות ציטופלסמית ועיכוב של תעתיקים נגיפיים באמצעות תעתיקים חיסוניים ותחרות על משאבים שמקורם במארח. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים של התגובות של יתושים שעברו וולבצ'יה לזיהום ויראלי אינם מובנים היטב. מאמר זה מציג פרוטוקול לזיהוי במבחנה של זיהום וולבצ'יה ברמות חומצת הגרעין והחלבון בתאי Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 כדי לשפר את ההבנה של יחסי הגומלין בין וולבצ'יה לבין וקטורים החרקים שלה. באמצעות שימוש משולב בתגובת שרשרת פולימראז (PCR), PCR כמותי, כתם מערבי ושיטות אנליטיות אימונולוגיות, תואר פרוטוקול מורפולוגי סטנדרטי לזיהוי תאים נגועים בוולבצ'יה שהוא מדויק יותר משימוש בשיטה אחת. גישה זו עשויה להיות מיושמת גם על זיהוי של זיהום וולבצ'יה בטקסות חרקים אחרות.

Introduction

יתוש הטיגריס האסייתי Aedes albopictus (Skuse) (דיפטרה: Culicidae), שהוא וקטור מפתח של נגיף הדנגי (DENV) באסיה ובחלקים אחרים של העולם1, הוא מארח טבעי של שני סוגים של החיידקים התוך תאיים, וולבצ'יה (wAlbA ו-wAlbB), המופצים לאורך קו הנבט והרקמה הסומטית 2,3. קו התאים Aa23 שמקורו בעוברי A. albopictus מורכב משני סוגי תאים מורפולוגיים לפחות, שניהם תומכים בזיהום4 וניתן לרפא אותם מזיהום וולבצ'יה מקומי באמצעות אנטיביוטיקה (Aa23-T). בהתחשב בכך ש- Aa23 שומר רק על wAlbB, זהו מודל שימושי לחקר אינטראקציות פונדקאי-אנדוסימביונט 4,5,6.

וולבצ'יה מועברת באופן אימהי ומדביקה כ-65% ממיני החרקים 8,9 ו-28% ממיני היתושיםבני 10. הוא מדביק מגוון רקמות ויוצר מערכת יחסים סימביוטית אינטימית עם המארח, בדרך כלל גורם לחוסר תאימות ציטופלסמית (CI)11 ולהחלפת אוכלוסייה על ידי מניפולציה של מערכת הרבייה המארחת 12,13. תגובות פונדקאיות אלה נצפו באוכלוסיות טבעיות של דרוזופילה סימולנס14 וב-A. aegypti בכלוב מעבדה ובניסוי שדה15. מניפולציה לא-רבייתית חשובה שנוצרה על ידי וולבצ'יה היא עמידות מארח מושרית למגוון פתוגנים, כולל DENV, נגיף צ'יקונגוניה (CHIKV) ונגיף הנילוס המערבי (WNV)16,17, שעשוי להיות מתווך על ידי מערכת חיסונית מולדת משופרת של הסימביונט18,19, תחרות בין וולבצ'יה לנגיפים על משאבים מארחים חיוניים20, ומניפולציה של מסלולי הגנה נגיפיים מארחים21 .

פרוטוקול זה פותח לחקר המנגנונים הבסיסיים האלה של תגובות אנטי-ויראליות של פונדקאי המושרה על-ידי וולבצ'יה. הוא משתמש בארבע שיטות לגילוי של זיהום וולבצ'יה תוך תאי של תאי Aa23. שיטות אלה מספקות בסיס תיאורטי חזק למחקרים על זיהום וולבצ'יה תוך-תאי של מינים מארחים אחרים. השיטה הראשונה, PCR - טכניקה רבת עוצמה המאפשרת הגברה אנזימטית של אזורים ספציפיים בדנ"א מבלי להשתמש בהליכי שיבוט קונבנציונליים - שימשה לאיתור דנ"א של וולבצ'יה ולקבוע את נוכחותו/היעדרו של זיהום וולבצ'יה 22. השיטה השנייה מודדת את צפיפות העתקת הדנ"א של וולבצ'יה באמצעות PCR כמותי (qPCR) לזיהוי ומדידה אמינים של מוצרים שנוצרו במהלך כל מחזור PCR, אשר פרופורציונלי ישירות לכמות התבנית לפני PCR23. השיטה השלישית מזהה נוכחות של חלבוני וולבצ'יה תוך-תאיים, תוך שימוש בכתם מערבי - אחד הכלים החזקים ביותר לאיתור חלבונים ספציפיים בתערובות מורכבות על ידי שילוב של כוח ההפרדה הגבוה של אלקטרופורזה, הספציפיות של נוגדנים ורגישות של תגובות אנזימטיות כרומוגניות. השיטה הסופית היא בדיקת אימונופלואורסצנציה (IFA) המשלבת אימונולוגיה, ביוכימיה ומיקרוסקופיה כדי לזהות את חלבון פני השטח של וולבצ'יה (wsp) באמצעות תגובת אנטיגן-נוגדן כדי לאשר את הספיגה התאית של וולבצ'יה ולקבוע את לוקליזציה התאית שלה.

מאמר זה מתאר את ארבע השיטות המפורטות לעיל כדי לאמת את קיומה של וולבצ'יה בתאים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות אם וולבצ'יה האקסוגנית עברה בהצלחה טרנספקציה והוולבצ'יה בתא נוקתה. לאחר קביעה אם וולבצ'יה קיימת בתאים או לא, ניתן לבצע מגוון ניתוחים שונים, כולל גנומיקה, פרוטאומיקה או מטבוליקה. פרוטוקול זה מדגים את הזיהוי של וולבצ'יה באמצעות תאי Aa23, אך ניתן להשתמש בו גם בתאים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. חומרים וריאגנטים

  1. השתמש בתמיסות ובמדיה ללא פירוגן עבור תרבית תאים (ראה טבלת החומרים).
  2. השתמש במים אולטרה-פורים כדי להכין את כל הפתרונות.
  3. היזהרו בבחירת סרום בקר עוברי (FBS) לתרבית תאים, לאחר תהליך בדיקה רב.
    הערה: מכיוון שהרבה FBS כפופים לשינויים קבועים, אי אפשר לציין את הקטלוג הרלוונטי ואת מספרי המגרשים בפרוטוקול זה.
  4. זני תאי Aa23 נבחרים שמקורם בביצי A. albopictus, המתאימים ל-Aa23-T נטול וולבצ'יה.

2. תרבית תאים

  1. הכינו 25 ס"מ2 צלוחיות תרביות תאים עם 4 מ"ל של המדיום של שניידר עם 10% FBS.
  2. דגירה של הצלוחיות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס מתחת לאטמוספירה של 5% CO2 למשך 5 עד 7 ימים 7,24.
  3. התבוננו בתאי Aa23 ו-Aa23-T לא מוכתמים בצלוחיות באמצעות מיקרוסקופיית אור בהגדלה של פי 100 (איור 1).

3. מיצוי דנ"א

  1. תרבית את התאים למשך 5-7 ימים עד 70-80% מפגש לכל בקבוקון (שלב 2). קציר את התאים עם צנרת ידנית מ 1 מ"ל של מדיום תרבית resuspended על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 100 × גרם ב microcentrifuge.
  2. הסר את ה-supernatant לפי שאיפה ואחסן את גלולת התא שנוצרה בטמפרטורה של -20 °C (75 °F).
  3. בצעו החייאה של הכדורים ב-0.40 מ"ל של מלחים עם מאגר פוספט (PBS), הניחו 50 μL של התמיסה בצינור מיקרוצנטריפוגה, הוסיפו 5 μL של פרוטאינאז K (20 מ"ג/מ"ל) ודגרו ב-55 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לבסוף, חממו את הצינורות האלה בטמפרטורה של 99 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להשיג את הדנ"א הגולמי ולאחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

4. זיהוי חומצת גרעין וולבצ'יה

  1. ניתוח PCR
    1. בצע PCR בנפח תגובה כולל של 20 μL, המכיל 8 μL של ddH2O, 10 μL של Taq פולימראז (ראה טבלת החומרים), 1 μL של תבנית DNA (משלב 3), 0.5 μL של פריימרים קדימה ואחורה (10 μM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC AGAAAC 3') ו - wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, בהתאמה.
    2. השתמש בתנאי ה- PCR הבאים: דנטורציה ראשונית ב- 95 ° C למשך 5 דקות, ואחריה 35 מחזורים של דנטורציה ב - 94 ° C, חישול ב - 55 ° C, והרחבה ב - 72 ° C; לאחר מכן, הארכה סופית ב 72 °C (72 °F) למשך 7 דקות.
    3. זהה את הדנ"א על ג'ל אגרוז של 1% (1% w/v agarose ב-PBS) באמצעות מצלמת ג'ל.
  2. ניתוח qPCR
    1. נתח את עותק הגנום של וולבצ'יה עבור שלושה שכפולים ביולוגיים (n = 6) מהדנ"א שחולץ (שלב 3) באמצעות פריימרים wsp 183 F (5' AAGGAACCGAGAAGTTCATG 3') ו - QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, מנורמל עם חלבון ריבוזומלי S6 (RPS6) פריימרים קדימה ואחורה (5' GAAGTTGAGAACGTATCGTTTC 3' ו- 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', בהתאמה)3.
    2. צור עקומה סטנדרטית עבור wAlbB ו- RPS6.
      1. חלצו דנ"א מ-PMD-18T (וקטור מיוחד לשיבוט יעיל של תוצרי PCR (שיבוט TA)) רקומביננטי פלסמיד המכיל מקטעי גנים wsp ו-rps6 (קובץ משלים) ומדדו את ריכוז הדנ"א של הפלסמיד (ראו טבלת החומרים).
      2. המרת ריכוז הדנ"א של הפלסמיד להעתקת ריכוז המספרים באמצעות Eq (1).
        מספר עותק של פלסמיד = Equation 1 (1)
      3. דיללו את מספר העתק הפלסמיד מ-101 עד 108 במים אולטרה-פוריים, וקחו 3 שכפולים לכל שיפוע ריכוז.
      4. בצע הגברת qPCR באמצעות TB Green ומערכת PCR בזמן אמת (ראה טבלת החומרים), ותעד את התוצאות של כל תגובה. השתמש בערך Ct כדי לפתח עקומה סטנדרטית. נתחו את הדנ"א בנפח תגובה כולל של 20 μL, הכולל 7 μL של ddH2O, 10.4 μL של TB Green (ראו טבלת החומרים), 1 μL של תבנית DNA (המסופקת על ידי שלב 3) ו-0.8 μL של פריימרים קדימה ואחורה (10 μM). השתמש בתנאי התגובה הבאים: דנטורציה ראשונית בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריה 40 מחזורים של דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס במשך 10 שניות, וחישול ב-60 מעלות צלזיוס במשך 35 שניות.
      5. חשב את מספרי העתקת הגנים WSP ו- RPS6 בתאים על פי עקומת התקן שנקבעה והצפיפות היחסית של וולבצ'יה לפי מספר העותק של wsp/RPS6. נתח את הנתונים באמצעות מבחן t דגימות עצמאי.
  3. ניתוח כתמים מערביים של חלבון וולבצ'יה
    1. מיצוי חלבונים
      1. אסוף 2 × 107 תאי Aa23 ו- Aa23-T מלוח ששת הבארות (משלב 2) בצינור microcentrifuge, שטפו אותם שלוש פעמים עם PBS, וצנטריפוגות אותם ב-100 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      2. הכינו 1 מ"ל ליזאטים עם מאגר ליזה RIPA (50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1% נתרן דאוקסיכלאט, 0.1% נתרן דודציל סולפט [SDS], 2 mM נתרן פירופוספט, 25 mM β-גליצרופוספט, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל לאופפטין) ו-PMSF (ריכוז סופי של 1 mM).
      3. הוסיפו 200 μL של חיץ ליזיס לכדור התא ושמרו במשך 30 דקות על קרח. צנטריפוגה את הליזאטים ב 12,000 × g במשך 10 דקות ב 4 °C (74 °F) ולהסיר את supernatant.
    2. בדקו את ריכוז ה-wsp של ה-supernatant באמצעות ערכת בדיקת חלבונים של חומצה ביצ'ינצ'ונינית (BCA) (ראו טבלת החומרים) בהתאם להוראות היצרן.
    3. טען כמויות שוות של חלבון על ג'ל SDS-PAGE של 15% [10% מים מזוקקים; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8.8; 1% (10% SDS), 1% (10% אמוניום פרסולפט), 0.04% TEMED].
    4. מעבירים את החלבון לממברנות ניטרוצלולוז, חוסמים את הממברנות עם 5% חלב דל שומן למשך 2 שעות 26,27 בטמפרטורת החדר, ואז שוטפים את הממברנות שלוש פעמים עם TBST (1 מ"ל של Tween 20 ב-1 L של TBS) (ראו טבלת החומרים).
    5. דגירה של הממברנות למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם 100 μL של נוגדן פוליקלונלי נגד wsp (מוכן בתוך הבית, ראה קובץ משלים)), שהוכן על ידי דילול הנוגדן העיקרי עם 5% חלב דל שומן (1:12,000).
    6. לשטוף את הנוגדן העיקרי שלוש פעמים עם TBST.
    7. דגירה של הממברנות ב-100 μL של נוגדן משני מצומד חזרת (HRP) על שייקר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    8. לשטוף את הממברנות שלוש פעמים עם TBST, ולערבב 20 μL של פתרון A (HRP מצע לומינול מגיב) ו 20 μL של פתרון B (HRP מצע פרוקסיד מגיב) בערכת זיהוי chemiluminescence ביחס של 1:1. לטבול את כל הממברנה לתוך תמיסת luminescence באותו זמן, ולצפות באותות באמצעות מערכת הדמיה רב תכליתית.
  4. לוקליזציה אימונופלואורסצנטית של חלבון וולבצ'יה
    1. דגירה 5 × 105 תאי Aa23 ו-Aa23-T בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס על צלחת פטרי קונפוקלית בלייזר בעובי של 0.17 מ"מ בתחתית, תחת אטמוספירה של 5% CO2 למשך 3 עד 4 ימים 7,24. המתן עד שהתא יהיה 60%-70% מפגש ושטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
    2. תקן את התאים במשך 20 דקות ב 4 °C ב 1 מ"ל של 4% (w / v) paraformaldehyde ב- PBS.
    3. שטפו את התאים הקבועים באמצעות PBST (0.2% v/v Triton X-100 ב-PBS) למשך 5 דקות ושטפו את התאים שוב פעמיים עם PBS.
    4. דגירה של השקופיות למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-1 מ"ל של 3% (w/v) אלבומין בסרום בקר ב-PBS.
    5. דגירה של המגלשות למשך הלילה ב-100 μL של נוגדנים פולישבטיים נגד wsp של עכברים (מוכנים בבית) וסרום עכברים (דילול של 1:1,000 ב-PBS) בקופסה רטובה (היא יכולה לשמור על לחות ולמנוע אידוי לחות) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    6. הסר את המגלשות מהקופסה הרטובה והחזיר אותן לטמפרטורת החדר; לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS ולהסיר את PBS.
      הערה: משלב 4.4.7 ואילך, יש להגן על כל הפעולות מפני אור.
    7. הדגירה של המגלשות עם 100 μL של נוגדן אלקסה פלואור 488-מצומד נגד עכברים (1:2,000 דילול ב-PBS) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    8. דגירה של שקופיות הדגימה עם 50 מיקרול של 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI מדולל ב-PBS ל-10 מיקרוגרם/מ"ל, נקשר חזק לדנ"א) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואז שטפו אותן שלוש פעמים עם PBS.
    9. התבונן בכישרון החיסוני תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.
      1. הפעל את הכוח ואת הלייזר.
      2. הפעל את המנורות הרגילות והכספית של המיקרוסקופ.
      3. הפעל את המערכת והפעל את תוכנת ההפעלה. שים טיפה של שמן ארז על שקופיות הדגימה, מקם את שקופיות הדגימה על שלב המיקרוסקופ, והזיז את הבמה למיקום המתאים.
      4. לחצו על כפתור התצפית של מנורת הכספית בתוכנה, פתחו את תריס מנורת הכספית והתבוננו בדגימה מתחת למיקרוסקופ הפוך כדי להתמקד.
      5. השתמש בלוח הבקרה הידני כדי לבחור פלואורסצנציה ירוקה וכחולה כדי לצלם תמונות פלואורסצנציה תחת הגדלה של פי 100.
      6. כבו את כפתור התצפית על מנורת הכספית והתחילו לרכוש תמונות.
      7. כדי להבטיח איכות תמונה טובה, סרוק מראש לפי גודל סריקה (512 פיקסלים x 512 פיקסלים). התאם את גודל הסריקה כדי לקבל תמונות ברורות (1,024 פיקסלים x 1,024 פיקסלים).
      8. בצע הפחתת רעש אם רעשי הרקע גבוהים מדי.
      9. הפסק לסרוק ולשמור את התמונות.
      10. כבו את מנורת הכספית והלייזרים.
      11. נגב את המטרה עם 75% אלכוהול והורד את המטרה למיקום הנמוך ביותר.
      12. כבו את עוצמת התריס והמיקרוסקופ.
      13. לאחר שהמכשיר התקרר, מכסים אותו בכיסוי האבק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לפני שוולבצ'יה זוהתה, תאי Aa23 ו-Aa23-T נצפו תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע הבדלים מורפולוגיים בין שני קווי התאים. לתאי Aa23 ו-Aa23-T יש לפחות שתי מורפולוגיות של תאים, אך אין הבדל מורפולוגי ברור בין שני סוגי התאים (איור 1). כאן, תאי Aa23 שימשו כמערכת מודל לזיהוי זיהום וולבצ'יה באמצעות ארבע שיטות. הגברה חיובית של הגן Wolbachiawsp באמצעות פריימרים אבחנתיים 81F/691R הייתה אפשרית בתאי Aa23 (נתיבים 1 ו-2) אך לא בתאי Aa23-T (נתיבים 3 ו-4) (איור 2A). הניתוח של צפיפות וולבצ'יה בקווי התאים באמצעות qPCR הראה יחס wsp/rps6 של 2.4 בתאי Aa23, אך ללא וולבצ'יה בתאי Aa23-T (איור 2B). ניתוח כתמים מערבי של תמציות חלבונים הראה אות wsp חזק עבור Aa23 וללא אות ל-Aa23-T (איור 3A),בעוד שבדיקת האימונופלואורסצנציה העקיפה זיהתה את חלבון ה-wsp (איור 3B) בתאי Aa23 (ירוק), בעוד שרק דנ"א מוכתם ב-DAPI (כחול) זוהה בתאי Aa23-T.

Figure 1
איור 1: מיקרוסקופיית אור של תאי Aa23 ו-Aa23-T שאינם מוכתמים. מורפולוגיה הטרוגנית מצביעה על כך שיותר מסוג אחד של תאים קיים בשני קווי התאים, כפי שמציינים החצים. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: זיהוי זיהום וולבצ'יה בתאים ברמת חומצות הגרעין. (A) ניתוח PCR של תאי Aa23 ו-Aa23-T נפתר על ג'ל אגרוז של 1%. הגברה חיובית של PCR של הגן Wolbachiawsp באמצעות פריימרים אבחנתיים, 81F/691R, שנצפו בתאי Aa23 (נתיבים 1 ו-2) אך לא בתאי Aa23-T (נתיבים 3 ו-4). (B) וולבצ'יה wsp צפיפות העתקה של תאי Aa23 ו-Aa23-T. הצפיפות הייתה גדולה יותר בתאי Aa23 ובלתי ניתנת לגילוי בתאי Aa23-T. מספר העותק היה מנורמל באמצעות Aedes albopictus rps6; הנתונים הם ממוצעים ± SEM, n = 6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: זיהוי זיהום וולבצ'יה בתאים ברמת החלבון. (A) אימונובלוטציה עם נוגדן wsp בתאי Aa23 (נתיב 1), עם פס ברור ליד 25 kDa; Aa23-T (נתיב 2), שטופל בטטרציקלין. (B) תיוג אימונופלואורסצנטי של תאים המציג את הלוקליזציה של וולבצ'יה (ירוק); התאים נחקרו עם נוגדנים אנטי-wsp פוליקלונליים (Wolbachia), ואחריהם נוגדנים מצומדים של אלקסה פלואור 488-488 של אלקסה פלואור (ירוק), וגרעינים (כחולים) מוכתמים ב-DAPI. סרום העכברים שימש כבקרה שלילית מכיוון שהנוגדן נגד wsp לא טוהר, והנוגדן הפוליקלונלי נגזר מעכבר. תאי Aa23 (Aa23-anti-wsp) הנגועים בוולבצ'יה מסומנים בחץ לבן. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצור: DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול; M = סמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים: יצירת פלסמיד והכנת נוגדנים נגד wsp. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זיהוי של זיהום וולבצ'יה תוך-תאי חיוני לחקר אינטראקציות וולבצ'יה-מארח ולאישור של טרנספקציה מוצלחת של תאים עם זנים חדשים. בפרוטוקול זה, ארבע שיטות שימשו כדי לזהות בהצלחה זיהום וולבצ'יה תוך תאי ברמות חומצת הגרעין והחלבון. ארבע שיטות ניסיוניות אלה אימתו ושיפרו את דיוק הזיהוי של זיהום וולבצ'יה של תאים.

PCR שימש לזיהוי נוכחות של זיהום וולבצ'יה של תאים ברמת חומצת הגרעין. עם זאת, מכיוון שהוא אינו מכמת את רמות הזיהום28,29, qPCR שימש לכימות צפיפות העתקות DNA 28,30. מכיוון שהדיוק של שיטות PCR עשוי להיות מושפע מיעילות הגברה נמוכה ומתוצאות חיוביות כוזבות, חשוב להבטיח איכות טובה של דנ"א, במיוחד עבור זיהוי qPCR, שבו יש להניח ריאגנטים ותבניות על קרח כדי למנוע דנטורציה, והפעולות צריכות להתבצע על פי שיטות סטנדרטיות. יעילות הגברה נמוכה נוטה להיגרם כתוצאה מהתפרקות ריאגנטים במערכת התגובה, כמויות תבנית לא מספיקות ו/או אורך מוגזם של שברי פריימר מורחבים28. תוצאות חיוביות כוזבות נגרמות בדרך כלל על ידי זיהום של ריאגנטים ותבניות, רמות גבוהות של ריכוז פריימרים, ו/או מבני פריימר דימר וסיכות שיער. לכן, חשוב לוודא כי ריאגנטים הם באיכות גבוהה, פריימרים מותאמים על בסיס הספרות, ותוכנה מתאימה המשמשת לתכנון פריימרים.

שתי שיטות שתוארו לעיל מזהות זיהום וולבצ'יה תוך תאי ברמת חומצת הגרעין; השניים האחרים מזהים זיהום וולבצ'יה תוך תאי ברמת החלבון. כתם מערבי שימש לקביעת זיהום וולבצ'יה תוך-תאי בתאי Aa23 ו-Aa23-T ברמת החלבון. בעיות הקשורות לשיטה זו קשורות להכנת דגימה, דגירה של נוגדנים וזיהוי31. שלבים קריטיים בתהליך זיהוי הכתמים המערבי כוללים שימוש בדגימות טריות ומלאות ונוגדנים משניים נכונים, אותם יש לאמת ולדלל על פי ההוראות בדילול של 1:12,000. על פי דרישות הניסוי, ניתן לשלב שיטה זו גם עם שיטות חיסון אחרות. לכן, Immunofluorescence שימש כדי למקם זיהום תוך תאי על ידי Wolbachia31 , כי זה לא זוהה ישירות באמצעות PCR, qPCR, או ניתוחי כתמים מערביים. ישנם כמה שלבים קריטיים שיש לשים לב אליהם לגבי אימונופלואורסצנציה. ראשית, הבטיחו את האיכות האופטימלית של דגימות התאים והימנעו מזיהום. זיהום של תאים על ידי באג דבק שחור, אשר יכול גם להיות מוכתם, ישפיע קשות על הפרשנות של התוצאות. שנית, צפיפות התאים במנות הקונפוקליות בלייזר חייבת להיות כ-60-70%. לבסוף, שטיפה עם PBS לאחר דגירה לדוגמה היא קריטית כדי לקבל תמונות פלואורסצנטיות ברורות.

תוך שימוש בשיטות כמותיות וחזותיות יחסיות ומוחלטות לזיהוי זיהום וולבצ'יה תוך-תאי ברמות חומצות הגרעין והחלבון, פרוטוקול זה מקיף ומדויק יותר מהשימוש בכל שיטה בודדת. בנוסף, בניית עקומת תקן כפול (עבור wsp ו- RPS6) מביאה לדרישות פחות מחמירות עבור מערכת ה- PCR ויעילות הגברה וחיסול חלקי של השגיאה הניסיונית בעיבוד הנתונים הסופי, מה שמפחית מאוד את עבודת הניסוי. עם זאת, היו כמה מגבלות לפרוטוקול זה. ראשית, הנוגדן נגד wsp מוכן בתוך הבית ועדיין לא מסחור. שנית, למרות שלא היו רצועות נוספות בשל הנוגדן הפוליקלונלי האנטי-wsp הלא-מבוקר בכתם המערבי, מה שמעיד על טוהר נוגדנים, קבוצת הביקורת השלילית שהשתמשה בסרום העכברים הייתה גם בעלת רקע פלואורסצנטי ירוק, שלא תרם לפרשנות התוצאות. בעוד שניתן לשפר את הדיוק של הכתם המערבי ושיטות האימונופלואורסצנציה על ידי הבטחת השימוש בנוגדנים מטוהרים או בבדיקות פלואורסצנטיות מדויקות, נדרשים מחקרים וניתוחים נוספים של נתונים אמפיריים. לסיכום, פרוטוקול מקיף ומדויק יותר מדווח על זיהוי זיהום וולבצ'יה בתאי Aa23 באמצעות ארבע שיטות ששימשו במחקרים קודמים של וולבצ'יה. הפרוטוקול המתואר כאן חל על זיהוי וולבצ'יה בסוגים אחרים של תאים ורקמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר שין-רו וואנג מאוניברסיטת מינסוטה על הצעות והדרכה תובנות. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (No.81760374).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Zeiss SteREO Discovery V8
Petri dish Fisher Scietific FB0875713
Pipette Pipetman F167380 P10
inSituX platform
Analysis software In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet MSE Supplies Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder In-house developed
Control software In-house developed
Immersion oil Cargille Laboratories 16482 Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform In-house developed
IR light source  Thorlabs Incorporated LED1085L LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring  In-house developed
Pump lasers  Thorlabs Incorporated LD785-SE400 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi Raspberry Pi Fundation
Retaining ring Thorlabs Incorporated SM1RR SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal University Wafers, Inc. U01-W2-L-190514 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim In-house developed
X-ray beam stop In-house developed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
  2. Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
  3. Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
  4. O'Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
  5. Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
  6. Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
  7. Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
  8. Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
  9. Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
  10. Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
  11. O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , Oxford University Press. (1997).
  12. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
  13. Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
  14. Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
  15. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  16. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
  17. Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).
  18. Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).
  19. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
  20. Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).
  21. Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
  22. Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
  23. Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).
  24. Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).
  25. Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
  26. Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
  27. Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
  28. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
  29. Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
  30. Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
  31. Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 184
זיהוי זן <em>וולבצ'יה</em> wAlbB ב <em>Aedes albopictus</em> קווי תאים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng,… More

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng, J., Wu, J. Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines. J. Vis. Exp. (184), e63662, doi:10.3791/63662 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter