Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Detectie van Wolbachia Stam wAlbB in Aedes albopictus cellijnen

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63662
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1
1Guizhou Medical University, 2Guizhou Health Vocational College
* These authors contributed equally

Summary

Vier methoden werden gebruikt om intracellulaire Wolbachia te detecteren, die elkaar aanvulden en de detectienauwkeurigheid van Wolbachia-infectie van Aedes albopictus-afgeleide Aa23 en Aa23-T genezen van inheemse Wolbachia-infectie met behulp van antibiotica verbeterden.

Abstract

Als moederlijk gekoesterde endosymbiont infecteert Wolbachia grote delen van de insectenpopulaties. Studies hebben onlangs de succesvolle regulatie van RNA-virusoverdracht gemeld met behulp van Wolbachia-getransfecteerde muggen. Belangrijke strategieën om virussen te beheersen zijn de manipulatie van de reproductie van de gastheer via cytoplasmatische incompatibiliteit en de remming van virale transcripties via immuunpriming en concurrentie voor van de gastheer afgeleide bronnen. De onderliggende mechanismen van de reacties van Wolbachia-getransfecteerde muggen op virale infectie zijn echter slecht begrepen. Dit artikel presenteert een protocol voor de in vitro identificatie van Wolbachia-infectie op het nucleïnezuur- en eiwitgehalte in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-cellen om het begrip van de interacties tussen Wolbachia en zijn insectenvectoren te verbeteren. Door het gecombineerde gebruik van polymerasekettingreactie (PCR), kwantitatieve PCR, western blot en immunologische analytische methoden is een standaard morfologisch protocol beschreven voor de detectie van Wolbachia-geïnfecteerde cellen dat nauwkeuriger is dan het gebruik van een enkele methode. Deze aanpak kan ook worden toegepast op de detectie van Wolbachia-infectie in andere insectentaxa.

Introduction

De Aziatische tijgermug Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), een belangrijke vector van het denguevirus (DENV) in Azië en andere delen van de wereld1, is een natuurlijke gastheer van twee soorten intracellulaire bacteriën, Wolbachia (wAlbA en wAlbB), die verspreid zijn over de kiembaan en somatisch weefsel 2,3. De Aa23-cellijn afgeleid van A. albopictus-embryo's bestaat uit ten minste twee morfologische celtypen, die beide infectie4 ondersteunen en kunnen worden genezen van inheemse Wolbachia-infectie met behulp van antibiotica (Aa23-T). Aangezien Aa23 alleen albbbehoudt, is het een bruikbaar model voor de studie van gastheer-endosymbionten interacties 4,5,6.

Wolbachia wordt door de moeder overgedragen en infecteert naar schatting 65% van de insectensoorten 8,9 en 28% van de muggensoorten10. Het infecteert een verscheidenheid aan weefsels en vormt een intieme symbiotische relatie met de gastheer, meestal induceren cytoplasmatische incompatibiliteit (CI)11 en populatievervanging door het manipuleren van het voortplantingssysteem van de gastheer12,13. Deze gastheerresponsen zijn waargenomen in natuurlijke populaties van Drosophila simulans14 en in A. aegypti in een laboratoriumkooi en veldproef15. Een belangrijke niet-productieve manipulatie die door Wolbachia wordt uitgelokt, is geïnduceerde gastheerresistentie tegen een verscheidenheid aan pathogenen, waaronder DENV, Chikungunya-virus (CHIKV) en West-Nijlvirus (WNV)16,17, dat kan worden gemedieerd door een verbeterd aangeboren immuunsysteem van de symbiont18,19, concurrentie tussen Wolbachia en virussen voor essentiële gastheerbronnen20, en manipulatie van gastheer virale verdedigingsroutes21 .

Dit protocol is ontwikkeld voor het bestuderen van deze onderliggende mechanismen van Wolbachia-geïnduceerde gastheer antivirale responsen. Het maakt gebruik van vier methoden voor de detectie van intracellulaire Wolbachia-infectie van Aa23-cellen. Deze methoden bieden een sterke theoretische basis voor studies van intracellulaire Wolbachia-infectie van andere gastheersoorten. De eerste methode, PCR - een krachtige techniek die de enzymatische amplificatie van specifieke DNA-regio's mogelijk maakt zonder gebruik te maken van conventionele kloonprocedures - werd gebruikt om Wolbachia-DNA te detecteren en de aanwezigheid / afwezigheid van Wolbachia-infectie te bepalen 22. De tweede methode meet de dichtheid van Wolbachia DNA-kopieën met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR) voor betrouwbare detectie en meting van producten die tijdens elke PCR-cyclus worden gegenereerd en die direct evenredig is met de hoeveelheid sjabloon vóór PCR23. De derde methode detecteert de aanwezigheid van intracellulaire Wolbachia-eiwitten , met behulp van western blot - een van de krachtigste hulpmiddelen voor het detecteren van specifieke eiwitten in complexe mengsels door de hoge scheidingskracht van elektroforese, de specificiteit van antilichamen en de gevoeligheid van chromogene enzymatische reacties te combineren. De laatste methode is een immunofluorescentietest (IFA) die immunologie, biochemie en microscopie combineert om het Wolbachia-oppervlakte-eiwit (wsp) te detecteren via een antigeen-antilichaamreactie om de cellulaire opname van Wolbachia te bevestigen en de cellulaire lokalisatie ervan te bepalen.

Dit artikel beschrijft de vier hierboven genoemde methoden om het bestaan van Wolbachia in de cellen te verifiëren, die kunnen worden gebruikt om te detecteren of de exogene Wolbachia met succes is getransfecteerd en de Wolbachia in de cel is gewist. Na het bepalen of Wolbachia al dan niet in de cellen aanwezig is, kunnen verschillende analyses worden uitgevoerd, waaronder genomics, proteomics of metabolomics. Dit protocol demonstreert de detectie van Wolbachia via Aa23-cellen, maar kan ook in andere cellen worden gebruikt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Materialen en reagentia

  1. Gebruik pyrogene oplossingen en media voor celkweek (zie de Tabel van Materialen).
  2. Gebruik ultrapuur water om alle oplossingen voor te bereiden.
  3. Wees voorzichtig bij het selecteren van foetaal runderserum (FBS) voor celkweek, na een veelcontroleproces.
    OPMERKING: Aangezien FBS-partijen regelmatig kunnen worden gewijzigd, is het onmogelijk om de relevante catalogus en lotnummers in dit protocol te vermelden.
  4. Selecteer Aa23-celstammen afgeleid van A. albopictus-eieren , overeenkomend met Wolbachia-vrije Aa23-T.

2. Celkweek

  1. Bereid 25 cm2 celkweekkolven met 4 ml Schneider's medium met 10% FBS.
  2. Incubeer de kolven bij 28 °C onder een 5% CO2-atmosfeer gedurende 5 tot 7 dagen 7,24.
  3. Observeer niet-gekleurde Aa23- en Aa23-T-cellen in de kolven met behulp van lichtmicroscopie bij 100x vergroting (figuur 1).

3. DNA-extractie

  1. Kweek de cellen gedurende 5-7 dagen tot 70-80% samenvloeiing per kolf (stap 2). Oogst de cellen met handmatig pipetteren uit 1 ml geresuspendeerd kweekmedium door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 100 × g in een microcentrifuge.
  2. Verwijder het supernatant door aspiratie en bewaar de resulterende celpellet bij -20 °C.
  3. Resuspenseer de pellets in 0,40 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), plaats 50 μL van de oplossing in een microcentrifugebuis, voeg 5 μL proteïnase K (20 mg/ml) toe en incubeer bij 55 °C gedurende 1 uur. Verwarm ten slotte deze buizen gedurende 15 minuten op 99 °C om het ruwe DNA te verkrijgen en bewaar het bij -20 °C.

4. Detectie van Wolbachia nucleïnezuur

  1. PCR-analyse
    1. Voer PCR uit in een totaal reactievolume van 20 μL, met 8 μL ddH2O, 10 μL Taq polymerase (zie de tabel met materialen), 1 μL DNA-sjabloon (uit stap 3), 0,5 μL voor- en achterwaartse primers (10 μM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') en wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, respectievelijk.
    2. Gebruik de volgende PCR-omstandigheden: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 35 cycli van denaturatie bij 94 °C, gloeien bij 55 °C en extensie bij 72 °C; vervolgens een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 7 min.
    3. Detecteer het DNA op een 1% agarose gel (1% w/v agarose in PBS) met behulp van een gel imager.
  2. qPCR-analyse
    1. Analyseer de Wolbachia-genoomkopie voor drie biologische replicaties (n = 6) uit het geëxtraheerde DNA (stap 3) met behulp van wsp-primers 183 F (5' AAGGAACCAGTTCATG 3') en QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, genormaliseerd met respectievelijk ribosomaal eiwit S6 (RPS6) voorwaartse en omgekeerde primers (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' en 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', respectievelijk)3.
    2. Genereer een standaardcurve voor wAlbB en RPS6.
      1. Extract DNA uit PMD-18T (een speciale vector voor efficiënt klonen van PCR-producten (TA-klonen)) recombinant plasmide dat wsp - en rps6-genfragmenten bevat (Supplemental File) en meet de plasmide-DNA-concentratie (zie de Tabel van Materialen).
      2. Converteer de plasmide-DNA-concentratie naar de getalconcentratie met behulp van Eq (1).
        Plasmide kopienummer = Equation 1 (1)
      3. Verdun het plasmidekopienummer van 101 tot 108 met ultrapuur water en stel 3 replicaties in voor elke concentratiegradiënt.
      4. Voer qPCR-versterking uit met TB Green en een real-time PCR-systeem (zie de tabel met materialen) en noteer de resultaten van elke reactie. Gebruik de Ct-waarde om een standaardcurve te ontwikkelen. Analyseer het DNA in een totaal reactievolume van 20 μL, bestaande uit 7 μL ddH2O, 10,4 μL TB Green (zie de tabel met materialen), 1 μL DNA-sjabloon (geleverd door stap 3) en 0,8 μL voorwaartse en omgekeerde primers (10 μM). Gebruik de volgende reactieomstandigheden: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 10 s en gloeien bij 60 °C gedurende 35 s.
      5. Bereken de WSP - en RPS6-genkopienummers in de cellen volgens de vastgestelde standaardcurve en de Wolbachia-relatieve dichtheid door het kopieernummer van wsp/RPS6. Analyseer de gegevens met behulp van een onafhankelijke t-test.
  3. Western blot analyse van Wolbachia eiwit
    1. Eiwitextractie
      1. Verzamel 2 × 107 Aa23- en Aa23-T-cellen uit de zesputtenplaat (vanaf stap 2) in een microcentrifugebuis, was ze drie keer met PBS en centrifugeer ze op 100 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      2. Bereid 1 ml lysaten met RIPA-lysisbuffer (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1% natriumdeoxycholaat, 0,1% natriumdodecylsulfaat [SDS], 2 mM natriumpyrofosfaat, 25 mM β-glycerofosfaat, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 0,5 μg/ml leupeptine) en PMSF (eindconcentratie 1 mM).
      3. Voeg 200 μL lysisbuffer toe aan de celpellet en houd het 30 minuten op ijs. Centrifugeer de lysaten bij 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant.
    2. Test de wsp-concentratie van het supernatant met behulp van een bicinchonininezuur (BCA) eiwittestkit (zie de tabel met materialen) volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Laad gelijke hoeveelheden eiwit op een 15% SDS-PAGE gel [10% gedestilleerd water; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% ammoniumpersulfaat), 0,04% TEMED].
    4. Breng het eiwit over naar nitrocellulosemembranen, blokkeer de membranen met 5% magere melk gedurende 2 h 26,27 bij kamertemperatuur en was de membranen vervolgens drie keer met TBST (1 ml Tween 20 in 1 L TBS) (zie de materiaaltabel).
    5. Incubeer de membranen 's nachts bij 4 °C met 100 μL anti-wsp polyklonaal antilichaam (in eigen huis bereid, zie aanvullend dossier)), bereid door het primaire antilichaam te verdunnen met 5% magere melk (1:12.000).
    6. Was het primaire antilichaam drie keer met TBST.
    7. Incubeer de membranen in 100 μL mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam op een shaker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    8. Was de membranen driemaal met TBST en meng 20 μL oplossing A (HRP Substrate Luminol Reagent) en 20 μL oplossing B (HRP Substrate Peroxide Reagent) in de chemiluminescentiedetectiekit in een verhouding van 1:1. Dompel het hele membraan tegelijkertijd onder in de luminescentieoplossing en observeer de signalen met behulp van een multifunctioneel beeldvormingssysteem.
  4. Immunofluorescentielokalisatie van Wolbachia-eiwit
    1. Incubeer 5 × 105 Aa23- en Aa23-T-cellen bij 28 °C op een laserconfiscale petrischaal met een dikte van 0,17 mm aan de onderkant, onder een 5% CO2-atmosfeer gedurende 3 tot 4 dagen 7,24. Wacht tot de cel 60% -70% samenvloeiing heeft en was de cellen drie keer met PBS.
    2. Fixeer de cellen gedurende 20 minuten bij 4 °C in 1 ml van 4% (g/v) paraformaldehyde in PBS.
    3. Was de vaste cellen met PBST (0,2% v/v Triton X-100 in PBS) gedurende 5 minuten en was de cellen twee keer opnieuw met PBS.
    4. Incubeer de dia's gedurende 1 uur bij 37 °C in 1 ml runderserumalbumine van 3% (w/v) runderserum in PBS.
    5. Incubeer de dia's 's nachts in 100 μL muis anti-wsp polyklonaal antilichaam (bereid in eigen huis) en muizenserum (1:1.000 verdunning in PBS) in een natte doos (het kan de luchtvochtigheid handhaven en voorkomen dat vocht verdampt) bij 4 °C.
    6. Verwijder de dia's uit de natte doos en breng ze terug naar kamertemperatuur; was ze drie keer met PBS en verwijder de PBS.
      OPMERKING: Vanaf stap 4.4.7 moeten alle bewerkingen tegen licht worden beschermd.
    7. Incubeer de dia's met 100 μL van een Alexa Fluor 488-geconjugeerd geitenantimuisantilichaam (1:2.000 verdunning in PBS) bij 37 °C gedurende 30 minuten.
    8. Incubeer de monsterglaasjes met 50 μL 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI verdund in PBS tot 10 μg/ml, bindt sterk aan DNA) bij 37 °C gedurende 5 minuten en was ze vervolgens driemaal met PBS.
    9. Observeer de immunostaining onder een confocale microscoop.
      1. Schakel de stroom en de laser in.
      2. Schakel de normale en kwiklampen van de microscoop in.
      3. Start het systeem en voer de besturingssoftware uit. Plaats een druppel cederolie op de monsterglaasjes, plaats de monsterglaasjes op het microscoopstadium en verplaats het podium naar de juiste positie.
      4. Klik op de kwiklampobservatieknop in de software, open de kwiklampsluiter en observeer het monster onder een omgekeerde microscoop om scherp te stellen.
      5. Gebruik het handmatige bedieningspaneel om groene en blauwe fluorescentie te selecteren om fluorescentiefoto's te maken onder een vergroting van 100x.
      6. Schakel de observatieknop van de kwiklamp uit en begin met het verkrijgen van afbeeldingen.
      7. Om een goede beeldkwaliteit te garanderen, scant u vooraf op scangrootte (512 pixels x 512 pixels). Pas de scangrootte aan om duidelijke afbeeldingen te krijgen (1.024 pixels x 1.024 pixels).
      8. Voer ruisonderdrukking uit als het achtergrondgeluid te hoog is.
      9. Stop met scannen en sla de afbeeldingen op.
      10. Schakel de kwiklamp en lasers uit.
      11. Veeg het doel af met 75% alcohol en verlaag het doel naar de laagste positie.
      12. Schakel de sluiter en de microscoop uit.
      13. Nadat het instrument is afgekoeld, bedek het met de stofkap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voordat Wolbachia werd gedetecteerd, werden Aa23- en Aa23-T-cellen waargenomen onder een lichtmicroscoop om eventuele morfologische verschillen tussen de twee cellijnen te bepalen. Aa23- en Aa23-T-cellen hebben ten minste twee celmorfologieën, maar geen duidelijk morfologisch verschil tussen de twee celtypen (figuur 1). Hier werden Aa23-cellen gebruikt als een modelsysteem om Wolbachia-infectie te detecteren met behulp van vier methoden. Positieve amplificatie van het Wolbachiawsp-gen met behulp van de diagnostische primers 81F/691R was mogelijk in Aa23-cellen (Lanes 1 en 2) maar niet in Aa23-T-cellen (Lanes 3 en 4) (Figuur 2A). De analyse van wolbachia-dichtheid in de cellijnen met behulp van qPCR toonde een wsp/rps6-verhouding van 2,4 in Aa23-cellen, maar geen Wolbachia in Aa23-T-cellen (figuur 2B). Western blot-analyse van eiwitextracten toonde een sterk wsp-signaal voor Aa23 en geen signaal voor Aa23-T (figuur 3A),terwijl de indirecte immunofluorescentietest het wsp-eiwit (figuur 3B) in Aa23-cellen (groen) detecteerde, terwijl alleen DNA gekleurd met DAPI (blauw) werd gedetecteerd in Aa23-T-cellen.

Figure 1
Figuur 1: Lichtmicroscopie van niet-gekleurde Aa23- en Aa23-T-cellen. Heterogene morfologie geeft aan dat er meer dan één celtype aanwezig is in beide cellijnen, zoals aangegeven door de pijlen. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Detectie van Wolbachia-infectie in cellen op nucleïnezuurniveau. (A) PCR-analyse van Aa23- en Aa23-T-cellen opgelost op een 1% agarose-gel. Positieve PCR-amplificatie van het Wolbachiawsp-gen met behulp van de diagnostische primers, 81F/691R, waargenomen in Aa23-cellen (Lanes 1 en 2) maar niet in Aa23-T-cellen (Lanes 3 en 4). (B) Wolbachia wsp kopieerdichtheid van Aa23- en Aa23-T-cellen. De dichtheid was groter in Aa23-cellen en niet detecteerbaar in Aa23-T-cellen. Het kopienummer werd genormaliseerd met behulp van Aedes albopictus rps6; de gegevens zijn gemiddeld ± SEM, n = 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Detectie van Wolbachia-infectie in cellen op eiwitniveau. (A) Immunoblotting met wsp-antilichaam in Aa23-cellen (Lane 1), met een duidelijke band in de buurt van 25 kDa; Aa23-T (Lane 2), die werd behandeld met tetracycline. (B) Immunofluorescentie labeling van cellen die de lokalisatie van Wolbachia (groen) laten zien; cellen werden onderzocht met polyklonaal anti-wsp-antilichaam (Wolbachia), gevolgd door geiten-antimuis (groen) Alexa Fluor 488-geconjugeerde antilichamen en kernen (blauw) zijn gekleurd met DAPI. Muizenserum werd gebruikt als een negatieve controle omdat het anti-wsp-antilichaam niet was gezuiverd en het polyklonale antilichaam was afgeleid van muizen. Aa23-cellen (Aa23-anti-wsp) geïnfecteerd met Wolbachia worden aangegeven met een witte pijl. Schaalstaven = 10 μm. Afkorting: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; M = marker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand: Plasmide-generatie en anti-wsp-antilichaampreparaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detectie van intracellulaire Wolbachia-infectie is essentieel voor de studie van Wolbachia-gastheerinteracties en de bevestiging van succesvolle transfectie van cellen met nieuwe stammen. In dit protocol werden vier methoden gebruikt om intracellulaire Wolbachia-infectie met succes te detecteren op het nucleïnezuur- en eiwitniveau. Deze vier experimentele methoden bevestigden en verbeterden de detectienauwkeurigheid van Wolbachia-infectie van cellen.

PCR werd gebruikt om de aanwezigheid van Wolbachia-infectie van cellen op nucleïnezuurniveau te detecteren. Omdat het echter geen infectieniveaus kwantificeert28,29, werd qPCR gebruikt om de DNA-kopieerdichtheid28,30 te kwantificeren. Aangezien de nauwkeurigheid van PCR-methoden kan worden beïnvloed door een lage amplificatie-efficiëntie en fout-positieven, is het belangrijk om een goede kwaliteit van het DNA te waarborgen, met name voor qPCR-detectie, waarbij reagentia en sjablonen op ijs moeten worden geplaatst om denaturatie te voorkomen en bewerkingen volgens standaardmethoden moeten worden uitgevoerd. Lage versterkingsefficiëntie wordt meestal veroorzaakt door reagensafbraak in het reactiesysteem, onvoldoende sjabloonhoeveelheden en/of overmatige lengte van verlengde primerfragmenten28. Valse positieven worden meestal veroorzaakt door verontreiniging van reagentia en sjablonen, hoge niveaus van primerconcentratie en / of dimeer- en haarspeldprimerstructuren. Daarom is het belangrijk om ervoor te zorgen dat reagentia van hoge kwaliteit zijn, primers worden geoptimaliseerd op basis van de literatuur en geschikte software die wordt gebruikt voor primerontwerp.

Twee hierboven beschreven methoden detecteren intracellulaire Wolbachia-infectie op nucleïnezuurniveau; de andere twee detecteren intracellulaire Wolbachia-infectie op eiwitniveau. Western blotting werd gebruikt om intracellulaire Wolbachia-infectie van Aa23- en Aa23-T-cellen op eiwitniveau te bepalen. Problemen in verband met deze methode houden verband met monstervoorbereiding, antilichaamincubatie en detectie31. Kritieke stappen in het detectieproces van western blotting omvatten het gebruik van verse en volledig gelyseerde monsters en correcte secundaire antilichamen, die moeten worden gevalideerd en verdund volgens de instructies bij een verdunning van 1:12.000. Volgens de experimentele vereisten kan deze methode ook worden gecombineerd met andere immunisatiemethoden. Daarom werd immunofluorescentie gebruikt om intracellulaire infectie door Wolbachia31 te lokaliseren , omdat dit niet direct wordt gedetecteerd met behulp van PCR-, qPCR- of western blot-analyses. Er zijn enkele kritieke stappen om op te merken over immunofluorescentie. Zorg eerst voor de optimale kwaliteit van celmonsters en voorkom besmetting. Besmetting van cellen door zwarte lijmwants, die ook kan worden gekleurd, zal de interpretatie van de resultaten ernstig beïnvloeden. Ten tweede moet de celdichtheid in de laser confocale schotels ~ 60-70% zijn. Ten slotte is wassen met PBS na incubatie van het monster van cruciaal belang om duidelijke fluorescentiebeelden te krijgen.

Met behulp van relatieve en absolute kwantitatieve en visuele methoden om intracellulaire Wolbachia-infectie op nucleïnezuur- en eiwitniveaus te detecteren, is dit protocol uitgebreider en nauwkeuriger dan het gebruik van een enkele methode. Bovendien resulteert het construeren van een dubbele standaardcurve (voor wsp en RPS6) in minder strenge eisen voor het PCR-systeem en versterkingsefficiëntie en gedeeltelijke eliminatie van de experimentele fout in de uiteindelijke gegevensverwerking, wat het experimentele werk aanzienlijk vermindert. Er waren echter enkele beperkingen aan dit protocol. Ten eerste wordt het anti-wsp-antilichaam in eigen huis bereid en is het nog niet gecommercialiseerd. Ten tweede, hoewel er geen extra banden waren vanwege het ongezuiverde polyklonale anti-wsp-antilichaam in western blotting, wat wijst op antilichaamzuiverheid, had de negatieve controlegroep die muizenserum gebruikte ook een groene fluorescentieachtergrond, wat niet bevorderlijk was voor de interpretatie van de resultaten. Hoewel de nauwkeurigheid van de western blot- en immunofluorescentiemethoden kan worden verbeterd door het gebruik van gezuiverde antilichamen of nauwkeurige fluorescerende sondes te garanderen, zijn verdere studie en analyse van empirische gegevens vereist. Samenvattend wordt een uitgebreider en nauwkeuriger protocol gerapporteerd voor de detectie van Wolbachia-infectie in Aa23-cellen met behulp van vier methoden die werden gebruikt in eerdere studies van Wolbachia. Het hier beschreven protocol is van toepassing op de detectie van Wolbachia in andere soorten cellen en weefsels.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Acknowledgments

We bedanken Dr. Xin-Ru Wang van de Universiteit van Minnesota voor inzichtelijke suggesties en begeleiding. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (No.81760374).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Zeiss SteREO Discovery V8
Petri dish Fisher Scietific FB0875713
Pipette Pipetman F167380 P10
inSituX platform
Analysis software In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet MSE Supplies Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder In-house developed
Control software In-house developed
Immersion oil Cargille Laboratories 16482 Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform In-house developed
IR light source  Thorlabs Incorporated LED1085L LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring  In-house developed
Pump lasers  Thorlabs Incorporated LD785-SE400 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi Raspberry Pi Fundation
Retaining ring Thorlabs Incorporated SM1RR SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal University Wafers, Inc. U01-W2-L-190514 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim In-house developed
X-ray beam stop In-house developed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
  2. Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
  3. Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
  4. O'Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
  5. Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
  6. Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
  7. Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
  8. Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
  9. Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
  10. Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
  11. O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , Oxford University Press. (1997).
  12. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
  13. Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
  14. Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
  15. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  16. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
  17. Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).
  18. Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).
  19. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
  20. Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).
  21. Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
  22. Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
  23. Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).
  24. Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).
  25. Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
  26. Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
  27. Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
  28. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
  29. Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
  30. Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
  31. Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).

Tags

Immunologie en infectie nummer 184
Detectie van <em>Wolbachia</em> Stam wAlbB in <em>Aedes albopictus</em> cellijnen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng,… More

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng, J., Wu, J. Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines. J. Vis. Exp. (184), e63662, doi:10.3791/63662 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter