Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الكشف عن سلالة Wolbachia wAlbB في خطوط خلايا الزاعجة البيضاء

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63662
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1
1Guizhou Medical University, 2Guizhou Health Vocational College
* These authors contributed equally

Summary

تم استخدام أربع طرق للكشف عن Wolbachia داخل الخلايا ، والتي تكمل بعضها البعض وتحسن دقة الكشف عن عدوى Wolbachia من الزاعجة المشتقة من Aedes albopictus Aa23 و Aa23-T التي تم علاجها من عدوى Wolbachia الأصلية باستخدام المضادات الحيوية.

Abstract

باعتبارها تكافلا داخليا مؤمنا للأمهات ، تصيب Wolbachia نسبا كبيرة من مجموعات الحشرات. وقد أفادت الدراسات مؤخرا عن التنظيم الناجح لانتقال فيروس الحمض النووي الريبي باستخدام البعوض المنقول من ولبخيا. وتشمل الاستراتيجيات الرئيسية للسيطرة على الفيروسات التلاعب بتكاثر المضيف عن طريق عدم التوافق السيتوبلازمي وتثبيط النسخ الفيروسية عن طريق التحضير المناعي والتنافس على الموارد المشتقة من المضيف. ومع ذلك ، فإن الآليات الأساسية لاستجابات البعوض المنقول من Wolbachia للعدوى الفيروسية غير مفهومة بشكل جيد. تقدم هذه الورقة بروتوكولا للتعرف في المختبر على عدوى الولبخية على مستويات الحمض النووي والبروتين في خلايا الزاعجة البيضاء (Diptera: Culicidae) Aa23 لتعزيز فهم التفاعلات بين Wolbachia وناقلات الحشرات الخاصة بها. من خلال الاستخدام المشترك لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، و PCR الكمي ، واللطخة الغربية ، والطرق التحليلية المناعية ، تم وصف بروتوكول مورفولوجي قياسي للكشف عن الخلايا المصابة ب Wolbachia وهو أكثر دقة من استخدام طريقة واحدة. يمكن أيضا تطبيق هذا النهج للكشف عن عدوى Wolbachia في أنواع الحشرات الأخرى.

Introduction

بعوضة النمر الآسيوي Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae) ، وهي ناقل رئيسي لفيروس حمى الضنك (DENV) في آسيا وأجزاء أخرى من العالم1 ، هي مضيف طبيعي لنوعين من البكتيريا داخل الخلايا ، Wolbachia (w AlbA و wAlbB) ، والتي يتم توزيعها في جميع أنحاء الخط الجرثومي والأنسجة الجسدية 2,3. يتكون خط خلايا Aa23 المشتق من أجنة A. albopictus من نوعين على الأقل من الخلايا المورفولوجية ، وكلاهما يدعم العدوى4 ويمكن علاجه من عدوى Wolbachia الأصلية باستخدام المضادات الحيوية (Aa23-T). بالنظر إلى أن Aa23 يحتفظ فقط ب wAlbB ، فهو نموذج مفيد لدراسة التفاعلات بين المضيف والتكافلالداخلي 4,5,6.

ينتقل Wolbachia عن طريق الأم ويصيب ما يقدر بنحو 65٪ من أنواع الحشرات 8,9 و 28٪ من أنواع البعوض10. يصيب مجموعة متنوعة من الأنسجة ويشكل علاقة تكافلية حميمة مع المضيف ، وعادة ما يؤدي إلى عدم توافق السيتوبلازم (CI)11 واستبدال السكان عن طريق التلاعب بالجهاز التناسلي المضيف12,13. وقد لوحظت هذه الاستجابات المضيفة في المجموعات الطبيعية من ذبابة الفاكهة simulans14 وفي A. aegypti في قفص مختبري وتجربة ميدانية15. هناك تلاعب مهم غير إنجابي أثارته Wolbachia وهو مقاومة المضيف لمجموعة متنوعة من مسببات الأمراض ، بما في ذلك DENV وفيروس Chikungunya (CHIKV) وفيروس غرب النيل (WNV) 16,17 ، والتي يمكن أن يتوسط فيها نظام المناعة الفطري المحسن للتكافل18,19 ، والمنافسة بين Wolbachia والفيروسات على الموارد المضيفة الأساسية20 ، والتلاعب بمسارات الدفاع الفيروسي المضيف21 .

تم تطوير هذا البروتوكول لدراسة هذه الآليات الأساسية للاستجابات المضادة للفيروسات المضيفة التي يسببها Wolbachia. ويستخدم أربع طرق للكشف عن عدوى Wolbachia داخل الخلايا من خلايا Aa23. توفر هذه الطرق أساسا نظريا قويا لدراسات عدوى Wolbachia داخل الخلايا للأنواع المضيفة الأخرى. الطريقة الأولى ، PCR - وهي تقنية قوية تسمح بالتضخيم الأنزيمي لمناطق محددة من الحمض النووي دون استخدام إجراءات الاستنساخ التقليدية - تم استخدامها للكشف عن الحمض النووي Wolbachia وتحديد وجود / عدم وجود عدوى Wolbachia 22. تقيس الطريقة الثانية كثافة نسخ الحمض النووي Wolbachia باستخدام PCR الكمي (qPCR) للكشف والقياس الموثوق للمنتجات التي تم إنشاؤها خلال كل دورة PCR والتي تتناسب طرديا مع كمية القالب قبل PCR23. تكتشف الطريقة الثالثة وجود بروتينات Wolbachia داخل الخلايا ، باستخدام اللطخة الغربية - واحدة من أقوى الأدوات للكشف عن بروتينات محددة في مخاليط معقدة من خلال الجمع بين قوة الفصل العالية للرحلان الكهربائي ، وخصوصية الأجسام المضادة ، وحساسية التفاعلات الأنزيمية اللونية. الطريقة النهائية هي اختبار التألق المناعي (IFA) الذي يجمع بين علم المناعة والكيمياء الحيوية والفحص المجهري للكشف عن بروتين سطح Wolbachia (wsp) من خلال تفاعل الأجسام المضادة المستضدية لتأكيد الامتصاص الخلوي ل Wolbachia وتحديد توطينه الخلوي.

تصف هذه الورقة الطرق الأربع المذكورة أعلاه للتحقق من وجود Wolbachia في الخلايا ، والتي يمكن استخدامها للكشف عما إذا كان Wolbachia الخارجي قد تم نقله بنجاح وتم مسح Wolbachia في الخلية. بعد تحديد ما إذا كانت Wolbachia موجودة في الخلايا أم لا ، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من التحليلات المختلفة ، بما في ذلك علم الجينوم أو البروتيوميات أو الأيض. يوضح هذا البروتوكول اكتشاف Wolbachia من خلال خلايا Aa23 ولكن يمكن استخدامه أيضا في خلايا أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. المواد والكواشف

  1. استخدم الحلول والوسائط الخالية من البيروجين لزراعة الخلايا (انظر جدول المواد).
  2. استخدم المياه فائقة النقاء لإعداد جميع الحلول.
  3. كن حذرا في اختيار مصل الأبقار الجنينية (FBS) لزراعة الخلايا ، بعد عملية فحص الكثير.
    ملاحظة: نظرا لأن عقود FBS تخضع للتغيير المنتظم، فمن المستحيل ذكر الكتالوج ذي الصلة وأرقام اللوت في هذا البروتوكول.
  4. حدد سلالات الخلايا Aa23 المشتقة من بيض A. albopictus ، المقابلة ل Aa23-T الخالية من Wolbachia.

2. زراعة الخلايا

  1. قم بإعداد قوارير زراعة الخلايا25 سم 2 مع 4 مل من وسط شنايدر مع 10٪ FBS.
  2. احتضن القوارير عند 28 درجة مئوية تحت جو 5٪ CO2 لمدة 5 إلى 7 أيام 7,24.
  3. راقب خلايا Aa23 و Aa23-T غير الملطخة في القوارير باستخدام المجهر الضوئي عند تكبير 100x (الشكل 1).

3. استخراج الحمض النووي

  1. قم بزراعة الخلايا لمدة 5-7 أيام حتى التقاء 70-80٪ لكل قارورة (الخطوة 2). حصاد الخلايا مع السحب اليدوي من 1 مل من وسط الثقافة المعاد تعليقها عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 100 × غرام في جهاز طرد مركزي صغير.
  2. قم بإزالة السوبرناتانت عن طريق الشفط وتخزين حبيبات الخلايا الناتجة عند -20 درجة مئوية.
  3. أعد تعليق الكريات في 0.40 مل من المياه المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) ، وضع 50 ميكرولتر من المحلول في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق ، وإضافة 5 ميكرولتر من بروتين K (20 ملغ / مل) ، وحضانت عند 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. وأخيرا، سخني هذه الأنابيب عند 99 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للحصول على الحمض النووي الخام وتخزينه عند -20 درجة مئوية.

4. الكشف عن حمض الولبخية النووي

  1. تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل
    1. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في حجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر ، يحتوي على 8 ميكرولتر من ddH2O ، 10 ميكرولتر من بوليميراز Taq (انظر جدول المواد) ، 1 ميكرولتر من قالب الحمض النووي (من الخطوة 3) ، 0.5 ميكرولتر من الاشعال الأمامي والعكسي (10 ميكرومتر): wsp81 F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') و wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25 ، على التوالي.
    2. استخدم شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية: تمسخ أولي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، يليه 35 دورة من تمسخ البشرة عند 94 درجة مئوية، والتلدين عند 55 درجة مئوية، والتمديد عند 72 درجة مئوية؛ ثم ، تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    3. اكتشف الحمض النووي على هلام الأغاروز بنسبة 1٪ (1٪ w/v agarose في PBS) باستخدام جهاز تصوير هلام.
  2. تحليل qPCR
    1. قم بتحليل نسخة جينوم Wolbachia لثلاثة نسخ بيولوجية (n = 6) من الحمض النووي المستخرج (الخطوة 3) باستخدام التمهيدي wsp 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') و QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22 ، تطبيع مع البروتين الريبوسومي S6 (RPS6) الاشعال الأمامي والعكسي (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' و 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3' ، على التوالي)3.
    2. قم بإنشاء منحنى قياسي ل wAlbB و RPS6.
      1. استخراج الحمض النووي من PMD-18T (ناقل خاص للاستنساخ الفعال لمنتجات PCR (استنساخ TA)) البلازميد المؤتلف الذي يحتوي على شظايا جينية wsp و rps6 (ملف تكميلي) وقياس تركيز الحمض النووي البلازميد (انظر جدول المواد).
      2. تحويل تركيز الحمض النووي البلازميدي إلى نسخ تركيز الأرقام باستخدام Eq (1).
        رقم نسخة البلازميد = Equation 1 (1)
      3. قم بتخفيف رقم نسخة البلازميد من 101 إلى 108 بالماء فائق النقاء ، واضبط 3 نسخ متماثلة لكل تدرج تركيز.
      4. قم بإجراء تضخيم qPCR باستخدام TB Green ونظام PCR في الوقت الفعلي (انظر جدول المواد) ، وسجل نتائج كل تفاعل. استخدم قيمة Ct لتطوير منحنى قياسي. تحليل الحمض النووي في حجم تفاعل إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر، يتألف من 7 ميكرولتر من DDH2O، و 10.4 ميكرولتر من السل الأخضر (انظر جدول المواد)، و 1 ميكرولتر من قالب الحمض النووي (مقدم من الخطوة 3)، و 0.8 ميكرولتر من التمهيديات الأمامية والخلفية (10 ميكرومتر). استخدم شروط التفاعل التالية: تمسخ أولي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، يليه 40 دورة من تمسخ البشرة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، والتلدين عند 60 درجة مئوية لمدة 35 ثانية.
      5. احسب أرقام نسخ جين WSP و RPS6 في الخلايا وفقا للمنحنى القياسي المحدد والكثافة النسبية ل Wolbachia بواسطة عدد نسخ wsp / RPS6. تحليل البيانات باستخدام اختبار t عينات مستقل.
  3. تحليل اللطخة الغربية لبروتين الولبخية
    1. استخراج البروتين
      1. اجمع 2 × 107 Aa23 و Aa23-T من الصفيحة المكونة من ستة آبار (من الخطوة 2) في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق ، واغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS ، وقم بطردها مركزيا عند 100 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      2. تحضير 1 مل من التحلل مع المخزن المؤقت لتحلل RIPA (50 mM Tris (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، 150 mM NaCl ، 1٪ Triton X-100 ، 1٪ deoxycholate الصوديوم ، 0.1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم [SDS] ، 2 mM بيروفوسفات الصوديوم ، 25 mM β-glycerophosphate ، 1 mM EDTA ، 1 mM Na3VO4 ، 0.5 ميكروغرام / مل leupeptin) و PMSF (التركيز النهائي 1 mM).
      3. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى حبيبات الخلية واحتفظ بها لمدة 30 دقيقة على الجليد. قم بطرد الليزات مركزيا عند 12000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الفائقة.
    2. فحص تركيز wsp للسوبرناتانت باستخدام مجموعة فحص بروتين حمض البيتشينكونينيك (BCA) (انظر جدول المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    3. قم بتحميل كميات متساوية من البروتين على هلام SDS-PAGE بنسبة 15٪ [10٪ ماء مقطر ؛ 50٪ (30٪ Acr-Bis (29: 1) ، 38٪ 1 M Tris ، درجة الحموضة 8.8 ؛ 1٪ (10٪ SDS) ، 1٪ (10٪ بيرسلفات الأمونيوم) ، 0.04٪ TEMED].
    4. انقل البروتين إلى أغشية النيتروسليلوز ، وقم بسد الأغشية بحليب منزوع الدسم بنسبة 5٪ لمدة2 ساعة 26,27 في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام TBST (1 مل من Tween 20 في 1 لتر من TBS) (انظر جدول المواد).
    5. احتضن الأغشية بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة ل wsp (المحضرة في المنزل ، انظر الملف التكميلي)) ، التي يتم إعدادها عن طريق تخفيف الجسم المضاد الأساسي بنسبة 5٪ من الحليب الخالي من الدسم (1: 12000).
    6. اغسل الجسم المضاد الأساسي ثلاث مرات باستخدام TBST.
    7. احتضان الأغشية في 100 ميكرولتر من بيروكسيديز الفجل (HRP) - الجسم المضاد الثانوي المترافق على شاكر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    8. اغسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام TBST ، وامزج 20 ميكرولتر من المحلول A (كاشف الركيزة Luminol HRP) و 20 ميكرولتر من المحلول B (كاشف بيروكسيد الركيزة HRP) في مجموعة الكشف عن التلألؤ الكيميائي بنسبة 1: 1. اغمر الغشاء بأكمله في محلول التلألؤ في نفس الوقت ، وراقب الإشارات باستخدام نظام تصوير متعدد الوظائف.
  4. توطين التألق المناعي لبروتين Wolbachia
    1. احتضان 5 × 105 Aa23 و Aa23-T الخلايا عند 28 درجة مئوية على طبق بتري متحد البؤرة بالليزر بسماكة 0.17 مم في الأسفل ، تحت جو 5٪ CO2 لمدة 3 إلى 4 أيام 7,24. انتظر حتى تلتقي الخلية بنسبة 60٪ -70٪ واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS.
    2. إصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية في 1 مل من 4٪ (ث / v) بارافورمالديهايد في PBS.
    3. اغسل الخلايا الثابتة باستخدام PBST (0.2٪ v / v Triton X-100 في PBS) لمدة 5 دقائق واغسل الخلايا مرة أخرى مرتين باستخدام PBS.
    4. احتضن الشرائح لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في 1 مل من 3٪ (ث / v) ألبومين مصل البقر في PBS.
    5. احتضن الشرائح بين عشية وضحاها في 100 ميكرولتر من الجسم المضاد متعدد النسيلة المضاد للفأر (المحضر داخليا) ومصل الماوس (تخفيف 1: 1000 في PBS) في صندوق رطب (يمكنه الحفاظ على الرطوبة ومنع الرطوبة من التبخر) عند 4 درجات مئوية.
    6. قم بإزالة الشرائح من الصندوق الرطب وأعدها إلى درجة حرارة الغرفة ؛ غسلها ثلاث مرات مع PBS وإزالة PBS.
      ملاحظة: من الخطوة 4.4.7 فصاعدا، يجب حماية جميع العمليات من الضوء.
    7. احتضن الشرائح ب 100 ميكرولتر من الجسم المضاد للماعز المقترن بالكسا فلور 488 (تخفيف 1:2000 في PBS) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    8. احتضن شرائح العينة ب 50 ميكرولتر من 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI مخفف في PBS إلى 10 ميكروغرام / مل ، يرتبط بقوة بالحمض النووي) عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم غسلها ثلاث مرات باستخدام PBS.
    9. راقب التلطيخ المناعي تحت المجهر البؤري.
      1. قم بتشغيل الطاقة والليزر.
      2. قم بتشغيل المصابيح العادية والزئبقية للمجهر.
      3. بدء تشغيل النظام وتشغيل برنامج التشغيل. ضع قطرة من زيت الأرز على شرائح العينة ، وضع شرائح العينة على مرحلة المجهر ، وانقل المرحلة إلى الموضع المناسب.
      4. انقر فوق زر مراقبة مصباح الزئبق في البرنامج البرمجي، وافتح مصراع مصباح الزئبق ، وراقب العينة تحت مجهر مقلوب للتركيز.
      5. استخدم لوحة التحكم اليدوية لتحديد التألق الأخضر والأزرق لالتقاط صور التألق تحت تكبير 100x.
      6. أطفئ زر مراقبة مصباح الزئبق وابدأ في الحصول على الصور.
      7. لضمان جودة صورة جيدة، قم بالمسح الضوئي حسب حجم المسح الضوئي (512 بكسل × 512 بكسل). اضبط حجم المسح الضوئي للحصول على صور واضحة (1,024 بكسل × 1,024 بكسل).
      8. قم بتقليل الضوضاء إذا كانت ضوضاء الخلفية مرتفعة جدا.
      9. توقف عن المسح الضوئي واحفظ الصور.
      10. أطفئ مصباح الزئبق والليزر.
      11. امسح الهدف بالكحول بنسبة 75٪ واخفض الهدف إلى أدنى موضع.
      12. قم بإيقاف تشغيل الغالق وطاقة المجهر.
      13. بعد أن تبرد الأداة ، قم بتغطيتها بغطاء الغبار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قبل اكتشاف Wolbachia ، تمت ملاحظة خلايا Aa23 و Aa23-T تحت المجهر الضوئي لتحديد أي اختلافات مورفولوجية بين خطي الخلية. تحتوي خلايا Aa23 و Aa23-T على مورفولوجيا خليتين على الأقل ولكن لا يوجد فرق مورفولوجي واضح بين نوعي الخلايا (الشكل 1). هنا ، تم استخدام خلايا Aa23 كنظام نموذجي للكشف عن عدوى Wolbachia باستخدام أربع طرق. كان التضخيم الإيجابي لجين Wolbachiawsp باستخدام الاشعال التشخيصية 81F/691R ممكنا في خلايا Aa23 (الممرات 1 و 2) ولكن ليس في خلايا Aa23-T (الممرات 3 و 4) (الشكل 2A). أظهر تحليل كثافة Wolbachia في خطوط الخلايا باستخدام qPCR نسبة wsp / rps6 من 2.4 في خلايا Aa23 ولكن لا Wolbachia في خلايا Aa23-T (الشكل 2B). أظهر تحليل اللطخة الغربية لمستخلصات البروتين إشارة wsp قوية ل Aa23 ولا إشارة ل Aa23-T (الشكل 3A) ، في حين كشف فحص التألق المناعي غير المباشر عن بروتين wsp (الشكل 3B) في خلايا Aa23 (الأخضر) ، في حين تم اكتشاف الحمض النووي فقط الملطخ ب DAPI (الأزرق) في خلايا Aa23-T.

Figure 1
الشكل 1: الفحص المجهري الضوئي لخلايا Aa23 و Aa23-T غير الملطخة. يشير التشكل غير المتجانس إلى وجود أكثر من نوع خلية واحد في كلا الخطين الخلويين ، كما هو موضح في الأسهم. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الكشف عن عدوى الولبخية في الخلايا على مستوى الحمض النووي. (أ) تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل للخلايا Aa23 و Aa23-T التي تم حلها على هلام الأغاروز بنسبة 1٪. تضخيم PCR الإيجابي لجين Wolbachiawsp باستخدام الاشعال التشخيصية ، 81F / 691R ، لوحظ في خلايا Aa23 (الممرات 1 و 2) ولكن ليس في خلايا Aa23-T (الممرات 3 و 4). (ب) كثافة نسخ Wolbachia wsp للخلايا Aa23 و Aa23-T. كانت الكثافة أكبر في خلايا Aa23 ولا يمكن اكتشافها في خلايا Aa23-T. تم تطبيع رقم النسخة باستخدام Aedes albopictus rps6 ؛ البيانات هي متوسط ± SEM ، n = 6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الكشف عن عدوى Wolbachia في الخلايا على مستوى البروتين. (أ) النشاف المناعي مع الأجسام المضادة wsp في خلايا Aa23 (Lane 1) ، مع شريط واضح بالقرب من 25 kDa ؛ Aa23-T (Lane 2) ، الذي عولج بالتتراسيكلين. (ب) وسم التألق المناعي للخلايا التي تبين توطين الولبخية (باللون الأخضر)؛ تم فحص الخلايا باستخدام الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة ل wsp (Wolbachia) ، تليها الماعز المضاد للفأر (الأخضر) Alexa Fluor 488 المقترن بالأجسام المضادة ، والنوى (الزرقاء) ملطخة ب DAPI. تم استخدام مصل الفأر كعنصر تحكم سلبي لأن الجسم المضاد المضاد ل wsp لم يتم تنقيته ، وكان الجسم المضاد متعدد النسيلة مشتقا من الفئران. يشار إلى خلايا Aa23 (Aa23-anti-wsp) المصابة ب Wolbachia بسهم أبيض. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. اختصار: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; M = علامة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف تكميلي: توليد البلازميد وإعداد الأجسام المضادة المضادة wsp. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد الكشف عن عدوى Wolbachia داخل الخلايا أمرا ضروريا لدراسة التفاعلات بين Wolbachia ومضيف وتأكيد النقل الناجح للخلايا ذات السلالات الجديدة. في هذا البروتوكول ، تم استخدام أربع طرق للكشف بنجاح عن عدوى Wolbachia داخل الخلايا على مستويات الحمض النووي والبروتين. هذه الطرق التجريبية الأربع أكدت وحسنت دقة الكشف عن عدوى Wolbachia للخلايا.

تم استخدام PCR للكشف عن وجود عدوى Wolbachia للخلايا على مستوى الحمض النووي. ومع ذلك ، نظرا لأنه لا يحدد مستويات العدوى 28,29 ، فقد تم استخدام qPCR لقياس كثافة نسخ الحمض النووي 28,30. نظرا لأن دقة طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل قد تتأثر بانخفاض كفاءة التضخيم والإيجابيات الخاطئة ، فمن المهم ضمان جودة الحمض النووي ، خاصة للكشف عن qPCR ، حيث يجب وضع الكواشف والقوالب على الجليد لمنع تمسخ ، ويجب أن تتم العمليات وفقا للطرق القياسية. تميل كفاءة التضخيم المنخفضة إلى أن تكون ناجمة عن تدهور الكاشف في نظام التفاعل ، وعدم كفاية كميات القوالب ، و / أو الطول المفرط لشظايا التمهيدي الممتدة28. عادة ما تحدث الإيجابيات الكاذبة بسبب تلوث الكواشف والقوالب ، ومستويات عالية من تركيز التمهيدي ، و / أو هياكل التمهيدي dimer و hairpin. لذلك ، من المهم التأكد من أن الكواشف ذات جودة عالية ، ويتم تحسين الاشعال بناء على الأدبيات ، والبرامج المناسبة المستخدمة في تصميم التمهيدي.

طريقتان موصوفتان أعلاه للكشف عن عدوى Wolbachia داخل الخلايا على مستوى الحمض النووي. الاثنان الآخران يكتشفان عدوى Wolbachia داخل الخلايا على مستوى البروتين. تم استخدام النشاف الغربي لتحديد عدوى الولبخية داخل الخلايا من خلايا Aa23 و Aa23-T على مستوى البروتين. ترتبط المشاكل المرتبطة بهذه الطريقة بإعداد العينات وحضانة الأجسام المضادة والكشف عنها31. تشمل الخطوات الحاسمة في عملية الكشف عن النشاف الغربي استخدام عينات جديدة ومحللة بالكامل والأجسام المضادة الثانوية الصحيحة ، والتي يجب التحقق من صحتها وتخفيفها وفقا للتعليمات عند تخفيف 1: 12000. وفقا للمتطلبات التجريبية ، يمكن أيضا دمج هذه الطريقة مع طرق التحصين الأخرى. لذلك ، تم استخدام التألق المناعي لتوطين العدوى داخل الخلايا بواسطة Wolbachia31 ، لأنه لا يتم الكشف عن ذلك مباشرة باستخدام PCR أو qPCR أو تحليلات اللطخة الغربية. هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب ملاحظتها حول التألق المناعي. أولا ، تأكد من الجودة المثلى لعينات الخلايا وتجنب التلوث. إن تلوث الخلايا بحشرة الغراء الأسود ، والتي يمكن أن تكون ملطخة أيضا ، سيؤثر بشكل خطير على تفسير النتائج. ثانيا ، يجب أن تكون كثافة الخلايا في الأطباق البؤرية بالليزر ~ 60-70٪. أخيرا ، يعد الغسيل باستخدام PBS بعد حضانة العينة أمرا بالغ الأهمية للحصول على صور فلورية واضحة.

باستخدام الطرق الكمية والبصرية النسبية والمطلقة للكشف عن عدوى Wolbachia داخل الخلايا على مستويات الحمض النووي والبروتين ، يعد هذا البروتوكول أكثر شمولا ودقة من استخدام أي طريقة واحدة. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي بناء منحنى مزدوج المعايير (ل wsp و RPS6) إلى متطلبات أقل صرامة لنظام PCR وكفاءة التضخيم والقضاء الجزئي على الخطأ التجريبي في معالجة البيانات النهائية ، مما يقلل بشكل كبير من العمل التجريبي. ومع ذلك، كانت هناك بعض القيود على هذا البروتوكول. أولا ، يتم إعداد الجسم المضاد المضاد ل wsp داخليا ولم يتم تسويقه بعد. ثانيا ، على الرغم من عدم وجود نطاقات إضافية بسبب الجسم المضاد المضاد متعدد النسيلة غير النقي في النشاف الغربي ، مما يشير إلى نقاء الأجسام المضادة ، فإن المجموعة الضابطة السلبية التي تستخدم مصل الفئران كان لها أيضا خلفية فلورية خضراء ، والتي لم تكن مواتية لتفسير النتائج. في حين يمكن تحسين دقة طرق اللطخة الغربية والتألق المناعي من خلال ضمان استخدام الأجسام المضادة النقية أو مجسات الفلورسنت الدقيقة ، إلا أن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسة والتحليل للبيانات التجريبية. باختصار ، تم الإبلاغ عن بروتوكول أكثر شمولا ودقة للكشف عن عدوى Wolbachia في خلايا Aa23 باستخدام أربع طرق مستخدمة في الدراسات السابقة ل Wolbachia. البروتوكول الموصوف هنا ينطبق على الكشف عن Wolbachia في أنواع أخرى من الخلايا والأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgments

نشكر الدكتور شين رو وانغ من جامعة مينيسوتا على اقتراحاته وتوجيهاته الثاقبة. تم دعم هذا العمل بمنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81760374).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Zeiss SteREO Discovery V8
Petri dish Fisher Scietific FB0875713
Pipette Pipetman F167380 P10
inSituX platform
Analysis software In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet MSE Supplies Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder In-house developed
Control software In-house developed
Immersion oil Cargille Laboratories 16482 Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform In-house developed
IR light source  Thorlabs Incorporated LED1085L LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring  In-house developed
Pump lasers  Thorlabs Incorporated LD785-SE400 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi Raspberry Pi Fundation
Retaining ring Thorlabs Incorporated SM1RR SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal University Wafers, Inc. U01-W2-L-190514 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim In-house developed
X-ray beam stop In-house developed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
  2. Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
  3. Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
  4. O'Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
  5. Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
  6. Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
  7. Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
  8. Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
  9. Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
  10. Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
  11. O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , Oxford University Press. (1997).
  12. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
  13. Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
  14. Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
  15. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  16. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
  17. Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).
  18. Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).
  19. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
  20. Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).
  21. Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
  22. Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
  23. Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).
  24. Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).
  25. Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
  26. Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
  27. Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
  28. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
  29. Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
  30. Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
  31. Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 184 ،
الكشف عن سلالة <em>Wolbachia</em> wAlbB في خطوط خلايا <em>الزاعجة البيضاء</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng,… More

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng, J., Wu, J. Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines. J. Vis. Exp. (184), e63662, doi:10.3791/63662 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter