Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Detektera Wolbachia Strain wAlbB i Aedes albopictus cellinjer

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63662
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1
1Guizhou Medical University, 2Guizhou Health Vocational College
* These authors contributed equally

Summary

Fyra metoder användes för att detektera intracellulär Wolbachia, som kompletterade varandra och förbättrade detektionsnoggrannheten för Wolbachia-infektion av Aedes albopictus-härledd Aa23 och Aa23-T botad av infödd Wolbachia-infektion med antibiotika.

Abstract

Som en moderligt hyst endosymbiont infekterar Wolbachia stora andelar av insektspopulationer. Studier har nyligen rapporterat den framgångsrika regleringen av RNA-virusöverföring med Wolbachia-transinfekterade myggor. Viktiga strategier för att kontrollera virus inkluderar manipulation av värdreproduktion via cytoplasmatisk inkompatibilitet och hämning av virala transkript via immunpriming och konkurrens om värd-härledda resurser. De underliggande mekanismerna för Svaren från Wolbachia-transfekterade myggor på virusinfektion är dock dåligt förstådda. Denna uppsats presenterar ett protokoll för in vitro-identifiering av Wolbachia-infektion vid nukleinsyra- och proteinnivåerna i Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-celler för att förbättra förståelsen av interaktionerna mellan Wolbachia och dess insektsvektorer. Genom kombinerad användning av polymeraskedjereaktion (PCR), kvantitativa PCR-, western blot- och immunologiska analysmetoder har ett standardmorfologiskt protokoll beskrivits för detektion av Wolbachia-infekterade celler som är mer exakt än användningen av en enda metod. Detta tillvägagångssätt kan också tillämpas på detektion av Wolbachia-infektion i andra insektstaxa.

Introduction

Den asiatiska tigermyggan Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), som är en nyckelvektor för denguevirus (DENV) i Asien och andra delar av världen1, är en naturlig värd för två typer av de intracellulära bakterierna, Wolbachia (wAlbA och wAlbB), som fördelas över bakterielinjen och somatisk vävnad 2,3. Aa23-cellinjen som härrör från A. albopictus-embryon består av minst två morfologiska celltyper, som båda stöder infektion4 och kan botas av infödd Wolbachia-infektion med antibiotika (Aa23-T). Med tanke på att Aa23 endast behåller wAlbB är det en användbar modell för studier av värd-endosymbiontinteraktioner 4,5,6.

Wolbachia överförs maternellt och infekterar uppskattningsvis 65% avinsektsarterna 8,9 och 28% avmyggarterna 10. Det infekterar en mängd olika vävnader och bildar ett intimt symbiotiskt förhållande med värden, vilket vanligtvis inducerar cytoplasmatisk inkompatibilitet (CI)11 och befolkningsersättning genom att manipulera värdens reproduktionssystem12,13. Dessa värdsvar har observerats i naturliga populationer av Drosophila simulans14 och i A. aegypti i en laboratoriebur och fältförsök15. En viktig icke-produktiv manipulation som framkallas av Wolbachia induceras värdresistens mot en mängd olika patogener, inklusive DENV, Chikungunya-virus (CHIKV) och West Nile-virus (WNV)16,17, som kan förmedlas av ett förbättrat medfött immunsystem av symbionten18,19, konkurrens mellan Wolbachia och virus för viktiga värdresurser20 och manipulation av värdvirala försvarsvägar21 .

Detta protokoll har utvecklats för att studera dessa underliggande mekanismer för Wolbachia-inducerade värd antivirala svar. Den använder fyra metoder för detektion av intracellulär Wolbachia-infektion av Aa23-celler. Dessa metoder ger en stark teoretisk grund för studier av intracellulär Wolbachiainfektion hos andra värdarter. Den första metoden, PCR - en kraftfull teknik som möjliggör enzymatisk förstärkning av specifika dna-regioner utan att använda konventionella kloningsförfaranden - användes för att detektera Wolbachia-DNA och bestämma närvaron / frånvaron av Wolbachia-infektion 22. Den andra metoden mäter Wolbachia DNA-kopieringstäthet med hjälp av kvantitativ PCR (qPCR) för tillförlitlig detektion och mätning av produkter som genereras under varje PCR-cykel som står i direkt proportion till mängden mall före PCR23. Den tredje metoden detekterar närvaron av intracellulära Wolbachia-proteiner , med användning av western blot-ett av de mest kraftfulla verktygen för att detektera specifika proteiner i komplexa blandningar genom att kombinera elektrofores höga separationskraft, antikropparnas specificitet och känsligheten hos kromogena enzymatiska reaktioner. Den slutliga metoden är en immunofluorescensanalys (IFA) som kombinerar immunologi, biokemi och mikroskopi för att detektera Wolbachia-ytproteinet (wsp) genom en antigen-antikroppsreaktion för att bekräfta det cellulära upptaget av Wolbachia och bestämma dess cellulära lokalisering.

Detta dokument beskriver de fyra metoderna som anges ovan för att verifiera förekomsten av Wolbachia i cellerna, som kan användas för att upptäcka om den exogena Wolbachia framgångsrikt transfekterades och Wolbachia i cellen rensades. Efter att ha bestämt om Wolbachia finns i cellerna eller inte kan en mängd olika analyser utföras, inklusive genomik, proteomik eller metabolomik. Detta protokoll visar detektion av Wolbachia genom Aa23-celler men kan också användas i andra celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Material och reagenser

  1. Använd pyrogenfria lösningar och media för cellodling (se materialförteckningen).
  2. Använd ultrarent vatten för att förbereda alla lösningar.
  3. Var försiktig när du väljer fetalt bovint serum (FBS) för cellodling, efter en lot-check-process.
    OBS: Eftersom FBS-partier kan ändras regelbundet är det omöjligt att ange relevant katalog och partinummer i detta protokoll.
  4. Välj Aa23-cellstammar härledda från A. albopictus-ägg , motsvarande Wolbachia-fria Aa23-T.

2. Cellodling

  1. Förbered 25 cm 2-cellsodlingskolvar med 4 ml Schneiders medium med 10% FBS.
  2. Inkubera kolvarna vid 28 °C under en 5 %CO2-atmosfär i 5 till 7 dagar 7,24.
  3. Observera oskyddade Aa23- och Aa23-T-celler i kolvarna med hjälp av ljusmikroskopi vid 100x förstoring (figur 1).

3. DNA-extraktion

  1. Odla cellerna i 5-7 dagar tills 70-80% sammanflöde per kolv (steg 2). Skörda cellerna med manuell pipettering från 1 ml återsuspenderat odlingsmedium genom centrifugering i 5 min vid 100 × g i en mikrocentrifug.
  2. Avlägsna supernatanten genom aspiration och förvara den resulterande cellpelleten vid -20 °C.
  3. Resuspendera pelletarna i 0,40 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS), placera 50 μL av lösningen i ett mikrocentrifugrör, tillsätt 5 μl proteinas K (20 mg/ml) och inkubera vid 55 °C i 1 timme. Slutligen, värm dessa rör vid 99 ° C i 15 minuter för att erhålla det råa DNA och lagra det vid -20 ° C.

4. Detektion av Wolbachia nukleinsyra

  1. PCR-analys
    1. Utför PCR i en total reaktionsvolym på 20 μL, innehållande 8 μLddH2O, 10 μL Taq-polymeras (se materialförteckningen), 1 μL DNA-mall (från steg 3), 0,5 μL främre och omvända primers (10 μM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') och wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, respektive.
    2. Använd följande PCR-villkor: initial denaturering vid 95 °C i 5 minuter, följt av 35 cykler av denaturering vid 94 °C, glödgning vid 55 °C och förlängning vid 72 °C; därefter en slutlig förlängning vid 72 °C i 7 min.
    3. Detektera DNA på en 1% agarosgel (1% w / v agaros i PBS) med hjälp av en gelbildare.
  2. qPCR-analys
    1. Analysera Wolbachia-genomkopian för tre biologiska replikat (n = 6) från det extraherade DNA:t (steg 3) med hjälp av wsp-primers 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') och QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, normaliserat med ribosomalt protein S6 (RPS6) framåt och bakåt primers (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' respektive 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3')3.
    2. Generera en standardkurva för wAlbB och RPS6.
      1. Extrahera DNA från PMD-18T (en speciell vektor för effektiv kloning av PCR-produkter (TA-kloning)) rekombinant plasmid innehållande wsp - och rps6-genfragment (Tilläggsfil) och mät plasmid-DNA-koncentrationen (se materialförteckningen).
      2. Konvertera plasmid-DNA-koncentrationen till kopieringsnummerkoncentration med Eq (1).
        Plasmidkopienummer = Equation 1 (1)
      3. Späd plasmidkopienumret från 101 till 108 med ultrarent vatten och ställ in 3 replikat för varje koncentrationsgradient.
      4. Utför qPCR-förstärkning med TB Green och ett PCR-system i realtid (se materialtabellen) och registrera resultaten av varje reaktion. Använd Ct-värdet för att utveckla en standardkurva. Analysera DNA i en total reaktionsvolym på 20 μL, innefattande 7 μL ddH2O, 10,4 μL TB Green (se materialförteckningen), 1 μL DNA-mall (tillhandahållen av steg 3) och 0,8 μL framåt och bakåt primers (10 μM). Använd följande reaktionsförhållanden: initial denaturering vid 95 °C i 5 min, följt av 40 cykler av denaturering vid 95 °C i 10 s och glödgning vid 60 °C i 35 s.
      5. Beräkna antalet WSP - och RPS6-genkopior i cellerna enligt den fastställda standardkurvan och Wolbachias relativa densitet med kopienumret för wsp/RPS6. Analysera data med hjälp av ett oberoende t-test.
  3. Western blot analys av Wolbachia protein
    1. Protein extraktion
      1. Samla upp 2 × 107 Aa23- och Aa23-T-cellerna från sexbrunnsplattan (från steg 2) i ett mikrocentrifugrör, tvätta dem tre gånger med PBS och centrifugera dem vid 100 × g i 5 minuter vid 4 °C.
      2. Förbered 1 ml lysater med RIPA-lysbuffert (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoxikolat, 0,1% natriumdodecylsulfat [SDS], 2 mM natriumpyrofosfat, 25 mM β-glycerofosfat, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 0,5 μg / ml leupeptin) och PMSF (slutkoncentration 1 mM).
      3. Tillsätt 200 μl lysbuffert till cellpelleten och behåll i 30 min på is. Centrifugera lysatterna vid 12 000 × g i 10 min vid 4 °C och avlägsna supernatanten.
    2. Analysera wsp-koncentrationen av supernatanten med hjälp av ett bicinchoninsyra (BCA) proteinanalyskit (se materialtabellen) enligt tillverkarens instruktioner.
    3. Ladda lika stora mängder protein på en 15% SDS-PAGE gel [10% destillerat vatten; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% ammoniumpersulfat), 0,04% TEMED].
    4. Överför proteinet till nitrocellulosamembran, blockera membranen med 5% skummjölk i 2 timmar26,27 vid rumstemperatur och tvätta sedan membranen tre gånger med TBST (1 ml Tween 20 i 1 liter TBS) (se materialtabellen).
    5. Inkubera membranen över natten vid 4 °C med 100 μL anti-wsp polyklonal antikropp (beredd internt, se tilläggsfil)), beredd genom utspädning av den primära antikroppen med 5 % skummjölk (1:12 000).
    6. Tvätta den primära antikroppen tre gånger med TBST.
    7. Inkubera membranen i 100 μL pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad sekundär antikropp på en shaker i 1 timme vid rumstemperatur.
    8. Tvätta membranen tre gånger med TBST och blanda 20 μl lösning A (HRP Substrate Luminol Reagent) och 20 μL lösning B (HRP Substrate Peroxide Reagent) i kemiluminescensdetekteringssatsen i förhållandet 1:1. Fördjupa hela membranet i luminiscenslösningen samtidigt och observera signalerna med hjälp av ett multifunktionellt bildsystem.
  4. Immunofluorescenslokalisering av Wolbachia-protein
    1. Inkubera 5 × 105 Aa23- och Aa23-T-celler vid 28 °C på en laserkonfokal petriskål med en tjocklek av 0,17 mm i botten, under en 5% CO2-atmosfär i 3 till 4 dagar 7,24. Vänta tills cellen är 60% -70% sammanflöde och tvätta cellerna tre gånger med PBS.
    2. Fixera cellerna i 20 minuter vid 4 °C i 1 ml 4 % paraformaldehyd (w/v) i PBS.
    3. Tvätta de fasta cellerna med PBST (0,2% v / v Triton X-100 i PBS) i 5 minuter och tvätta cellerna igen två gånger med PBS.
    4. Inkubera objektsglasen i 1 timme vid 37 °C i 1 ml bovint serumalbumin (w/v) i PBS.
    5. Inkubera objektsglasen över natten i 100 μL av mus anti-wsp polyklonal antikropp (beredd internt) och musserum (1:1 000 utspädning i PBS) i en våt låda (det kan bibehålla fuktigheten och förhindra att fukt avdunstar) vid 4 °C.
    6. Ta bort bilderna från den våta lådan och sätt tillbaka dem till rumstemperatur; tvätta dem tre gånger med PBS och ta bort PBS.
      OBS: Från steg 4.4.7 och framåt måste alla operationer skyddas från ljus.
    7. Inkubera objektsglasen med 100 μL av en Alexa Fluor 488-konjugerad get-antimusantikropp (1:2 000 utspädning i PBS) vid 37 °C i 30 minuter.
    8. Inkubera provglasen med 50 μl 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI utspädd i PBS till 10 μg/ml, binder starkt till DNA) vid 37 °C i 5 minuter och tvätta dem sedan tre gånger med PBS.
    9. Observera immunfärgningen under ett konfokalmikroskop.
      1. Slå på strömmen och lasern.
      2. Slå på mikroskopets normala och kvicksilverlampor.
      3. Starta systemet och kör driftsprogramvaran. Lägg en droppe cederolja på provglasen, placera provglasen på mikroskopsteget och flytta scenen till lämplig position.
      4. Klicka på kvicksilverlampans observationsknapp i programvaran, öppna kvicksilverlampans slutare och observera provet under ett inverterat mikroskop för att fokusera.
      5. Använd den manuella kontrollpanelen för att välja grön och blå fluorescens för att ta fluorescensfoton under 100x förstoring.
      6. Stäng av kvicksilverlampans observationsknapp och börja skaffa bilder.
      7. För att säkerställa god bildkvalitet, skanna efter skanningsstorlek (512 pixlar x 512 pixlar). Justera skanningsstorleken för att få tydliga bilder (1 024 pixlar x 1 024 pixlar).
      8. Utför brusreducering om bakgrundsbruset är för högt.
      9. Sluta skanna och spara bilderna.
      10. Stäng av kvicksilverlampan och lasrarna.
      11. Torka av målet med 75% alkohol och sänk målet till lägsta position.
      12. Stäng av slutaren och mikroskopets ström.
      13. När instrumentet har svalnat täcker du det med dammskyddet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Innan Wolbachia upptäcktes observerades Aa23- och Aa23-T-celler under ett ljusmikroskop för att bestämma eventuella morfologiska skillnader mellan de två cellinjerna. Aa23- och Aa23-T-celler har minst två cellmorfologier men ingen uppenbar morfologisk skillnad mellan de två celltyperna (figur 1). Här användes Aa23-celler som ett modellsystem för att detektera Wolbachia-infektion med fyra metoder. Positiv förstärkning av Wolbachiawsp-genen med hjälp av de diagnostiska primersna 81F/691R var möjlig i Aa23-celler (Lanes 1 och 2) men inte i Aa23-T-celler (Lanes 3 och 4) (Figur 2A). Analysen av Wolbachia-densiteten i cellinjerna med qPCR visade ett wsp/rps6-förhållande på 2,4 i Aa23-celler men ingen Wolbachia i Aa23-T-celler (figur 2B). Western blot-analys av proteinextrakt visade en stark wsp-signal för Aa23 och ingen signal för Aa23-T (figur 3A), medan den indirekta immunofluorescensanalysen detekterade wsp-proteinet (figur 3B) i Aa23-celler (grönt), medan endast DNA färgat med DAPI (blått) detekterades i Aa23-T-celler.

Figure 1
Figur 1: Ljusmikroskopi av oskadade Aa23- och Aa23-T-celler. Heterogen morfologi indikerar att mer än en celltyp finns i båda cellinjerna, vilket indikeras av pilarna. Skalstreck = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Detektion av Wolbachia-infektion i celler på nukleinsyranivå. (A) PCR-analys av Aa23- och Aa23-T-celler upplösta på en 1% agarosgel. Positiv PCR-förstärkning av Wolbachiawsp-genen med hjälp av de diagnostiska primersna, 81F/691R, observerad i Aa23-celler (Lanes 1 och 2) men inte i Aa23-T-celler (Lanes 3 och 4). (B) Wolbachia wsp kopieringstäthet av Aa23- och Aa23-T-celler. Densiteten var större i Aa23-celler och omöjlig att upptäcka i Aa23-T-celler. Kopieringsnummer normaliserades med Aedes albopictus rps6; data är medelvärdet ± SEM, n = 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Detektion av Wolbachia-infektion i celler på proteinnivå. (A) Immunoblotting med wsp-antikropp i Aa23-celler (Lane 1), med ett uppenbart band nära 25 kDa; Aa23-T (Lane 2), som behandlades med tetracyklin. (B) Immunofluorescensmärkning av celler som visar lokalisering av Wolbachia (grön); celler undersöktes med polyklonal anti-wsp-antikropp (Wolbachia), följt av get-anti-mus (grön) Alexa Fluor 488-konjugerade antikroppar och kärnor (blå) är färgade med DAPI. Musserum användes som en negativ kontroll eftersom anti-wsp-antikroppen inte renades och den polyklonala antikroppen var mus-härledd. Aa23-celler (Aa23-anti-wsp) infekterade med Wolbachia indikeras med en vit pil. Skalstänger = 10 μm. Förkortning: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; M = markör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil: Plasmidgenerering och anti-wsp-antikroppspreparat. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detektion av intracellulär Wolbachia-infektion är avgörande för studier av Wolbachia-värdinteraktioner och bekräftelse av framgångsrik transfektion av celler med nya stammar. I detta protokoll användes fyra metoder för att framgångsrikt detektera intracellulär Wolbachia-infektion vid nukleinsyra- och proteinnivåerna. Dessa fyra experimentella metoder bekräftade och förbättrade detektionsnoggrannheten för Wolbachia-infektion av celler.

PCR användes för att detektera närvaron av Wolbachia-infektion av celler vid nukleinsyranivån. Men eftersom det inte kvantifierar infektionsnivåer28,29 användes qPCR för att kvantifiera DNA-kopieringstäthet28,30. Eftersom noggrannheten hos PCR-metoder kan påverkas av låg förstärkningseffektivitet och falska positiva resultat är det viktigt att säkerställa god kvalitet på DNA, särskilt för qPCR-detektion, där reagenser och mallar måste placeras på is för att förhindra denaturering, och operationer bör utföras enligt standardmetoder. Låg förstärkningseffektivitet tenderar att orsakas av reagensnedbrytning i reaktionssystemet, otillräckliga mallmängder och /eller överdriven längd på förlängda primerfragment28. Falska positiva resultat orsakas vanligtvis av kontaminering av reagenser och mallar, höga nivåer av primerkoncentration och / eller dimer- och hårnålsprimerstrukturer. Därför är det viktigt att se till att reagenser är av hög kvalitet, primers optimeras baserat på litteraturen och lämplig programvara som används för primerdesign.

Två metoder som beskrivs ovan detekterar intracellulär Wolbachia-infektion vid nukleinsyranivån; de andra två detekterar intracellulär Wolbachia-infektion vid proteinnivån. Western blotting användes för att bestämma intracellulär Wolbachia-infektion av Aa23- och Aa23-T-celler på proteinnivå. Problem associerade med denna metod är relaterade till provberedning, antikroppsinkuation och detektion31. Kritiska steg i western blotting-detektionsprocessen inkluderar användning av färska och helt lyserade prover och korrekta sekundära antikroppar, som måste valideras och spädas enligt instruktionerna vid en utspädning på 1:12 000. Enligt de experimentella kraven kan denna metod också kombineras med andra immuniseringsmetoder. Därför användes immunofluorescens för att lokalisera intracellulär infektion med Wolbachia31 , eftersom detta inte detekteras direkt med pcr-, qPCR- eller western blot-analyser. Det finns några kritiska steg att notera om immunofluorescens. För det första, säkerställ optimal kvalitet på cellprover och undvik kontaminering. Kontaminering av celler med svart limbugg, som också kan färgas, kommer allvarligt att påverka tolkningen av resultaten. För det andra måste celltätheten i laserkonfokala rätter vara ~ 60-70%. Slutligen är tvättning med PBS efter provinkubation avgörande för att få tydliga fluorescensbilder.

Med hjälp av relativa och absoluta kvantitativa och visuella metoder för att detektera intracellulär Wolbachia-infektion vid nukleinsyra- och proteinnivåerna är detta protokoll mer omfattande och exakt än användningen av någon enskild metod. Dessutom resulterar konstruktion av en dubbelstandardkurva (för wsp och RPS6) i mindre stränga krav på PCR-systemet och förstärkningseffektivitet och delvis eliminering av det experimentella felet i den slutliga databehandlingen, vilket kraftigt minskar det experimentella arbetet. Det fanns dock vissa begränsningar för detta protokoll. För det första bereds anti-wsp-antikroppen internt och har ännu inte kommersialiserats. För det andra, även om det inte fanns några extra band på grund av den orenade polyklonala anti-wsp-antikroppen i western blotting, vilket indikerar antikroppsrenhet, hade den negativa kontrollgruppen som använde musserum också en grön fluorescensbakgrund, vilket inte bidrog till tolkningen av resultaten. Även om noggrannheten hos western blot- och immunofluorescensmetoderna kan förbättras genom att säkerställa användning av renade antikroppar eller exakta fluorescerande sonder, krävs ytterligare studier och analyser av empiriska data. Sammanfattningsvis rapporteras ett mer omfattande och korrekt protokoll för detektion av Wolbachia-infektion i Aa23-celler med hjälp av fyra metoder som använts i tidigare studier av Wolbachia. Protokollet som beskrivs här är tillämpligt på detektion av Wolbachia i andra typer av celler och vävnader.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Xin-Ru Wang från University of Minnesota för insiktsfulla förslag och vägledning. Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Natural Science Foundation of China (No.81760374).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Zeiss SteREO Discovery V8
Petri dish Fisher Scietific FB0875713
Pipette Pipetman F167380 P10
inSituX platform
Analysis software In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet MSE Supplies Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder In-house developed
Control software In-house developed
Immersion oil Cargille Laboratories 16482 Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform In-house developed
IR light source  Thorlabs Incorporated LED1085L LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring  In-house developed
Pump lasers  Thorlabs Incorporated LD785-SE400 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi Raspberry Pi Fundation
Retaining ring Thorlabs Incorporated SM1RR SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal University Wafers, Inc. U01-W2-L-190514 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim In-house developed
X-ray beam stop In-house developed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
  2. Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
  3. Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
  4. O'Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
  5. Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
  6. Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
  7. Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
  8. Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
  9. Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
  10. Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
  11. O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , Oxford University Press. (1997).
  12. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
  13. Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
  14. Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
  15. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  16. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
  17. Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).
  18. Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).
  19. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
  20. Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).
  21. Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
  22. Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
  23. Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).
  24. Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).
  25. Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
  26. Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
  27. Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
  28. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
  29. Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
  30. Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
  31. Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 184
Detektera <em>Wolbachia</em> Strain wAlbB i <em>Aedes albopictus</em> cellinjer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng,… More

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng, J., Wu, J. Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines. J. Vis. Exp. (184), e63662, doi:10.3791/63662 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter