Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Oppdage Wolbachia Strain wAlbB i Aedes albopictus Cell Lines

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63662
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1
1Guizhou Medical University, 2Guizhou Health Vocational College
* These authors contributed equally

Summary

Fire metoder ble brukt til å oppdage intracellulær Wolbachia, som komplementerte hverandre og forbedret deteksjonsnøyaktigheten av Wolbachia-infeksjon av Aedes albopictus-avledede Aa23 og Aa23-T kurert for innfødt Wolbachia-infeksjon ved hjelp av antibiotika.

Abstract

Som en maternalt innkaiende endosymbiont infiserer Wolbachia store mengder insektpopulasjoner. Studier har nylig rapportert vellykket regulering av RNA virusoverføring ved hjelp av Wolbachia-transfekterte mygg. Viktige strategier for å kontrollere virus inkluderer manipulering av vertsreproduksjon via cytoplasmisk inkompatibilitet og hemming av virale transkripsjoner via immunpriming og konkurranse om vertsavledede ressurser. Imidlertid er de underliggende mekanismene for svarene til Wolbachia-transfekterte mygg til virusinfeksjon dårlig forstått. Dette dokumentet presenterer en protokoll for in vitro-identifisering av Wolbachia-infeksjon på nukleinsyre- og proteinnivåene i Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-celler for å forbedre forståelsen av interaksjonene mellom Wolbachia og dens insektvektorer. Gjennom kombinert bruk av polymerasekjedereaksjon (PCR), kvantitativ PCR, vestlig blot og immunologiske analytiske metoder er det beskrevet en standard morfologiske protokoll for påvisning av Wolbachia-infiserte celler som er mer nøyaktige enn bruk av en enkelt metode. Denne tilnærmingen kan også brukes på påvisning av Wolbachia-infeksjon i andre insekt taxa.

Introduction

Den asiatiske tiger mygg Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), som er en nøkkelvektor av denguevirus (DENV) i Asia og andre deler av verden1, er en naturlig vert for to typer av de intracellulære bakteriene, Wolbachia (wAlbA og wAlbB), som distribueres over hele bakterielinjen og somatisk vev 2,3. Aa23 cellelinjen avledet fra A. albopictus embryoer består av minst to morfologiske celletyper, som begge støtter infeksjon4 og kan kureres av innfødt Wolbachia-infeksjon ved hjelp av antibiotika (Aa23-T). Gitt at Aa23 bare beholder wAlbB, er det en nyttig modell for studiet av verts-endosymbiont interaksjoner 4,5,6.

Wolbachia overføres mors og smitter anslagsvis 65% av insektarter 8,9 og 28% av myggarter10. Det infiserer en rekke vev og danner et intimt symbiotisk forhold til verten, som vanligvis induserer cytoplasmisk inkompatibilitet (CI)11 og populasjonserstatning ved å manipulere vertsreproduksjonssystemet12,13. Disse vertsresponsene har blitt observert i naturlige populasjoner av Drosophila simulans14 og i A. aegypti i et laboratoriebur og feltprøve15. En viktig ikke-produktiv manipulasjon fremkalt av Wolbachia er indusert vertsmotstand mot en rekke patogener, inkludert DENV, Chikungunya virus (CHIKV) og West Nile virus (WNV)16,17, som kan formidles av et forbedret medfødt immunsystem av symbiont18,19, konkurranse mellom Wolbachia og virus for essensielle vertsressurser20, og manipulering av vert virale forsvarsbaner21 .

Denne protokollen er utviklet for å studere disse underliggende mekanismene for Wolbachia-induserte verts antivirale responser. Den bruker fire metoder for påvisning av intracellulær Wolbachia infeksjon av Aa23 celler. Disse metodene gir et sterkt teoretisk grunnlag for studier av intracellulær Wolbachia-infeksjon av andre vertsarter. Den første metoden, PCR-en kraftig teknikk som tillater enzymatisk forsterkning av spesifikke områder av DNA uten å bruke konvensjonelle kloning prosedyrer-ble brukt til å oppdage Wolbachia DNA og bestemme tilstedeværelse / fravær av Wolbachia infeksjon22. Den andre metoden måler Wolbachia DNA-kopitetthet ved hjelp av kvantitativ PCR (qPCR) for pålitelig deteksjon og måling av produkter generert under hver PCR-syklus som er direkte proporsjonal med malmengden før PCR23. Den tredje metoden oppdager tilstedeværelsen av intracellulære Wolbachia-proteiner , ved hjelp av vestlig blot-en av de kraftigste verktøyene for å oppdage spesifikke proteiner i komplekse blandinger ved å kombinere den høye separasjonskraften til elektroforese, spesifisiteten av antistoffer og følsomheten til kromogene enzymatiske reaksjoner. Den endelige metoden er en immunfluorescence analyse (IFA) som kombinerer immunologi, biokjemi og mikroskopi for å oppdage Wolbachia overflateprotein (wsp) gjennom en antigen-antistoffreaksjon for å bekrefte det cellulære opptaket av Wolbachia og bestemme dens cellulære lokalisering.

Dette dokumentet beskriver de fire metodene som er oppført ovenfor for å verifisere eksistensen av Wolbachia i cellene, som kan brukes til å oppdage om den eksogene Wolbachia ble vellykket transfektert og Wolbachia i cellen ble ryddet. Etter å ha bestemt om Wolbachia er til stede i cellene eller ikke, kan en rekke forskjellige analyser utføres, inkludert genomikk, proteomikk eller metabolomikk. Denne protokollen demonstrerer påvisning av Wolbachia gjennom Aa23-celler, men kan også brukes i andre celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Materialer og reagenser

  1. Bruk pyrogenfrie løsninger og medier for cellekultur (se Materialfortegnet).
  2. Bruk ultrarent vann for å forberede alle løsninger.
  3. Vær forsiktig med å velge foster bovint serum (FBS) for cellekultur, etter en mye sjekkprosess.
    MERK: Siden FBS-tomter kan endres regelmessig, er det umulig å oppgi relevante katalog- og partinumre i denne protokollen.
  4. Velg Aa23 cellestammer avledet fra A. albopictus egg, tilsvarende Wolbachia-fri Aa23-T.

2. Cellekultur

  1. Forbered 25 cm2 cellekulturflasker med 4 ml Schneiders medium med 10% FBS.
  2. Inkuber kolbeene ved 28 °C under en 5 % CO2-atmosfære i 5 til 7 dager 7,24.
  3. Vær oppmerksom på ikke-inngrodde Aa23- og Aa23-T-celler i kolbeene ved hjelp av lysmikroskopi ved 100x forstørrelse (figur 1).

3. DNA-ekstraksjon

  1. Kultur cellene i 5-7 dager til 70-80% samløp per kolbe (trinn 2). Høst cellene med manuell pipettering fra 1 ml resuspendert kulturmedium ved sentrifugering i 5 min ved 100 × g i en mikrocentrifuge.
  2. Fjern supernatanten ved aspirasjon og oppbevar den resulterende cellepellet ved -20 °C.
  3. Resuspend pellets i 0,40 ml fosfatbufret saltvann (PBS), plasser 50 μL av oppløsningen i et mikrocentrifugerør, tilsett 5 μL proteinase K (20 mg / ml) og inkuber ved 55 °C i 1 time. Til slutt varme disse rørene ved 99 °C i 15 minutter for å få det rå DNA-et og oppbevar det ved -20 °C.

4. Påvisning av Wolbachia kjernesyre

  1. PCR-analyse
    1. Utfør PCR i et totalt reaksjonsvolum på 20 μL, som inneholder 8 μL ddH2O, 10 μL Taq-polymerase (se materialtabellen), 1 μL DNA-mal (fra trinn 3), 0,5 μL fremover og omvendt primere (10 μM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') og wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, henholdsvis.
    2. Bruk følgende PCR-forhold: innledende denaturering ved 95 °C i 5 minutter, etterfulgt av 35 sykluser med denaturering ved 94 °C, gløding ved 55 °C og forlengelse ved 72 °C; deretter en endelig forlengelse ved 72 °C i 7 min.
    3. Oppdag DNA på en 1% agarose gel (1% m / v agarose i PBS) ved hjelp av en gel imager.
  2. qPCR-analyse
    1. Analyser Wolbachia-genomkopien for tre biologiske repliker (n = 6) fra det ekstraherte DNA-et (trinn 3) ved hjelp av wsp primere 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') og QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, normalisert med ribosomalt protein S6 (RPS6) forover og bakoverprimere (henholdsvis 5' GAAGTTGAACGTATCGTTC 3' og 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3', henholdsvis)3.
    2. Generer en standardkurve for wAlbB og RPS6.
      1. Trekk ut DNA fra PMD-18T (en spesiell vektor for effektiv kloning av PCR-produkter (TA-kloning)) rekombinant plasmidholdig wsp og rps6 genfragmenter (Supplemental File) og mål plasmid DNA-konsentrasjonen (se materialtabellen).
      2. Konverter den plasmide DNA-konsentrasjonen for å kopiere tallkonsentrasjon ved hjelp av Eq (1).
        Plasmid kopinummer = Equation 1 (1)
      3. Fortynn det plasmide kopieringsnummeret fra 101 til 108 med ultrarent vann, og sett 3 replikerer for hver konsentrasjonsgradient.
      4. Utfør qPCR-forsterkning ved hjelp av TB Green og et PCR-system i sanntid (se materialtabellen), og registrer resultatene av hver reaksjon. Bruk Ct-verdien til å utvikle en standardkurve. Analyser DNA-et i et totalt reaksjonsvolum på 20 μL, som består av 7 μL ddH2O, 10,4 μL TB Grønn (se materialtabellen), 1 μL DNA-mal (levert av trinn 3) og 0,8 μL fremover og omvendt primere (10 μM). Bruk følgende reaksjonsforhold: innledende denaturering ved 95 °C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 °C i 10 s, og gløding ved 60 °C i 35 s.
      5. Beregn WSP - og RPS6-genkopinumrene i cellene i henhold til den etablerte standardkurven og Wolbachia relativ tetthet ved kopieringsnummeret til wsp / RPS6. Analyser dataene ved hjelp av en uavhengig t-test.
  3. Vestlig blotanalyse av Wolbachia protein
    1. Protein ekstraksjon
      1. Samle 2 × 107 Aa23- og Aa23-T-celler fra seksbrønnplaten (fra trinn 2) i et mikrocentrifugerør, vask dem tre ganger med PBS, og sentrifuger dem ved 100 × g i 5 minutter ved 4 °C.
      2. Klargjør 1 ml lysater med RIPA lysis buffer (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1% natriumdeoksykolat, 0,1% natriumdodecylsulfat [SDS], 2 mM natriumpyrofosfat, 25 mM β-glyserofosfat, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 0,5 μg/ml leupeptin) og PMSF (endelig konsentrasjon 1 mM).
      3. Tilsett 200 μL lysisbuffer til cellepellet og vedlikehold i 30 min på is. Sentrifuger lysatene ved 12 000 × g i 10 minutter ved 4 °C og fjern supernatanten.
    2. Analyser wsp-konsentrasjonen av supernatanten ved hjelp av et bicinchoninic acid (BCA) proteinanalysesett (se materialtabellen) i henhold til produsentens instruksjoner.
    3. Last like mye protein på en 15% SDS-PAGE gel [10% destillert vann; 50% (30% Acr-Bis (29:1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% ammonium persulfat), 0,04% TEMED].
    4. Overfør proteinet til nitrocellulosemembraner, blokker membranene med 5% skummet melk i 2 t26,27 ved romtemperatur, og vask deretter membranene tre ganger med TBST (1 ml Tween 20 i 1 L TBS) (se materialtabellen).
    5. Inkuber membranene over natten ved 4 °C med 100 μL anti-wsp polyklonalt antistoff (tilberedt internt, se Supplemental File)), tilberedt ved å fortynne det primære antistoffet med 5% skummet melk (1:12,000).
    6. Vask det primære antistoffet tre ganger med TBST.
    7. Inkuber membranene i 100 μL pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert sekundært antistoff på en shaker i 1 time ved romtemperatur.
    8. Vask membranene tre ganger med TBST, og bland 20 μL oppløsning A (HRP Substrat Luminol Reagent) og 20 μL oppløsning B (HRP Substrat Peroxide Reagent) i chemiluminescence detection kit med et forhold på 1:1. Senk hele membranen ned i luminescensløsningen samtidig, og følg signalene ved hjelp av et multifunksjonelt bildebehandlingssystem.
  4. Lokalisering av Wolbachia-protein
    1. Inkuber 5 × 105 Aa23- og Aa23-T-celler ved 28 °C på en Laser confocal Petri-tallerken med en tykkelse på 0,17 mm nederst, under en 5 % CO2-atmosfære i 3 til 4 dager 7,24. Vent til cellen er 60%-70% samløp og vask cellene tre ganger med PBS.
    2. Fest cellene i 20 min ved 4 °C i 1 ml 4 % (w/v) paraformaldehyd i PBS.
    3. Vask de faste cellene ved hjelp av PBST (0,2% v / v Triton X-100 i PBS) i 5 min og vask cellene igjen to ganger med PBS.
    4. Inkuber lysbildene i 1 time ved 37 °C i 1 ml 3 % (m/v) bovint serumalbumin i PBS.
    5. Inkuber lysbildene over natten i 100 μL mus anti-wsp polyklonalt antistoff (tilberedt internt) og museserum (1:1,000 fortynning i PBS) i en våt boks (det kan opprettholde fuktighet og forhindre fuktighet fra å fordampe) ved 4 °C.
    6. Fjern lysbildene fra den våte boksen og returner dem til romtemperatur; vask dem tre ganger med PBS og fjern PBS.
      MERK: Fra trinn 4.4.7 og fremover må alle operasjoner beskyttes mot lys.
    7. Inkuber lysbildene med 100 μL av en Alexa Fluor 488-konjugert geit antimus antistoff (1:2,000 fortynning i PBS) ved 37 °C i 30 minutter.
    8. Inkuber prøvelysbildene med 50 μL 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI fortynnet i PBS til 10 μg/ml, binder sterkt til DNA) ved 37 °C i 5 minutter og deretter vasker dem tre ganger med PBS.
    9. Vær oppmerksom på immuniseringen under et konfokalt mikroskop.
      1. Slå på strømmen og laseren.
      2. Slå på mikroskopets normale lamper og kvikksølvlamper.
      3. Start systemet og kjør operasjonsprogramvaren. Sett en dråpe sedertreolje på prøvelysbildene, plasser prøvelysbildene på mikroskopstadiet, og flytt scenen til riktig posisjon.
      4. Klikk på kvikksølvlampeobservasjonsknappen i programvaren, åpne kvikksølvlampelukkeren og følg prøven under et invertert mikroskop for å fokusere.
      5. Bruk det manuelle kontrollpanelet til å velge grønn og blå fluorescens for å ta fluorescensbilder under 100x forstørrelse.
      6. Slå av observasjonsknappen for kvikksølvlampen og begynn å hente bilder.
      7. For å sikre god bildekvalitet, forhåndsbestill etter skannestørrelse (512 piksler x 512 piksler). Juster skannestørrelsen for å få klare bilder (1 024 piksler x 1 024 piksler).
      8. Utfør støyreduksjon hvis bakgrunnsstøyen er for høy.
      9. Slutt å skanne og lagre bildene.
      10. Slå av kvikksølvlampen og laserne.
      11. Tørk av målet med 75% alkohol og senk målet til laveste posisjon.
      12. Slå av lukker- og mikroskopeffekten.
      13. Etter at instrumentet er avkjølt, dekk det med støvdekselet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før Wolbachia ble oppdaget, ble Aa23- og Aa23-T-celler observert under et lysmikroskop for å bestemme eventuelle morfologiske forskjeller mellom de to cellelinjene. Aa23- og Aa23-T-celler har minst to cellemorfologier, men ingen åpenbar morfologisk forskjell mellom de to celletypene (figur 1). Her ble Aa23-celler brukt som et modellsystem for å oppdage Wolbachia-infeksjon ved hjelp av fire metoder. Positiv forsterkning av Wolbachiawsp-genet ved hjelp av de diagnostiske primerne 81F/691R var mulig i Aa23-celler (bane 1 og 2), men ikke i Aa23-T-celler (bane 3 og 4) (figur 2A). Analysen av Wolbachia-tetthet i cellelinjene ved hjelp av qPCR viste et wsp/rps6-forhold på 2,4 i Aa23-celler, men ingen Wolbachia i Aa23-T-celler (figur 2B). Vestlig blotanalyse av proteinekstrakter viste et sterkt wsp-signal for Aa23 og ikke noe signal for Aa23-T (figur 3A), mens den indirekte immunfluorescensanalysen oppdaget wsp-proteinet (figur 3B) i Aa23-celler (grønn), mens bare DNA farget med DAPI (blå) ble påvist i Aa23-T-celler.

Figure 1
Figur 1: Lysmikroskopi av unstained Aa23- og Aa23-T-celler. Heterogen morfologi angir at mer enn én celletype finnes i begge cellelinjene, som angitt av pilene. Skalalinje = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Påvisning av Wolbachia-infeksjon i celler på nukleinsyrenivå. (A) PCR-analyse av Aa23- og Aa23-T-celler løst på en 1% agarose gel. Positiv PCR-forsterkning av Wolbachiawsp-genet ved hjelp av diagnostiske primere, 81F/691R, observert i Aa23-celler (bane 1 og 2), men ikke i Aa23-T-celler (bane 3 og 4). (B) Wolbachia wsp kopi tetthet av Aa23 og Aa23-T celler. Tettheten var større i Aa23-celler og uoppdagelig i Aa23-T-celler. Kopieringsnummeret ble normalisert ved hjelp av Aedes albopictus rps6. data er gjennomsnittlige ± SEM, n = 6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Påvisning av Wolbachia-infeksjon i celler på proteinnivå. (A) Immunoblotting med wsp antistoff i Aa23 celler (Lane 1), med et åpenbart bånd nær 25 kDa; Aa23-T (Lane 2), som ble behandlet med tetracyklin. (B) Immunfluorescence merking av celler som viser lokalisering av Wolbachia (grønn); cellene ble undersøkt med polyklonalt anti-wsp antistoff (Wolbachia), etterfulgt av geit antimus (grønn) Alexa Fluor 488-konjugerte antistoffer, og kjerner (blå) er farget med DAPI. Musserum ble brukt som en negativ kontroll fordi anti-wsp-antistoffet ikke ble renset, og det polyklonale antistoffet var museavledet. Aa23 celler (Aa23-anti-wsp) smittet med Wolbachia er indikert med en hvit pil. Skalastenger = 10 μm. Forkortelse: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindole; M = markør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende fil: Plasmid generasjon og anti-wsp antistoff forberedelse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Påvisning av intracellulær Wolbachia-infeksjon er avgjørende for studiet av Wolbachia-vert interaksjoner og bekreftelse av vellykket transfeksjon av celler med nye stammer. I denne protokollen ble fire metoder brukt til å oppdage intracellulær Wolbachia-infeksjon på nukleinsyre- og proteinnivået. Disse fire eksperimentelle metodene bekreftet og forbedret deteksjonsnøyaktigheten til Wolbachia-infeksjon av celler.

PCR ble brukt til å oppdage tilstedeværelsen av Wolbachia-infeksjon av celler på nukleinsyrenivå. Men siden det ikke kvantifiserer nivåer av infeksjon28,29, ble qPCR brukt til å kvantifisere DNA-kopitetthet28,30. Siden nøyaktigheten av PCR-metoder kan påvirkes av lav forsterkningseffektivitet og falske positiver, er det viktig å sikre god kvalitet på DNA, spesielt for qPCR-deteksjon, der reagenser og maler må plasseres på is for å forhindre denaturering, og operasjoner bør utføres i henhold til standardmetoder. Lav forsterkningseffektivitet har en tendens til å være forårsaket av reagensforringelse i reaksjonssystemet, utilstrekkelige malmengder og / eller overdreven lengde på utvidede primerfragmenter28. Falske positiver er vanligvis forårsaket av forurensning av reagenser og maler, høye nivåer av primerkonsentrasjon og / eller dimer og hårnålprimerstrukturer. Derfor er det viktig å sikre at reagenser er av høy kvalitet, primere er optimalisert basert på litteraturen, og passende programvare som brukes til primerdesign.

To metoder beskrevet ovenfor oppdager intracellulær Wolbachia-infeksjon på nukleinsyrenivå; de to andre oppdager intracellulær Wolbachia-infeksjon på proteinnivå. Vestlig blotting ble brukt til å bestemme intracellulær Wolbachia-infeksjon av Aa23- og Aa23-T-celler på proteinnivå. Problemer knyttet til denne metoden er relatert til prøvepreparering, antistoffinkubasjon og deteksjon31. Kritiske trinn i den vestlige blotting deteksjonsprosessen inkluderer bruk av friske og fullt lysede prøver og riktige sekundære antistoffer, som må valideres og fortynnes i henhold til instruksjonene ved en fortynning på 1:12,000. I henhold til de eksperimentelle kravene kan denne metoden også kombineres med andre immuniseringsmetoder. Derfor ble Immunofluorescence brukt til å lokalisere intracellulær infeksjon av Wolbachia31 , fordi dette ikke oppdages direkte ved hjelp av PCR, qPCR eller vestlige blotanalyser. Det er noen kritiske trinn å merke seg om immunfluorescens. Først må du sikre optimal kvalitet på celleprøver og unngå forurensning. Forurensning av celler ved svart lim bug, som også kan farges, vil alvorlig påvirke tolkningen av resultatene. For det andre må celletettheten i laserkonfektene være ~ 60-70%. Til slutt er vasking med PBS etter prøveinkubasjon avgjørende for å få klare fluorescensbilder.

Ved hjelp av relative og absolutte kvantitative og visuelle metoder for å oppdage intracellulær Wolbachia-infeksjon på nukleinsyre- og proteinnivået, er denne protokollen mer omfattende og nøyaktig enn bruken av en enkelt metode. I tillegg resulterer konstruksjon av en dobbel standardkurve (for wsp og RPS6) i mindre strenge krav til PCR-systemet og forsterkningseffektivitet og delvis eliminering av den eksperimentelle feilen i den endelige databehandlingen, noe som i stor grad reduserer det eksperimentelle arbeidet. Det var imidlertid noen begrensninger i denne protokollen. For det første er anti-wsp-antistoffet tilberedt internt og har ennå ikke blitt kommersialisert. For det andre, selv om det ikke var noen ekstra bånd på grunn av det unyttifiserte polyklonale anti-wsp-antistoffet i vestlig blotting, noe som indikerer antistoffrenhet, hadde den negative kontrollgruppen ved hjelp av museserum også en grønn fluorescensbakgrunn, som ikke bidro til tolkningen av resultatene. Mens nøyaktigheten av de vestlige blotter- og immunfluorescensmetodene kan forbedres ved å sikre bruk av rensede antistoffer eller nøyaktige fluorescerende sonder, kreves videre studier og analyse av empiriske data. Oppsummert rapporteres en mer omfattende og nøyaktig protokoll for påvisning av Wolbachia-infeksjon i Aa23-celler ved hjelp av fire metoder som brukes i tidligere studier av Wolbachia. Protokollen beskrevet her gjelder for påvisning av Wolbachia i andre typer celler og vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Xin-Ru Wang fra University of Minnesota for innsiktsfulle forslag og veiledning. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81760374).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Zeiss SteREO Discovery V8
Petri dish Fisher Scietific FB0875713
Pipette Pipetman F167380 P10
inSituX platform
Analysis software In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet MSE Supplies Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder In-house developed
Control software In-house developed
Immersion oil Cargille Laboratories 16482 Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform In-house developed
IR light source  Thorlabs Incorporated LED1085L LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring  In-house developed
Pump lasers  Thorlabs Incorporated LD785-SE400 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi Raspberry Pi Fundation
Retaining ring Thorlabs Incorporated SM1RR SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal University Wafers, Inc. U01-W2-L-190514 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim In-house developed
X-ray beam stop In-house developed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
  2. Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
  3. Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
  4. O'Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
  5. Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
  6. Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
  7. Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
  8. Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
  9. Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
  10. Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
  11. O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , Oxford University Press. (1997).
  12. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
  13. Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
  14. Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
  15. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  16. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
  17. Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).
  18. Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).
  19. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
  20. Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).
  21. Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
  22. Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
  23. Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).
  24. Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).
  25. Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
  26. Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
  27. Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
  28. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
  29. Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
  30. Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
  31. Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 184
Oppdage <em>Wolbachia</em> Strain wAlbB i <em>Aedes albopictus</em> Cell Lines
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng,… More

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng, J., Wu, J. Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines. J. Vis. Exp. (184), e63662, doi:10.3791/63662 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter