Summary
采用4种方法检测细胞内沃尔巴克氏体，相辅相成，提高了抗生素治愈白纹伊蚊来源的Aa23和Aa23-T感染的细菌感染的准确性。
Abstract
作为母体内共生体，沃尔巴克氏体感染了大部分昆虫种群。最近的研究报道了使用沃尔巴克氏体转染的蚊子成功调节RNA病毒传播。控制病毒的关键策略包括通过细胞质不相容性操纵宿主繁殖，以及通过免疫启动和竞争宿主来源资源来抑制病毒转录本。然而，沃尔巴克氏体转染蚊子对病毒感染反应的潜在机制知之甚少。本文提出了一种在白纹伊蚊（Diptera：Culicidae）Aa23细胞的核酸和蛋白质水平上体外鉴定沃尔巴克氏体感染的方案，以增强对沃尔巴克氏体与其昆虫载体之间相互作用的理解。通过结合使用聚合酶链反应（PCR）、定量PCR、免疫印迹和免疫学分析方法，已经描述了一种比使用单一方法更准确的用于检测沃尔巴克氏体感染细胞的标准形态学方案。这种方法也可用于检测其他昆虫分类群中的沃尔巴克氏体感染。
Introduction
亚洲虎蚊 白纹 伊蚊（Skuse）（双翅目：Culicidae）是亚洲和世界其他地区登革热病毒（DENV）的主要载体1，是两种类型的细胞内细菌的天然宿主， 沃尔巴克氏体 （wAlbA和 wAlbB），分布在整个种系和体细胞组织中2，3。来自 白纹 松胚胎的Aa23细胞系由至少两种形态细胞类型组成，这两种细胞都支持感染4 ，并且可以使用抗生素（Aa23-T）治愈天然 沃尔巴克氏体 感染。鉴于Aa23仅保留 wAlbB，它是研究宿主 - 内共生体相互作用4，5，6的有用模型。
沃尔巴克氏体是母体传播的，估计感染了65%的昆虫物种8，9和28%的蚊子物种10。它感染多种组织并与宿主形成亲密的共生关系，通常通过操纵宿主生殖系统12，13诱导细胞质不相容（CI）11和种群替代。在模拟果蝇14的自然种群和在实验室笼子和田间试验15的埃及伊蚊中观察到这些宿主反应。沃尔巴克氏体引发的一个重要的非生殖性操作是诱导宿主对各种病原体的抗性，包括DENV，基孔肯雅病毒（CHIKV）和西尼罗河病毒（WNV）16，17，这些病原体可能由共生体的先天免疫系统改善18，19介导，沃尔巴克氏体和病毒之间对基本宿主资源的竞争20，以及操纵宿主病毒防御途径21.
该方案是为研究 沃尔巴克氏体诱导的宿主抗病毒反应的这些潜在机制而开发的。它使用四种方法检测Aa23细胞的细胞内 沃尔巴克氏体 感染。这些方法为研究其他宿主物种的细胞内 沃尔巴克氏体 感染提供了强有力的理论基础。第一种方法，PCR - 一种强大的技术，允许在不使用常规克隆程序的情况下酶扩增DNA的特定区域 - 用于检测 沃尔巴克氏体 DNA并确定 是否存在沃尔巴克氏体 感染22。第二种方法是使用定量PCR（qPCR）测量 沃尔巴克氏体 DNA拷贝密度，以可靠地检测和测量每个PCR循环中产生的产物，该产物与PCR23之前的模板量成正比。第三种方法使用蛋白质印迹检测细胞内 沃尔巴克氏体 蛋白的存在 - 这是通过结合电泳的高分离能力，抗体的特异性和显色酶促反应的敏感性来检测复杂混合物中特定蛋白质的最强大工具之一。最后一种方法是免疫荧光测定（IFA），结合免疫学，生物化学和显微镜，通过抗原抗体反应检测 沃尔巴克氏体 表面蛋白（wsp），以确认 沃尔巴克氏体的 细胞摄取并确定其细胞定位。
本文介绍了上述四种验证细胞中 沃尔巴克氏体 存在的方法，可用于检测外源性 沃尔巴克氏体 是否成功转染，细胞内的 沃尔巴克氏体 是否被清除。在确定细胞中是否存在 沃尔巴克氏体 后，可以进行各种不同的分析，包括基因组学，蛋白质组学或代谢组学。该协议演示了通过Aa23细胞检测 沃尔巴克氏体 ，但也可用于其他细胞。
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Protocol
1. 材料和试剂
- 使用无热原溶液和培养基进行细胞培养（参见 材料表）。
- 使用超纯水制备所有溶液。
- 在选择用于细胞培养的胎牛血清（FBS）时要小心，遵循批次检查过程。
注意：由于FBS批次可能会定期更改，因此无法在该协议中说明相关目录和批号。 - 选择来自 白纹 松卵的Aa23细胞株，对应于无 沃尔巴克氏体Aa23-T。
2. 细胞培养
- 用4 mL施耐德培养基和10%FBS制备25 cm 2 细胞培养瓶。
- 将烧瓶在28°C下在5%CO2 气氛下孵育5至7天7，24。
- 使用光学显微镜以100x放大倍率观察烧瓶中未染色的Aa23和Aa23-T细胞（图1）。
3. 脱氧核糖核酸提取
- 培养细胞5-7天，直到每个烧瓶70-80%汇合（步骤2）。通过在微量离心机中以100×g离心5分钟，从1mL重悬的培养基中手动移液收获细胞。
- 通过抽吸除去上清液，并将所得细胞沉淀储存在-20°C。
- 将沉淀重悬于0.40mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，将50μL溶液置于微量离心管中，加入5μL蛋白酶K（20mg / mL），并在55°C下孵育1小时。最后，将这些管在99°C下加热15分钟，以获得粗DNA并将其储存在-20°C。
4. 沃尔巴克氏体 核酸的检测
- 聚合酶链反应分析
- 在总反应体积为 20 μL、含有 8 μL ddH2O、10 μL Taq 聚合酶（参见 材料表）、1 μL DNA 模板（从步骤 3 开始）、0.5 μL 正反引物 （10 μM） 中进行 PCR： Wsp81F（5' TCC AAT AAT AAG 特加特加特加 AGAAAC 3'）和 WSP691R（5' AAA AAT ACG CTA CTC CA 3'）25， 分别。
- 使用以下PCR条件：在95°C下初始变性5分钟，然后在94°C下进行35个变性循环，在55°C退火，在72°C下延伸;然后，在72°C下进行最终延伸7分钟。
- 使用凝胶成像仪检测1%琼脂糖凝胶（PBS中为1%w / v琼脂糖）上的DNA。
- 二氯杀伤性反应分析
- 使用 WSP 引物 183 F（5' AAGGAGAGTCTC3'）和 QBrev R （5' AGTGAGTAGTCTCCC 3'）22 分析从提取的 DNA（步骤 3）中分离出的三个生物重复 （n = 6），用核糖体蛋白 S6 （RPS6） 正向和反向引物（5' GAGGGGTCT3' 和 5' GAGATGGT3'）3'标准化 3。3。
- 生成一条标准曲线，用于调整和 RPS6。
- 从PMD-18T（用于高效克隆PCR产物（TA克隆）的特殊载体）中提取含有 WSp 和 rps6 基因片段的重组质粒（补充文件）并测量质粒DNA浓度（参见 材料表）。
- 使用等式（1）将质粒DNA浓度转换为拷贝数浓度。
质粒拷贝数 =
（1） - 用超纯水将质粒拷贝数从101 稀释到108 ，并为每个浓度梯度设置3个重复。
- 使用TB Green和实时荧光定量PCR系统（参见 材料表）进行qPCR扩增，并记录每个反应的结果。使用 Ct 值开发标准曲线。分析总反应体积为20 μL的DNA，包括7 μL ddH2O，10.4 μL TB绿（参见 材料表），1 μL DNA模板（由步骤3提供）和0.8 μL正向和反向引物（10 μM）。使用以下反应条件：在95°C下初始变性5分钟，然后在95°C下40个变性循环10秒，在60°C退火35秒。
- 根据建立的标准曲线计算细胞中的WSP和RPS6基因拷贝数，并通过wsp / RPS6的拷贝数计算沃尔巴克氏体相对密度。使用独立的样本 t 检验分析数据。
- 沃尔巴克氏体蛋白的蛋白质印迹分析
- 蛋白质提取
- 在微量离心管中从六孔板（从步骤2开始）中收集2×107 Aa23和Aa23-T细胞，用PBS洗涤三次，并在4°C下以100× g 离心5分钟。
- 用RIPA裂解缓冲液（50 mM三（pH 7.4），150mM氯化钠，1%曲拉基X-100，1%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠[SDS]，2mM焦磷酸钠，25mM β-甘油磷酸盐，1mM EDTA，1mM Na3VO4，0.5μg/ mL亮蛋白汀）和PMSF（终浓度1mM）制备1mL裂解物。
- 向细胞沉淀中加入200μL裂解缓冲液，并在冰上保持30分钟。在4°C下以12，000× g 离心裂解物10分钟并除去上清液。
- 按照制造商的说明，使用双辛可宁酸（BCA）蛋白测定试剂盒（参见 材料表）测定上清液的wsp浓度。
- 在15%SDS-PAGE凝胶上加载等量的蛋白质[10%蒸馏水; 50%（30%阿克里双歧杆菌（29：1），38%1M三，pH 8.8;1%（10%SDS），1%（10%过硫酸铵），0.04%TEMED]。
- 将蛋白质转移到硝酸纤维素膜中，用5%脱脂牛奶在室温下阻断膜2小时26，27 ，然后用TBST（1mL吐温20在1L TBS中）洗涤膜三次（见 材料表）。
- 用100μL抗wsp多克隆抗体（内部制备，参见 补充文件）在4°C下孵育膜过夜，用5%脱脂牛奶（1：12，000）稀释一抗。
- 用TBST洗涤一抗三次。
- 将膜在室温下在振荡器上孵育100μL辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗中1小时。
- 用TBST洗涤膜三次，并在化学发光检测试剂盒中以1：1的比例混合20μL溶液A（HRP底物鲁米诺试剂）和20μL溶液B（HRP底物过氧化物试剂）。同时将整个膜浸入发光溶液中，并使用多功能成像系统观察信号。
- 蛋白质提取
- 沃尔巴克氏体蛋白的免疫荧光定位
- 在底部厚度为 0.17 mm的激光共聚焦培养皿上，在28°C下孵育5×10 5Aa23和Aa23-T 细胞，在5%CO 2气氛下孵育3至4天7，24。等到细胞汇合60%-70%，并用PBS洗涤细胞三次。
- 将细胞在4°C下在PBS中以1mL的4%（w / v）多聚甲醛固定20分钟。
- 使用PBST（PBS中0.2%v / v曲拉顿X-100）洗涤固定细胞5分钟，并用PBS再次洗涤细胞两次。
- 将载玻片在37°C下在PBS中以1mL的3%（w / v）牛血清白蛋白孵育1小时。
- 将载玻片在4°C的湿箱（可以保持湿度并防止水分蒸发）中将100μL小鼠抗wsp多克隆抗体（内部制备）和小鼠血清（PBS中1：1，000稀释）中孵育过夜。
- 从湿盒中取出载玻片，将其恢复到室温;用 PBS 清洗它们三次，然后取出 PBS。
注意：从步骤 4.4.7 开始，所有操作都必须防光。 - 将载玻片与100μLAlexa Fluor 488偶联的山羊抗小鼠抗体（在PBS中稀释1：2，000）在37°C下孵育30分钟。
- 将样品载玻片与50μL4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI在PBS中稀释至10μg/ mL，与DNA强结合）在37°C下孵育5分钟，然后用PBS洗涤三次。
- 在共聚焦显微镜下观察免疫染色。
- 打开电源和激光。
- 打开显微镜的正常灯和水银灯。
- 启动系统并运行操作软件。在样品载玻片上滴一滴雪松油，将样品载玻片放在显微镜载物台上，然后将载物台移动到适当的位置。
- 单击软件中的 汞灯观察 按钮，打开汞灯快门，在倒置显微镜下观察样品以进行聚焦。
- 使用 手动控制面板 选择绿色和蓝色荧光，以拍摄100倍放大倍率下的荧光照片。
- 关闭 汞灯观察 按钮并开始获取图像。
- 为确保良好的图像质量，请按扫描大小（512 像素 x 512 像素）进行预扫描。调整扫描大小以获得清晰的图像（1，024 像素 x 1，024 像素）。
- 如果背景噪音过高，则进行降噪。
- 停止扫描并保存图像。
- 关闭汞灯和激光。
- 用75%酒精擦拭物镜，并将物镜降低到最低位置。
- 关闭快门和显微镜电源。
- 仪器冷却后，用防尘罩盖住。
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Representative Results
在检测到沃尔巴克氏体之前，在光学显微镜下观察Aa23和Aa23-T细胞，以确定两种细胞系之间的任何形态差异。Aa23和Aa23-T细胞至少具有两种细胞形态，但两种细胞类型之间没有明显的形态差异（图1）。在这里，Aa23细胞被用作使用四种方法检测沃尔巴克氏体感染的模型系统。使用诊断引物81F/691R对Wolbachiawsp基因进行阳性扩增在Aa23细胞（泳道1和2）中是可能的，但在Aa23-T细胞（泳道3和4）中则不能（图2A）。使用qPCR对细胞系中沃尔巴克氏体密度的分析显示，Aa23细胞中的wsp / rps6比为2.4，但在Aa23-T细胞中没有沃尔巴克氏体（图2B）。蛋白质提取物的蛋白质印迹分析显示Aa23的WSP信号较强，Aa23-T没有信号（图3A），而间接免疫荧光测定法在Aa23细胞（绿色）中检测到WSp蛋白（图3B），而在Aa23-T细胞中仅检测到用DAPI（蓝色）染色的DNA。
图1：未染色的Aa23和Aa23-T细胞的光学显微镜。 异质形态表明两种细胞系中存在多种细胞类型，如箭头所示。比例尺 = 20 μm 请点击此处查看此图的大图。
图2：在核酸水平上检测细胞中的沃尔巴克氏体感染。 （A）在1%琼脂糖凝胶上分离的Aa23和Aa23-T细胞的PCR分析。使用诊断引物81F/691R对沃尔巴克氏体wsp基因进行阳性PCR扩增，在Aa23细胞（泳道1和2）中观察到，但在Aa23-T细胞（泳道3和4）中观察。（B）Aa23和Aa23-T细胞的沃尔巴克氏体wsp拷贝密度。Aa23细胞的密度更大，Aa23-T细胞中检测不到。拷贝数使用白纹伊蚊rps6进行归一化;数据是均值±SEM，n = 6。请点击此处查看此图的大图。
图3：在蛋白质水平上检测细胞中的 沃尔巴克氏体 感染。 （A）在Aa23细胞（泳道1）中使用wsp抗体进行免疫印迹，明显条带接近25 kDa;Aa23-T（2号泳道），用四环素处理。（B）显示 沃尔巴克氏体 定位的细胞的免疫荧光标记（绿色）;用多克隆抗wsp抗体（沃尔巴克氏体）探查细胞，然后用山羊抗小鼠（绿色）Alexa Fluor 488偶联抗体探测细胞，并用DAPI染色细胞核（蓝色）。小鼠血清作为阴性对照，因为抗wsp抗体未纯化，多克隆抗体为小鼠来源。感染 沃尔巴克氏体的 Aa23细胞（Aa23-抗wsp）用白色箭头表示。比例尺 = 10 μm。简称：DAPI = 4'，6-二氨基-2-苯基吲哚;M = 标记。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件：质粒生成和抗 wsp 抗体制备。请按此下载此档案。
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Discussion
细胞内 沃尔巴克氏体 感染的检测对于研究 沃尔巴克氏体-宿主相互作用和确认新菌株细胞的成功转染至关重要。在该方案中，使用了四种方法在核酸和蛋白质水平上成功检测细胞内 沃尔巴克氏体 感染。这四种实验方法证实并提高了 沃尔巴克氏体 感染细胞的检测精度。
PCR用于在核酸水平上检测细胞 的沃尔巴克氏体 感染的存在。然而，由于它没有量化感染水平28，29，因此qPCR用于量化DNA拷贝密度28，30。由于PCR方法的准确性可能受到扩增效率低和假阳性的影响，因此确保DNA的良好质量非常重要，特别是对于qPCR检测，其中试剂和模板必须放在冰上以防止变性，并且应按照标准方法进行操作。扩增效率低往往是由反应体系中的试剂降解、模板量不足和/或延伸引物片段长度过长引起的 28.假阳性通常是由试剂和模板污染、高水平引物浓度和/或二聚体和发夹引物结构引起的。因此，重要的是要确保试剂质量高，引物根据文献进行优化，并用于引物设计的适当软件。
上述两种方法在核酸水平上检测细胞内 沃尔巴克氏体 感染;另外两个在蛋白质水平上检测细胞内 沃尔巴克氏体 感染。蛋白质印迹用于在蛋白质水平上确定Aa23和Aa23-T细胞的细胞内 沃尔巴克氏体 感染。与该方法相关的问题与样品制备、抗体孵育和检测31有关。免疫印迹检测过程中的关键步骤包括使用新鲜和完全裂解的样品和正确的二抗，必须根据说明以1：12，000的稀释度对其进行验证和稀释。根据实验要求，该方法也可以与其他免疫方法结合使用。因此，免疫荧光被 沃尔巴克氏体31 用于定位细胞内感染，因为使用PCR，qPCR或蛋白质印迹分析无法直接检测到。关于免疫荧光，有一些关键步骤需要注意。首先，确保细胞样品的最佳质量并避免污染。黑胶虫污染细胞，也可以染色，将严重影响结果的解释。其次，激光共聚焦培养皿中的细胞密度必须约为60-70%。最后，样品孵育后用PBS洗涤对于获得清晰的荧光图像至关重要。
该方案使用相对和绝对定量和视觉方法在核酸和蛋白质水平上检测细胞内 沃尔巴克氏体 感染，比使用任何单一方法更全面，更准确。此外，构建双标曲线（wsp和RPS6）导致对PCR系统和扩增效率的要求不那么严格，并部分消除了最终数据处理中的实验误差，从而大大减少了实验工作。但是，该协议存在一些限制。首先，抗 wsp 抗体是内部制备的，尚未商业化。其次，虽然免疫印迹中未纯化的多克隆抗wsp抗体没有额外的条带，表明抗体纯度，但使用小鼠血清的阴性对照组也具有绿色荧光背景，不利于结果的解释。虽然通过确保使用纯化的抗体或准确的荧光探针可以提高免疫印迹和免疫荧光法的准确性，但需要进一步研究和分析经验数据。总之，使用先前 对沃尔巴克氏体 研究中使用的四种方法检测Aa23细胞中 沃尔巴克氏体感染的更全面，更准确的方案进行了报道。这里描述的方案适用于检测其他类型的细胞和组织中的 沃尔巴克氏体 。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
我们感谢明尼苏达大学的王新茹博士提供有见地的建议和指导。本研究由国家自然科学基金（No.81760374）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
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