Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Påvisning af Wolbachia-stamme wAlbB i Aedes albopictus-cellelinjer

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63662
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1
1Guizhou Medical University, 2Guizhou Health Vocational College
* These authors contributed equally

Summary

Fire metoder blev brugt til at detektere intracellulær Wolbachia, som supplerede hinanden og forbedrede detektionsnøjagtigheden af Wolbachia-infektion af Aedes albopictus-afledt Aa23 og Aa23-T helbredt af native Wolbachia-infektion ved hjælp af antibiotika.

Abstract

Som en moderligt forankret endosymbiont inficerer Wolbachia store andele af insektpopulationer. Undersøgelser har for nylig rapporteret den vellykkede regulering af RNA-virusoverførsel ved hjælp af Wolbachia-transinficerede myg. Nøglestrategier til bekæmpelse af vira inkluderer manipulation af værtsgengivelse via cytoplasmisk inkompatibilitet og hæmning af virale transkripter via immunpriming og konkurrence om værtsafledte ressourcer. Imidlertid er de underliggende mekanismer for reaktionerne fra Wolbachia-transinficerede myg til virusinfektion dårligt forstået. Dette papir præsenterer en protokol til in vitro identifikation af Wolbachia-infektion ved nukleinsyre- og proteinniveauerne i Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-celler for at forbedre forståelsen af interaktionerne mellem Wolbachia og dets insektvektorer. Gennem kombineret anvendelse af polymerasekædereaktion (PCR), kvantitativ PCR, western blot og immunologiske analysemetoder er der beskrevet en standardmorfologisk protokol til påvisning af Wolbachia-inficerede celler, der er mere nøjagtig end brugen af en enkelt metode. Denne fremgangsmåde kan også anvendes til påvisning af Wolbachia-infektion i andre insekttaxa.

Introduction

Den asiatiske tigermyg Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), som er en nøglevektor for denguevirus (DENV) i Asien og andre dele af verden1, er en naturlig vært for to typer af de intracellulære bakterier, Wolbachia (wAlbA og wAlbB), som er fordelt over hele kimlinjen og somatisk væv 2,3. Aa23-cellelinjen afledt af A. albopictus-embryoner består af mindst to morfologiske celletyper, som begge understøtter infektion4 og kan helbredes for indfødt Wolbachia-infektion ved hjælp af antibiotika (Aa23-T). I betragtning af at Aa23 kun bevarer wAlbB, er det en nyttig model til undersøgelse af vært-endosymbiontinteraktioner 4,5,6.

Wolbachia overføres moderen og inficerer anslået 65% afinsektarterne 8,9 og 28% af myggene10. Det inficerer en række væv og danner et intimt symbiotisk forhold til værten, hvilket normalt inducerer cytoplasmisk inkompatibilitet (CI)11 og populationsudskiftning ved at manipulere værts reproduktive system12,13. Disse værtsresponser er blevet observeret i naturlige populationer af Drosophila simulans14 og i A. aegypti i et laboratoriebur og feltforsøg15. En vigtig ikke-produktiv manipulation fremkaldt af Wolbachia er induceret værtsresistens over for en række patogener, herunder DENV, Chikungunya-virus (CHIKV) og West Nile-virus (WNV)16,17, der kan medieres af et forbedret medfødt immunsystem af symbionten 18,19, konkurrence mellem Wolbachia og vira om væsentlige værtsressourcer20 og manipulation af værtsvirusforsvarsveje21 .

Denne protokol er udviklet til at studere disse underliggende mekanismer for Wolbachia-inducerede værts antivirale reaktioner. Det bruger fire metoder til påvisning af intracellulær Wolbachia-infektion af Aa23-celler. Disse metoder giver et stærkt teoretisk grundlag for undersøgelser af intracellulær Wolbachia-infektion af andre værtsarter. Den første metode, PCR - en kraftfuld teknik, der muliggør enzymatisk amplifikation af specifikke regioner af DNA uden at anvende konventionelle kloningsprocedurer - blev brugt til at detektere Wolbachia DNA og bestemme tilstedeværelsen / fraværet af Wolbachia-infektion 22. Den anden metode måler Wolbachia DNA-kopitæthed ved hjælp af kvantitativ PCR (qPCR) til pålidelig påvisning og måling af produkter genereret under hver PCR-cyklus, der er direkte proportional med mængden af skabelon før PCR23. Den tredje metode detekterer tilstedeværelsen af intracellulære Wolbachia-proteiner ved hjælp af western blot-et af de mest kraftfulde værktøjer til påvisning af specifikke proteiner i komplekse blandinger ved at kombinere elektroforesens høje separationskraft, antistoffernes specificitet og følsomheden af kromoogene enzymatiske reaktioner. Den endelige metode er et immunofluorescensassay (IFA), der kombinerer immunologi, biokemi og mikroskopi for at detektere Wolbachia-overfladeproteinet (wsp) gennem en antigen-antistofreaktion for at bekræfte den cellulære optagelse af Wolbachia og bestemme dens cellulære lokalisering.

Dette papir beskriver de fire metoder, der er anført ovenfor for at verificere eksistensen af Wolbachia i cellerne, som kan bruges til at detektere, om den eksogene Wolbachia blev transficeret med succes, og Wolbachia i cellen blev ryddet. Efter at have fastslået, om Wolbachia er til stede i cellerne eller ej, kan der udføres en række forskellige analyser, herunder genomik, proteomik eller metabolomics. Denne protokol demonstrerer påvisning af Wolbachia gennem Aa23-celler, men kan også anvendes i andre celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Materialer og reagenser

  1. Brug pyrogenfrie opløsninger og medier til cellekultur (se materialetabellen).
  2. Brug ultrarent vand til at forberede alle opløsninger.
  3. Vær forsigtig med at vælge føtalt bovint serum (FBS) til cellekultur efter en massekontrolproces.
    BEMÆRK: Da FBS-partier kan ændres regelmæssigt, er det umuligt at angive de relevante katalog- og lotnumre i denne protokol.
  4. Vælg Aa23-cellestammer afledt af A. albopictus-æg , svarende til Wolbachia-fri Aa23-T.

2. Cellekultur

  1. Forbered 25 cm2 cellekulturkolber med 4 ml Schneiders medium med 10% FBS.
  2. Kolberne inkuberes ved 28 °C under en 5 % CO2 -atmosfære i 5 til 7 dage 7,24.
  3. Ufarvede Aa23- og Aa23-T-celler observeres i kolberne ved hjælp af lysmikroskopi ved 100x forstørrelse (figur 1).

3. DNA-ekstraktion

  1. Cellerne dyrkes i 5-7 dage indtil 70-80% sammenløb pr. kolbe (trin 2). Høst cellerne med manuel pipettering fra 1 ml resuspendet dyrkningsmedium ved centrifugering i 5 minutter ved 100 × g i en mikrocentrifuge.
  2. Supernatanten fjernes ved aspiration, og den resulterende cellepille opbevares ved -20 °C.
  3. Pellets resuspenderes i 0,40 ml phosphatbufferet saltvand (PBS), 50 μL af opløsningen anbringes i et mikrocentrifugerør, der tilsættes 5 μL proteinase K (20 mg/ml), og der inkuberes ved 55 °C i 1 time. Til sidst opvarmes disse rør ved 99 °C i 15 minutter for at opnå det rå DNA og opbevares ved -20 °C.

4. Påvisning af Wolbachia-nukleinsyre

  1. PCR-analyse
    1. Udføres PCR i et samlet reaktionsvolumen på 20 μL, indeholdende 8 μL ddH2O, 10 μL Taq-polymerase (se materialetabellen), 1 μL DNA-skabelon (fra trin 3), 0,5 μL fremadgående og omvendte primere (10 μM): wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') og wsp691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25, henholdsvis.
    2. Der anvendes følgende PCR-betingelser: indledende denaturering ved 95 °C i 5 minutter efterfulgt af 35 cyklusser med denaturering ved 94 °C, udglødning ved 55 °C og forlængelse ved 72 °C. derefter en sidste forlængelse ved 72 °C i 7 min.
    3. Detektion af DNA'et på en 1% agarosegel (1% w/v agarose i PBS) ved hjælp af et gelbillede.
  2. qPCR-analyse
    1. Wolbachia-genomkopien analyseres for tre biologiske replikater (n = 6) fra det ekstraherede DNA (trin 3) ved hjælp af wsp-primere 183 F (5' AAGGAACCGAAGTTCATG 3') og QBrev R (5' AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22, normaliseret med ribosomalt protein S6 (RPS6) frem og tilbage primere (5' GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3' og 5' GAGATGGTCAGCGGTGATTT 3') henholdsvis)3.
    2. Generer en standardkurve for wAlbB og RPS6.
      1. Uddrag DNA fra PMD-18T (en speciel vektor til effektiv kloning af PCR-produkter (TA-kloning)) rekombinant plasmid indeholdende wsp - og rps6-genfragmenter (supplerende fil) og mål plasmid-DNA-koncentrationen (se materialetabellen).
      2. Plasmid-DNA-koncentrationen konverteres til at kopiere talkoncentrationen ved hjælp af Eq (1).
        Plasmid kopi nummer = Equation 1 (1)
      3. Plasmidkopinummeret fortyndes fra 101 til 108 med ultrarent vand, og indstil 3 replikater for hver koncentrationsgradient.
      4. Udfør qPCR-forstærkning ved hjælp af TB Green og et PCR-system i realtid (se materialetabellen), og registrer resultaterne af hver reaktion. Brug Ct-værdien til at udvikle en standardkurve. Analyser DNA'et i et samlet reaktionsvolumen på 20 μL, bestående af 7 μL ddH2O, 10,4 μL TB Green (se materialetabellen), 1 μL DNA-skabelon (leveret af trin 3) og 0,8 μL fremadgående og omvendte primere (10 μM). Der anvendes følgende reaktionsbetingelser: initial denaturering ved 95 °C i 5 min. efterfulgt af 40 cyklusser med denaturering ved 95 °C i 10 s og udglødning ved 60 °C i 35 s.
      5. WSP- og RPS6-genkopinumrene i cellerne beregnes i henhold til den etablerede standardkurve og Wolbachias relative tæthed med kopinummeret wsp/RPS6. Analyser dataene ved hjælp af en uafhængig stikprøve t-test.
  3. Western blot analyse af Wolbachia protein
    1. Protein udvinding
      1. 2 × 107 Aa23- og Aa23-T-celler opsamles fra seks-brøndpladen (fra trin 2) i et mikrocentrifugerør, vaskes tre gange med PBS, og de centrifugeres ved 100 × g i 5 minutter ved 4 °C.
      2. 1 ml lysater fremstilles med RIPA lysisbuffer (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1%Triton X-100, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% natriumdodecylsulfat [SDS], 2 mM natriumpyrophosphat, 25 mM β-glycerophosphat, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 0,5 μg/ml leupeptin) og PMSF (slutkoncentration 1 mM).
      3. Tilsæt 200 μL lysisbuffer til cellepillen og vedligehold i 30 minutter på is. Lysaterne centrifugeres ved 12.000 × g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes.
    2. Assay wsp-koncentrationen af supernatanten ved hjælp af et bicinchoninsyre (BCA) proteinassaysæt (se materialetabellen) efter producentens anvisninger.
    3. Hæld lige store mængder protein på en 15% SDS-PAGE gel [10% destilleret vand; 50% (30% Acr-Bis (29: 1), 38% 1 M Tris, pH 8,8; 1% (10% SDS), 1% (10% ammoniumpersulfat), 0,04% TEMED].
    4. Proteinet overføres til nitrocellulosemembraner, membranerne blokeres med 5% skummetmælk i 2 timer26,27 ved stuetemperatur, og membranerne vaskes derefter tre gange med TBST (1 ml Tween 20 i 1 liter TBS) (se materialetabellen).
    5. Membranerne inkuberes natten over ved 4 °C med 100 μL polyklonalt antistof (fremstillet internt, se supplerende fil)), fremstillet ved fortynding af det primære antistof med 5 % skummetmælk (1:12.000).
    6. Vask det primære antistof tre gange med TBST.
    7. Membranerne inkuberes i 100 μL peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret sekundært antistof på en shaker i 1 time ved stuetemperatur.
    8. Membranerne vaskes tre gange med TBST, og 20 μL opløsning A (HRP Substrat Luminolreagens) og 20 μL opløsning B (HRP Substratperoxidreagens) blandes i kemiluminescensdetektionssættet i et forhold på 1:1. Nedsænk hele membranen i luminescensopløsningen på samme tid, og observer signalerne ved hjælp af et multifunktionelt billeddannelsessystem.
  4. Immunofluorescens lokalisering af Wolbachia protein
    1. Inkuberes 5 × 105 Aa23- og Aa23-T-celler ved 28 °C på en konfokal laserskål af petriskål med en tykkelse på 0,17 mm i bunden under en 5 % CO2 -atmosfære i 3 til 4 dage 7,24. Vent, indtil cellen er 60%-70% sammenløb, og vask cellerne tre gange med PBS.
    2. Cellerne anbringes i 20 minutter ved 4 °C i 1 ml 4 % (w/v) paraformaldehyd i PBS.
    3. De faste celler vaskes med PBST (0,2 % v/v Triton X-100 i PBS) i 5 minutter, og cellerne vaskes igen to gange med PBS.
    4. Diasene inkuberes i 1 time ved 37 °C i 1 ml 3 % (w/v) bovint serumalbumin i PBS.
    5. Diabér diasene natten over i 100 μL polyklonalt antistof fra mus (fremstillet internt) og museserum (1:1.000 fortynding i PBS) i en våd kasse (det kan opretholde fugtigheden og forhindre fugt i at fordampe) ved 4 °C.
    6. Fjern diasene fra vådboksen og returner dem til stuetemperatur; vask dem tre gange med PBS og fjern PBS.
      BEMÆRK: Fra trin 4.4.7 og fremefter skal alle operationer beskyttes mod lys.
    7. Diasene inkuberes med 100 μL af et Alexa Fluor 488-konjugeret gede-antimuseantistof (1:2.000 fortynding i PBS) ved 37 °C i 30 min.
    8. Prøveglassene inkuberes med 50 μL 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI fortyndet i PBS til 10 μg/ml, binder stærkt til DNA) ved 37 °C i 5 minutter, og de vaskes derefter tre gange med PBS.
    9. Overhold immunostaining under et konfokalt mikroskop.
      1. Tænd for strømmen og laseren.
      2. Tænd mikroskopets normale og kviksølvlamper.
      3. Start systemet og kør driftssoftwaren. Sæt en dråbe cedertræolie på prøveglassene, placer prøveglassene på mikroskopstadiet, og flyt scenen til den passende position.
      4. Klik på kviksølvlampeobservationsknappen i softwaren, åbn kviksølvlampelukkeren, og observer prøven under et omvendt mikroskop for at fokusere.
      5. Brug det manuelle kontrolpanel til at vælge grøn og blå fluorescens for at tage fluorescensbilleder under 100x forstørrelse.
      6. Sluk for kviksølvlampens observationsknap , og begynd at hente billeder.
      7. For at sikre god billedkvalitet skal du forudscanne efter scanningsstørrelse (512 pixels x 512 pixels). Juster scanningsstørrelsen for at få klare billeder (1.024 pixels x 1.024 pixels).
      8. Udfør støjreduktion, hvis baggrundsstøjen er for høj.
      9. Stop scanningen, og gem billederne.
      10. Sluk for kviksølvlampen og laserne.
      11. Tør målet af med 75% alkohol, og sænk målet til den laveste position.
      12. Sluk for lukkeren og mikroskopet.
      13. Når instrumentet er afkølet, skal du dække det med støvdækslet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før Wolbachia blev detekteret, blev Aa23- og Aa23-T-celler observeret under et lysmikroskop for at bestemme eventuelle morfologiske forskelle mellem de to cellelinjer. Aa23- og Aa23-T-celler har mindst to cellemorfologier, men ingen åbenbar morfologisk forskel mellem de to celletyper (figur 1). Her blev Aa23-celler brugt som et modelsystem til at detektere Wolbachia-infektion ved hjælp af fire metoder. Positiv forstærkning af Wolbachiawsp-genet ved hjælp af de diagnostiske primere 81F/691R var mulig i Aa23-celler (bane 1 og 2), men ikke i Aa23-T-celler (bane 3 og 4) (figur 2A). Analysen af Wolbachia-densiteten i cellelinjerne ved hjælp af qPCR viste et wsp / rps6-forhold på 2,4 i Aa23-celler, men ingen Wolbachia i Aa23-T-celler (figur 2B). Western blot-analyse af proteinekstrakter viste et stærkt wsp-signal for Aa23 og intet signal for Aa23-T (figur 3A), mens det indirekte immunfluorescensassay detekterede wsp-proteinet (figur 3B) i Aa23-celler (grøn), mens kun DNA farvet med DAPI (blå) blev påvist i Aa23-T-celler.

Figure 1
Figur 1: Lysmikroskopi af ufarvede Aa23- og Aa23-T-celler. Heterogen morfologi indikerer, at mere end en celletype er til stede i begge cellelinjer, som angivet med pilene. Skalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Påvisning af Wolbachia-infektion i celler på nukleinsyreniveau. (A) PCR-analyse af Aa23- og Aa23-T-celler løst på en 1% agarosegel. Positiv PCR-forstærkning af Wolbachiawsp-genet ved hjælp af de diagnostiske primere, 81F/691R, observeret i Aa23-celler (bane 1 og 2), men ikke i Aa23-T-celler (bane 3 og 4). (B) Wolbachia wsp kopitæthed af Aa23- og Aa23-T-celler. Densiteten var større i Aa23-celler og ikke målbart i Aa23-T-celler. Kopinummer blev normaliseret ved hjælp af Aedes albopictus rps6; data er middelværdier ± SEM, n = 6. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Påvisning af Wolbachia-infektion i celler på proteinniveau. (A) Immunoblotting med wsp-antistof i Aa23-celler (bane 1) med et tydeligt bånd nær 25 kDa; Aa23-T (bane 2), som blev behandlet med tetracyklin. (B) Immunofluorescens mærkning af celler, der viser lokalisering af Wolbachia (grøn); celler blev undersøgt med polyklonalt anti-wsp antistof (Wolbachia), efterfulgt af gede-antimus (grøn) Alexa Fluor 488-konjugerede antistoffer, og kerner (blå) er farvet med DAPI. Museserum blev brugt som en negativ kontrol, fordi anti-wsp-antistoffet ikke blev oprenset, og det polyklonale antistof var museafledt. Aa23-celler (Aa23-anti-wsp) inficeret med Wolbachia er angivet med en hvid pil. Skalastænger = 10 μm. Forkortelse: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; M = markør. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil: Plasmidgenerering og anti-wsp antistofpræparat. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Påvisning af intracellulær Wolbachia-infektion er afgørende for undersøgelsen af Wolbachia-værtsinteraktioner og bekræftelsen af vellykket transfektion af celler med nye stammer. I denne protokol blev fire metoder anvendt til succesfuldt at detektere intracellulær Wolbachia-infektion ved nukleinsyre- og proteinniveauerne. Disse fire eksperimentelle metoder bekræftede og forbedrede detektionsnøjagtigheden af Wolbachia-infektion af celler.

PCR blev brugt til at detektere tilstedeværelsen af Wolbachia-infektion af celler på nukleinsyreniveauet. Da det imidlertid ikke kvantificerer infektionsniveauer28,29, blev qPCR brugt til at kvantificere DNA-kopitæthed28,30. Da nøjagtigheden af PCR-metoder kan påvirkes af lav amplifikationseffektivitet og falske positiver, er det vigtigt at sikre god kvalitet af DNA, især til qPCR-detektion, hvor reagenser og skabeloner skal placeres på is for at forhindre denaturering, og operationer skal udføres i henhold til standardmetoder. Lav forstærkningseffektivitet har tendens til at være forårsaget af reagensnedbrydning i reaktionssystemet, utilstrækkelige skabelonmængder og / eller overdreven længde af udvidede primerfragmenter28. Falske positiver er normalt forårsaget af forurening af reagenser og skabeloner, høje niveauer af primerkoncentration og / eller dimer- og hårnålegrunderstrukturer. Derfor er det vigtigt at sikre, at reagenser er af høj kvalitet, primere optimeres ud fra litteraturen og passende software, der anvendes til primerdesign.

To metoder beskrevet ovenfor detekterer intracellulær Wolbachia-infektion på nukleinsyreniveauet; de to andre detekterer intracellulær Wolbachia-infektion på proteinniveau. Western blotting blev brugt til at bestemme intracellulær Wolbachia-infektion af Aa23- og Aa23-T-celler på proteinniveau. Problemer forbundet med denne metode er relateret til prøveforberedelse, antistofinkubation og påvisning31. Kritiske trin i western blotting-detektionsprocessen omfatter anvendelse af friske og fuldt lysede prøver og korrekte sekundære antistoffer, som skal valideres og fortyndes i henhold til instruktionerne ved en fortynding på 1:12.000. Ifølge de eksperimentelle krav kan denne metode også kombineres med andre immuniseringsmetoder. Derfor blev immunofluorescens brugt til at lokalisere intracellulær infektion af Wolbachia31 , fordi dette ikke direkte detekteres ved hjælp af PCR-, qPCR- eller western blot-analyser. Der er nogle kritiske trin at bemærke om immunfluorescens. Først skal du sikre den optimale kvalitet af celleprøver og undgå forurening. Forurening af celler med sort limbug, som også kan farves, vil alvorligt påvirke fortolkningen af resultaterne. For det andet skal celletætheden i laserkonfokale retter være ~ 60-70%. Endelig er vask med PBS efter prøveinkubation afgørende for at få klare fluorescensbilleder.

Ved anvendelse af relative og absolutte kvantitative og visuelle metoder til påvisning af intracellulær Wolbachia-infektion ved nukleinsyre- og proteinniveauerne er denne protokol mere omfattende og nøjagtig end brugen af en enkelt metode. Derudover resulterer konstruktion af en dobbeltstandardkurve (for wsp og RPS6) i mindre strenge krav til PCR-systemet og forstærkningseffektivitet og delvis eliminering af den eksperimentelle fejl i den endelige databehandling, hvilket i høj grad reducerer det eksperimentelle arbejde. Der var dog nogle begrænsninger for denne protokol. For det første fremstilles anti-wsp-antistoffet internt og er endnu ikke blevet kommercialiseret. For det andet, selvom der ikke var nogen ekstra bånd på grund af det urensede polyklonale anti-wsp-antistof i western blotting, hvilket indikerer antistofrenhed, havde den negative kontrolgruppe, der brugte museserum, også en grøn fluorescensbaggrund, hvilket ikke var befordrende for fortolkningen af resultaterne. Mens nøjagtigheden af western blot- og immunofluorescensmetoderne kan forbedres ved at sikre brugen af rensede antistoffer eller nøjagtige fluorescerende sonder, er der behov for yderligere undersøgelse og analyse af empiriske data. Sammenfattende rapporteres en mere omfattende og nøjagtig protokol til påvisning af Wolbachia-infektion i Aa23-celler ved hjælp af fire metoder, der er anvendt i tidligere undersøgelser af Wolbachia. Den protokol, der er beskrevet her, gælder for påvisning af Wolbachia i andre typer celler og væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Xin-Ru Wang fra University of Minnesota for indsigtsfulde forslag og vejledning. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81760374).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Zeiss SteREO Discovery V8
Petri dish Fisher Scietific FB0875713
Pipette Pipetman F167380 P10
inSituX platform
Analysis software In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet MSE Supplies Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder In-house developed
Control software In-house developed
Immersion oil Cargille Laboratories 16482 Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform In-house developed
IR light source  Thorlabs Incorporated LED1085L LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring  In-house developed
Pump lasers  Thorlabs Incorporated LD785-SE400 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi Raspberry Pi Fundation
Retaining ring Thorlabs Incorporated SM1RR SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal University Wafers, Inc. U01-W2-L-190514 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim In-house developed
X-ray beam stop In-house developed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
  2. Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility. Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).
  3. Dobson, S. L., et al. Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).
  4. O'Neill, S. L., et al. In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line. Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).
  5. Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus. Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).
  6. Sinkins, S. P. Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).
  7. Fallon, A. M. Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB. In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).
  8. Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data. Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).
  9. Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology. National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).
  10. Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).
  11. O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , Oxford University Press. (1997).
  12. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).
  13. Bourtzis, K., et al. Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control. Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).
  14. Turelli, M., Hoffmann, A. A. Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila. Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).
  15. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  16. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
  17. Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).
  18. Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti. PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).
  19. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
  20. Caragata, E. P., et al. Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).
  21. Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).
  22. Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus. Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).
  23. Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).
  24. Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis. Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).
  25. Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).
  26. Park, M. S., Takeda, M. Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana. Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).
  27. Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin. Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).
  28. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
  29. Kosea, H., Karr, T. L. Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody. Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).
  30. Ye, Y. H., et al. Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).
  31. Jensenius, M., et al. Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).

Tags

Immunologi og infektion udgave 184
Påvisning af <em>Wolbachia-stamme</em> wAlbB i <em>Aedes albopictus-cellelinjer</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng,… More

Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng, J., Wu, J. Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines. J. Vis. Exp. (184), e63662, doi:10.3791/63662 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter