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Chemistry

रासायनिक इमेजिंग के लिए हाइपरस्पेक्ट्रल उत्तेजित रमन स्कैटरिंग और सुसंगत एंटी-स्टोक्स रमन स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी की प्रत्यक्ष तुलना

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63677
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Purdue University

Summary

यह पेपर सीधे उत्तेजित रमन बिखरने (एसआरएस) और सुसंगत एंटी-स्टोक्स रमन स्कैटरिंग (सीएआरएस) के रिज़ॉल्यूशन, संवेदनशीलता और इमेजिंग विरोधाभासों की तुलना करता है जो एक ही माइक्रोस्कोप प्लेटफॉर्म में एकीकृत होते हैं। परिणाम बताते हैं कि सीएआरएस में बेहतर स्थानिक रिज़ॉल्यूशन है, एसआरएस बेहतर विरोधाभास और वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन देता है, और दोनों तरीकों में समान संवेदनशीलता है।

Abstract

उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) और सुसंगत एंटी-स्टोक्स रमन स्कैटरिंग (सीएआरएस) माइक्रोस्कोपी सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली सुसंगत रमन बिखरने वाली इमेजिंग प्रौद्योगिकियां हैं। हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस और सीएआरएस इमेजिंग प्रत्येक पिक्सेल पर रमन वर्णक्रमीय जानकारी प्रदान करते हैं, जो विभिन्न रासायनिक रचनाओं के बेहतर पृथक्करण को सक्षम बनाता है। यद्यपि दोनों तकनीकों को दो उत्तेजना लेजर की आवश्यकता होती है, लेकिन उनकी सिग्नल डिटेक्शन योजनाएं और वर्णक्रमीय गुण काफी अलग हैं। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक ही मंच पर हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस और सीएआरएस इमेजिंग दोनों का प्रदर्शन करना है और विभिन्न जैविक नमूनों की इमेजिंग के लिए दो माइक्रोस्कोपी तकनीकों की तुलना करना है। वर्णक्रमीय फोकसिंग विधि फेम्टोसेकंड लेजर का उपयोग करके वर्णक्रमीय जानकारी प्राप्त करने के लिए नियोजित की जाती है। मानक रासायनिक नमूनों का उपयोग करके, एक ही उत्तेजना स्थितियों में एसआरएस और सीएआरएस की संवेदनशीलता, स्थानिक रिज़ॉल्यूशन और वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन (यानी, नमूने पर शक्ति, पिक्सेल निवास समय, उद्देश्य लेंस, पल्स ऊर्जा) की तुलना की जाती है। जैविक नमूनों के लिए सीएआरएस और एसआरएस के इमेजिंग विरोधाभासों को जोड़ा जाता है और तुलना की जाती है। सीएआरएस और एसआरएस प्रदर्शन की सीधी तुलना रासायनिक इमेजिंग के लिए साधन के इष्टतम चयन की अनुमति देगी।

Introduction

रमन प्रकीर्णन घटना को पहली बार 1928 में सी वी रमन1 द्वारा देखा गया था। जब एक घटना फोटॉन एक नमूने के साथ बातचीत कर रहा होता है, तो एक अप्रत्याशित प्रकीर्णन घटना अनायास हो सकती है, जिसमें फोटॉन का ऊर्जा परिवर्तन विश्लेषण की गई रासायनिक प्रजातियों के कंपन संक्रमण से मेल खाता है। इस प्रक्रिया को रासायनिक टैग के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है, जिससे यह नमूना गड़बड़ी को कम करते हुए रासायनिक विश्लेषण के लिए एक बहुमुखी, लेबल मुक्त उपकरण बन जाता है। इसके फायदों के बावजूद, सहज रमन बिखरने कम बिखरने वाले क्रॉस-सेक्शन (आमतौर पर अवरक्त [आईआर] अवशोषण क्रॉस-सेक्शन से10 11 कम) से ग्रस्त है, जिसके लिए विश्लेषण2 के लिए लंबे अधिग्रहण समय की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, रमन बिखरने की प्रक्रिया की संवेदनशीलता को बढ़ाने की खोज वास्तविक समय इमेजिंग के लिए रमन प्रौद्योगिकियों को आगे बढ़ाने में आवश्यक है।

रमन प्रकीर्णन की संवेदनशीलता को बहुत बढ़ाने का एक प्रभावी तरीका सुसंगत रमन बिखरने (सीआरएस) प्रक्रियाओं के माध्यम से है, जिसके लिए दो लेजर दालों का उपयोग आमतौर पर आणविक कंपन संक्रमण 3,4 को उत्तेजित करनेके लिए किया जाता है। जब दो लेजर के बीच फोटॉन ऊर्जा अंतर नमूना अणुओं के कंपन मोड से मेल खाता है, तो मजबूत रमन संकेत उत्पन्न होंगे। इमेजिंग के लिए दो सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली सीआरएस प्रक्रियाएं सुसंगत एंटी-स्टोक्स रमन स्कैटरिंग (सीएआरएस) और उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (एसआरएस) 5 हैं। पिछले दो दशकों में, तकनीकी विकास ने जैविक नमूनों में रासायनिक परिवर्तनों के लेबल मुक्त परिमाणीकरण और स्पष्टीकरण के लिए शक्तिशाली उपकरण बनने के लिए उन्नत सीएआरएस और एसआरएस माइक्रोस्कोपी तकनीकों को उन्नत किया है।

सीएआरएस माइक्रोस्कोपी द्वारा रासायनिक इमेजिंग को 1982 में दिनांकित किया जा सकता है जब लेजर स्कैनिंग को पहली बार कार्स छवियों को प्राप्त करने के लिए लागू किया गया था, डंकन एट अल6 द्वारा प्रदर्शित किया गया था। लेजर स्कैनिंग मल्टीफोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी7 के व्यापक अनुप्रयोगों के बाद सीएआरएस माइक्रोस्कोपी के आधुनिकीकरण में बहुत तेजी आई थी। उच्च पुनरावृत्ति दर लेजर का उपयोग करके ज़ी समूह से प्रारंभिक काम ने जैविक नमूनों 8,9,10 में अणुओं के लक्षण वर्णन के लिए एक उच्च गति, लेबल मुक्त, रासायनिक इमेजिंग प्लेटफॉर्म होने के लिए कारों को संक्रमण किया है। सीएआरएस इमेजिंग के लिए प्रमुख मुद्दों में से एक गैर-अनुनादी पृष्ठभूमि की उपस्थिति है, जो छवि विपरीत को कम करता है और रमन स्पेक्ट्रम को विकृत करता है। गैर-अनुनादी पृष्ठभूमि11,12,13,14,15 को कम करने या सीएआरएस स्पेक्ट्रा 16,17 से गुंजयमान रमन संकेतों को निकालनेके लिए कई प्रयास किए गए हैं। एक और उन्नति जिसने क्षेत्र को बहुत उन्नत किया है, हाइपरस्पेक्ट्रल सीएआरएस इमेजिंग है, जो बेहतर रासायनिक चयनात्मकता 18,19,20,21 के साथ प्रत्येक छवि पिक्सेल पर वर्णक्रमीय मानचित्रण की अनुमति देता है।

उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) सीएआरएस की तुलना में एक युवा इमेजिंग तकनीक है, हालांकि इसे पहले22 की खोज की गई थी। 2007 में, एसआरएस माइक्रोस्कोपी को कम पुनरावृत्ति दर लेजर स्रोत23 का उपयोग करके सूचित किया गया था। जल्द ही, कई समूहों ने उच्च पुनरावृत्ति दर लेजर24,25,26 का उपयोग करके उच्च गति एसआरएस इमेजिंग का प्रदर्शन किया। सीएआरएस पर एसआरएस माइक्रोस्कोपी के प्रमुख लाभों में से एक गैर-अनुनादी पृष्ठभूमि27 की अनुपस्थिति है, हालांकि क्रॉस-फेज मॉडुलन (एक्सपीएम), क्षणिक अवशोषण (टीए), दो-फोटॉन अवशोषण (टीपीए), और फोटोथर्मल (पीटी) प्रभाव जैसे अन्य पृष्ठभूमि, एसआरएस28 के साथ हो सकते हैं। इसके अलावा, एसआरएस सिग्नल और नमूना एकाग्रता में सीएआरएस के विपरीत रैखिक संबंध हैं, जिसमें द्विघात सिग्नल-एकाग्रता निर्भरता29 है। यह रासायनिक परिमाणीकरण और वर्णक्रमीय अमिश्रण को सरल बनाता है। बहुरंगी और हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस विभिन्न रूपों में 30,31,32,33,34,35,36 में विकसित हुआ है, जिसमें वर्णक्रमीय फोकस रासायनिक इमेजिंग 37,38 के लिए सबसे लोकप्रिय दृष्टिकोणों में से एक है।

दोनों सीएआरएस और एसआरएस को सिग्नल उत्तेजना के लिए अणुओं के कंपन संक्रमण से मेल खाने के लिए नमूने पर पंप और स्टोक्स लेजर बीम के ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता होती है। सीएआरएस और एसआरएस माइक्रोस्कोप भी बहुत कुछ साझा करते हैं। हालांकि, इन दो प्रक्रियाओं में अंतर्निहित भौतिकी, और इन माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियों में शामिल सिग्नल डिटेक्शन मेंअसमानताएं 3,39 हैं। सीएआरएस एक पैरामीट्रिक प्रक्रिया है जिसमें शुद्ध फोटॉन-अणु ऊर्जा युग्मन नहीं है3. एसआरएस, हालांकि, एक गैर-पैरामीट्रिक प्रक्रिया है, और फोटॉन और आणविक प्रणालियों के बीच ऊर्जा हस्तांतरणमें योगदान देता है। सीएआरएस में, एंटी-स्टोक्स आवृत्ति पर एक नया संकेत उत्पन्न होता है, जबकि एसआरएस पंप और स्टोक्स लेजर बीम के बीच ऊर्जा हस्तांतरण के रूप में प्रकट होता है।

सीएआरएस सिग्नल समीकरण (1)28 को संतुष्ट करता है।

Equation 1 (1)

इस बीच, एसआरएस सिग्नल को समीकरण (2)28 के रूप में लिखा जा सकता है।

Equation 1(2)

यहां, मैंपी, आईएस, आईसीएआरएस, और Δआईएसआरएस क्रमशः पंप बीम, स्टोक्स बीम, सीएआरएस सिग्नल और एसआरएस सिग्नल की तीव्रता हैं। ω(3) नमूने का तीसरा क्रम अरैखिक ऑप्टिकल संवेदनशीलता है, और वास्तविक और काल्पनिक भागों से बना एक जटिल मूल्य है।

ये समीकरण वर्णक्रमीय प्रोफाइल और सीएआरएस और एसआरएस की सिग्नल-एकाग्रता निर्भरता व्यक्त करते हैं। भौतिकी में अंतर के परिणामस्वरूप इन दो माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियों के लिए असमान पहचान योजनाएं होती हैं। सीएआरएस में सिग्नल डिटेक्शन में आमतौर पर नए उत्पन्न फोटॉनों का वर्णक्रमीय पृथक्करण और फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) या चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) का उपयोग करके पता लगाना शामिल होता है; एसआरएस के लिए, पंप और स्टोक्स बीम के बीच ऊर्जा विनिमय आमतौर पर एक ऑप्टिकल मॉड्यूलेटर का उपयोग करके उच्च गति तीव्रता मॉडुलन द्वारा मापा जाता है और लॉक-इन एम्पलीफायर के साथ जोड़े गए फोटोडायोड (पीडी) का उपयोग करके डिमॉड्यूलेशन किया जाता है।

यद्यपि हाल के वर्षों में सीएआरएस और एसआरएस दोनों क्षेत्रों में कई तकनीकी विकास और अनुप्रयोग प्रकाशित किए गए हैं, लेकिन दो सीआरएस तकनीकों की कोई व्यवस्थित तुलना एक ही मंच पर नहीं की गई है, खासकर हाइपरस्पेक्ट्रल सीएआरएस और एसआरएस माइक्रोस्कोपी के लिए। संवेदनशीलता, स्थानिक संकल्प, वर्णक्रमीय संकल्प और रासायनिक पृथक्करण क्षमताओं में प्रत्यक्ष तुलना जीवविज्ञानियों को रासायनिक परिमाणीकरण के लिए सर्वोत्तम साधन का चयन करने की अनुमति देगी। इस प्रोटोकॉल में, एक फेम्टोसेकंड लेजर सिस्टम और वर्णक्रमीय फोकसिंग के आधार पर हाइपरस्पेक्ट्रल सीएआरएस और एसआरएस तौर-तरीकों दोनों के साथ एक मल्टीमॉडल इमेजिंग प्लेटफॉर्म बनाने के लिए विस्तृत चरण प्रदान किए जाते हैं। वर्णक्रमीय संकल्प, पता लगाने की संवेदनशीलता, स्थानिक संकल्प और कोशिकाओं के इमेजिंग विरोधाभासों के लिए दो तकनीकों की तुलना आगे की दिशा में की गई है।

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Protocol

1. हाइपरस्पेक्ट्रल सीआरएस इमेजिंग के लिए वाद्य सेटअप

नोट: सीआरएस सिग्नल की पीढ़ी को उच्च शक्ति (यानी, कक्षा 3 बी या कक्षा 4) लेजर के उपयोग की आवश्यकता होती है। सुरक्षा प्रोटोकॉल को संबोधित किया जाना चाहिए और इस तरह की उच्च शिखर शक्तियों पर काम करते समय हर समय उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहना जाना चाहिए। प्रयोग करने से पहले उचित प्रलेखन से परामर्श करें। यह प्रोटोकॉल बीम पथ को डिजाइन करने, फेम्टोसेकंड दालों को चहचहाने और इमेजिंग स्थितियों को अनुकूलित करने पर केंद्रित है। इस हाइपरस्पेक्ट्रल सीआरएस माइक्रोस्कोप का एक सामान्य ऑप्टिकल लेआउट चित्रा 1 में दिखाया गया है। यहां दिखाया गया कॉन्फ़िगरेशन सीआरएस माइक्रोस्कोपी के लिए कई मौजूदा कॉन्फ़िगरेशन में से एक है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सीआरएस माइक्रोस्कोपी प्रणाली एक दोहरी आउटपुट फेम्टोसेकंड लेजर स्रोत और एक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर बनाई गई है।

  1. सुनिश्चित करें कि लेजर स्रोत 80 मेगाहर्ट्ज की पुनरावृत्ति दर के साथ दो फेम्टोसेकंड पल्स ट्रेन (120 एफएस चौड़ाई) प्रदान करता है, जिसमें स्टोक्स बीम के रूप में उपयोग किए जाने वाले 1,045 एनएम पर एक निश्चित तरंग दैर्ध्य और पंप बीम के रूप में उपयोग किए जाने वाले 680 से 1,300 एनएम तक एक ट्यून करने योग्य तरंग दैर्ध्य शामिल है। ऑप्टिकल देरी अंतर के साथ आउटपुट दालों को सिंक्रनाइज़ करें। इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म के निर्माण के लिए एक माइक्रोस्कोप फ्रेम का उपयोग करें।
  2. बीम पथ को डिजाइन करना
    1. नमूने पर लेजर शक्ति को नियंत्रित करने के लिए, प्रत्येक लेजर बीम के लिए एक आधा लहर प्लेट और ध्रुवीकरण बीम फाड़नेवाला (पीबीएस) संयोजन का उपयोग करें।
    2. स्टोक्स लेजर बीम पथ में एक ध्वनिक-ऑप्टिक मॉड्यूलेटर (एओएम) स्थापित करें। एओएम में 150 मिमी फोकल लंबाई लेंस के साथ बीम पर ध्यान केंद्रित करें और 400 मिमी फोकल लंबाई लेंस के साथ 0वें ऑर्डर आउटपुट को फिर से संकलित करें।
    3. स्टोक्स के साथ लेजर बीम आकार से मेल खाने के लिए पंप बीम का विस्तार करने के लिए एक ही लेंस जोड़ी (150 मिमी और 400 मिमी फोकल लंबाई) का उपयोग करें।
    4. बीम विचलन को ठीक करने और माइक्रोस्कोप में प्रवेश करने से पहले बीम आकार को अनुकूलित करने के लिए अलग-अलग एक आयामी अनुवाद चरणों पर पंप और स्टोक्स बीम पथ दोनों में 400 मिमी फोकल लंबाई लेंस रखें।
    5. ऑप्टिकल देरी ट्यूनिंग के लिए एक मोटरचालित अनुवाद चरण पर घुड़सवार एक समकोण प्रतिबिंबित दर्पण के साथ पंप बीम को निर्देशित करें। यदि स्टोक्स बीम को ऑप्टिकल देरी की आवश्यकता है, तो इन घटकों को इसके बीम पथ में रखें।
    6. दोनों बीमों को ~ 1,000 एनएम (पंप और स्टोक्स तरंग दैर्ध्य के बीच) पर कटऑफ तरंग दैर्ध्य के साथ एक डाइक्रोइक दर्पण पर संयुक्त करने की अनुमति दें, ताकि स्टोक्स बीम डाइक्रोइक दर्पण के माध्यम से संचारित हो, जबकि पंप बीम डाइक्रोइक दर्पण द्वारा परिलक्षित होता है। माइक्रोस्कोप को कोलीनियर संयुक्त लेजर बीम भेजें।
    7. पंप और स्टोक्स बीम चहचहाना करने के लिए, उनके बीम पथों में कांच की छड़ें रखें। विवरण के लिए चरण 1.5 देखें।
    8. उचित संरेखण और बीम आकार की पुष्टि करने के लिए, डाइक्रोइक दर्पण के बाद और माइक्रोस्कोप से पहले आईरिस डायाफ्राम का उपयोग करें। विशेष रूप से, अच्छे संरेखण और बीम ओवरलैप की पुष्टि करने के लिए डाइक्रोइक दर्पण से दूरी पर एक स्थिति में और दूसरे को स्थापित करें। संरेखण के दौरान बीम की कल्पना करने के लिए आईआर-व्यूइंग कार्ड या आईआर व्यूअर का उपयोग करें।
    9. पंप और स्टोक्स दालों के बीच ऑप्टिकल देरी को लगभग मापने के लिए एक तेज़ पीडी और एक ऑसिलोस्कोप का उपयोग करें। लेजर पल्स ट्रेन का नमूना लेकर ऑसिलोस्कोप को ट्रिगर करें।
    10. पंप बीम ब्लॉक और स्टोक्स बीम का नमूना। दालों में से एक पर ज़ूम इन करें और ऑसिलोस्कोप पर अपने अस्थायी स्थान को चिह्नित करने के लिए उस पर एक ऊर्ध्वाधर कर्सर रखें।
    11. पंप बीम को अनब्लॉक करें और स्टोक्स बीम को ब्लॉक करें। नमूना पंप दालों अस्थायी रूप से चिह्नित स्थिति के साथ संरेखित जब तक देरी चरण का अनुवाद करें।
  3. लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप
    1. एक ईमानदार माइक्रोस्कोप कॉन्फ़िगरेशन के लिए, 2 डी गैल्वो स्कैनिंग दर्पण तक पहुंचने से पहले एक उपयुक्त स्तर पर चढ़ने के लिए एक पेरिस्कोप के माध्यम से संयुक्त लेजर बीम भेजें।
    2. माइक्रोस्कोप से पहले लेजर बीम आकार को मापें, और उद्देश्य लेंस के प्रवेश पुतली के आकार से मेल खाने के लिए लेजर बीम का विस्तार करने के लिए गैल्वो दर्पण के बाद उचित लेंस जोड़ी स्थापित करें।
    3. दो लेंसों का उपयोग करके 4-एफ प्रणाली का निर्माण करें, जिसमें उद्देश्य लेंस के पीछे के एपर्चर और दो गैल्वो दर्पणों का केंद्र संयुग्मित विमान है। वैकल्पिक रूप से, लेजर स्कैनिंग के लिए दो 4-एफ लेंस सिस्टम के साथ दो अलग-अलग 1 डी गैल्वो दर्पण का उपयोग करें।
    4. कंडेनसर के बाद, सिग्नल संग्रह के लिए लेजर बीम को प्रतिबिंबित करने के लिए फ्लिप दर्पण में 2 डिज़ाइन करें। डिटेक्टरों को ट्रांसमिशन सिग्नल को पूरी तरह से इकट्ठा करने और ध्यान केंद्रित करने के लिए प्रेषित बीम पथ में 2 व्यास के साथ एक लेंस रखें।
    5. 776 एनएम पर कटऑफ वाले डाइक्रोइक दर्पण के साथ पीएमटी को सीएआरएस संकेतों को निर्देशित करें, और प्रेषित एसआरएस संकेतों को पीडी द्वारा पता लगाने की अनुमति दें अवशिष्ट उत्तेजना लेजर दालों को अस्वीकार करने के लिए पीएमटी से पहले एक बैंडपास फिल्टर (655/30 एनएम) का उपयोग करें। डिटेक्टर में प्रवेश करने से स्टोक्स बीम को अवरुद्ध करने के लिए पीडी से पहले एक शॉर्ट-पास फिल्टर (980 एनएम शॉर्ट पास) का उपयोग करें।
    6. सीएआरएस सिग्नल डिटेक्शन के लिए, पीएमटी के बाद और डेटा अधिग्रहण प्रणाली को सिग्नल भेजने से पहले एक प्रीएम्पलीफायर और करंट-वोल्टेज कनवर्टर कनेक्ट करें। सिग्नल और छवि कंट्रास्ट को अनुकूलित करने के लिए पीएमटी वोल्टेज समायोजित करें।
    7. 1-10 मेगाहर्ट्ज पर एओएम को संशोधित करने के लिए एक फ़ंक्शन जनरेटर का उपयोग करें, और लॉक-इन डिमॉड्यूलेशन के संदर्भ के समान आवृत्ति का उपयोग करें। डेटा अधिग्रहण से पहले एसआरएस सिग्नल निकालने के लिए लॉक-इन एम्पलीफायर का उपयोग करें।
  4. डेटा अधिग्रहण और प्रदर्शन
    1. टर्मिनल ब्लॉक के साथ संयोजन के रूप में डिजिटल डेटा अधिग्रहण (डीएक्यू) कार्ड का उपयोग करके डेटा अधिग्रहण करें।
    2. गैल्वो दर्पण और सिग्नल अधिग्रहण के लिए एनालॉग इनपुट को नियंत्रित करने के लिए डीएक्यू से एनालॉग आउटपुट का उपयोग करें।
    3. वास्तविक समय देखने और छवियों को सहेजने के लिए एक साथ मल्टीचैनल डिस्प्ले वाले लैबव्यू पर आधारित लैब-लिखित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें ( पूरक फ़ाइल देखें)।
  5. फेम्टोसेकंड स्रोत को चहचहाना और वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन को मापना
    नोट: वर्णक्रमीय फोकसिंग का उपयोग करके एक अच्छा वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए, ग्लास रॉड का उपयोग फेम्टोसेकंड से पिकोसेकंड तक फैलाव और चहचहाना लेजर दालों को पेश करने के लिए किया जाता है। सर्वोत्तम वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए, पंप बीम की चहचहाना दर को स्टोक्स बीम के बराबर होना चाहिए। इस लेजर प्रणाली के लिए, पंप के लिए 3.4 पीएस और स्टोक्स के लिए 1.8 पीएस के लिए ~ 120 एफएस आउटपुट लेजर दालों को चहचहाकर सबसे अच्छा वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया जा सकता है। यह चहचहाहट 150 मिमी ग्लास रॉड (एसएफ -57) संयोजन के 4 + 1 संयोजन (संयुक्त बीम में चार, केवल स्टोक्स बीम में एक) का उपयोग करके प्राप्त की जाती है, जैसा कि नीचे वर्णित है, और 15 सेमी -1 वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करना चाहिए। पल्स अवधि को ऑटोकोरेलेटर का उपयोग करके मापा जा सकता है।
    1. केवल स्टोक्स बीम पथ में एक 150 मिमी ग्लास रॉड डालें।
    2. डाइक्रोइक बीम स्प्लिटर के बाद संयुक्त पंप/स्टोक्स बीम पथ में दो 150 मिमी ग्लास रॉड डालें। चहचहाहट बढ़ाने के लिए, संयुक्त लेजर बीम को छड़ के एक छोर पर एक ढांकता हुआ दर्पण रखकर दो ग्लास रॉड को डबल-पास करने दें।
    3. वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन को मापने के लिए, दो ग्लास कवरलिप्स के बीच दबाए गए एक मानक रासायनिक (जैसे, डाइमिथाइल सल्फोक्साइड [डीएमएसओ]) नमूना तैयार करें, और अधिकतम सिग्नल प्राप्त होने तक देरी चरण को स्कैन करें।
    4. लाल शिफ्ट दिशा में ऑप्टिकल देरी 1,000 μm ले जाएँ। फिर, हाइपरस्पेक्ट्रल छवि स्टैक को इकट्ठा करने के लिए ब्लूशिफ्ट दिशा की ओर 10 μm/कदम पर 200 फ्रेम चलाएं।
    5. फ्रेम संख्याओं को तरंग संख्याओं में परिवर्तित करने के लिए, डीएमएसओ और उनके संबंधित फ्रेम नंबर40 से खींचने वाले सममित (2,913 सेमी -1) और असममित (2,994 सेमी -1) सी-एच का उपयोग करके एक रैखिक प्रतिगमन करें।
    6. वर्णक्रमीय ध्यान केंद्रित तीव्रता प्रोफ़ाइल को मापने के लिए एक्सपीएम संकेत का उपयोग करें। कंडेनसर पर डायाफ्राम को आधा बंद करें और फोकस को एक खाली कवरस्लिप पर ले जाएं। हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस के लिए चरणों की एक ही संख्या एकत्र करें। सीएआरएस गैर-अनुनादी पृष्ठभूमि को मापने के लिए, ग्लास कवरस्लिप पर ध्यान केंद्रित करें और हाइपरस्पेक्ट्रल सीएआरएस माप के लिए समान संख्या में चरण एकत्र करें।
  6. छवियों के सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) का अनुकूलन
    1. सिस्टम संरेखण के लिए एक रासायनिक नमूना तैयार करें। नमूना तैयार करने के लिए चरण 3.1 में वर्णित प्रक्रिया का पालन करें।
      नोट: डीएमएसओ एक अच्छा विकल्प है क्योंकि यह मजबूत रमन संकेतों और अच्छी तरह से अलग सी-एच सममित और असममित चोटियों के साथ एक आम प्रयोगशाला रसायन है।
    2. माइक्रोस्कोप चरण पर नमूना रखें, और उद्देश्य लेंस या कंडेनसर के लिए आवश्यक होने पर पानी या विसर्जन तेल जोड़ें। देखने के क्षेत्र में डीएमएसओ छोटी बूंद के किनारे को ठीक से स्थानांतरित करें और सर्वोत्तम फोकस के लिए उद्देश्य लेंस को समायोजित करें। कोहलर रोशनी विधि 41 का उपयोग करके कंडेनसर को केंद्रमें रखें। कंडेनसर पर डायाफ्राम को पूरी तरह से खोलें।
    3. 2,913 सेमी - 1 सीएच3 चोटी को लक्षित करने के लिए पंप बीम तरंग दैर्ध्य को 800 एनएम (1,045 एनएम स्टोक्स) तक ट्यून करें। अर्ध-तरंग प्लेट (नमूना विमान पर ~ 10 मेगावाट शक्ति) को समायोजित करके माइक्रोस्कोप से पहले पंप और स्टोक्स बीम दोनों की शक्ति ~ 30 मेगावाट सेट करें।
    4. एसआरएस के लिए, लॉक-इन एम्पलीफायर लाभ को 7 μs के समय स्थिरांक के साथ ~ 10 पर सेट करें (10 μs पिक्सेल निवास समय का उपयोग करते समय)। सुनिश्चित करें कि समय स्थिरांक पिक्सेल निवास समय से छोटा है। एसआरएस संकेतों के लिए औक्स आउटपुट के लिए डेमोड आर का उपयोग करें।
    5. सीएआरएस के लिए, पीएमटी आउटपुट को प्रीम्पलीफायर और वर्तमान-वोल्टेज कनवर्टर में भेजें। कनवर्टर से आउटपुट प्राप्त करने के लिए डीएक्यू का उपयोग करें।
    6. अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में छवि अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें। ~ 100 x 100 μm 2 के स्कैनिंग आकार के साथ200 x 200 की पिक्सेल संख्या का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि छवि में डीएमएसओ बूंद और एक खाली क्षेत्र दोनों शामिल हैं।
    7. नमूना स्कैन करें और कंप्यूटर स्क्रीन पर छवि की जाँच करें। वास्तविक समय छवियों की निगरानी करते समय स्टोक्स /पंप बीम में मोटर चालित देरी चरण को स्कैन करें। सिग्नल अधिकतम होने तक देरी पर स्कैन करें।
    8. देखने के पूरे क्षेत्र को कवर करने के लिए डीएमएसओ छोटी बूंद को स्थानांतरित करें और जांचें कि डीसी सिग्नल अधिकतम छवि में केंद्रित है या नहीं (सिग्नल पंप बीम-निर्भर है)। इमेजिंग सॉफ्टवेयर में दर्पण या वोल्टेज ऑफसेट के माध्यम से पंप बीम की स्थिति को समायोजित करें।
    9. डीसी अनुकूलन के बाद, स्टोक्स बीम दर्पण को समायोजित करें जब तक कि ~ 50% संतृप्ति प्रदर्शित करने के लिए थ्रेशोल्ड मान को समायोजित करके एसी सिग्नल को अधिकतम नहीं किया जाता है। जांचें कि क्या संतृप्ति छवि में केंद्रित है। यदि नहीं, तो केवल स्टोक्स बीम में दर्पण को ठीक करें। संरेखण की गुणवत्ता पर वास्तविक समय प्रतिक्रिया के रूप में संरेखण के दौरान संकेत की निगरानी करें।
    10. एसएनआर निर्धारित करने के लिए, डीएमएसओ छवि के एक छोटे से क्षेत्र का चयन करें और माध्य मान को मापें। शोर के लिए, छवि के खाली क्षेत्र में एक छोटे से क्षेत्र का चयन करें और औसत माध्य मूल्य और मानक विचलन दोनों का निर्धारण करें। सिग्नल माध्य मान से शोर माध्य मान को घटाएं और परिणामों को खाली क्षेत्र के मानक विचलन से विभाजित करें।
    11. यदि गणना की गई एसएनआर पर्याप्त नहीं है (आमतौर पर एसआरएस के लिए 800-1,000 और >इस पावर संयोजन के साथ 0.4 वी के पीएमटी वोल्टेज पर सीएआरएस के लिए 10,000), बीम ओवरलैप, बीम आकार और देरी चरण की स्थिति की जांच और पुन: अनुकूलन करें, एओएम को ठीक करें, और अपेक्षित एसएनआर प्राप्त होने तक फ़ंक्शन जनरेटर मॉडुलन आवृत्ति को बदलें।

2. छवि विश्लेषण और डेटा प्रोसेसिंग

  1. एसएनआर विश्लेषण
    1. इमेजजे सॉफ़्टवेयर खोलें। सहेजी गई DMSO नमूना .txt फ़ाइल आयात करने के लिए, फ़ाइल | क्लिक करें आयात | पाठ छवि | खोलें।
    2. एक बार छवि आयात हो जाने के बाद, चमक और कंट्रास्ट फ़ंक्शन (बी एंड सी) लाने के लिए सीटीआरएल + शिफ्ट + सी दबाएं। अधिकतम नमूना संकेत खोजने के लिए, बी एंड सी में ऑटो बटन दबाएं जब तक कि डीएमएसओ नमूने का एक क्षेत्र संतृप्त न हो जाए।
    3. इमेजजे इंटरफ़ेस पर अंडाकार चयन उपकरण पर क्लिक करें और संतृप्त डीएमएसओ क्षेत्र के एक छोटे से क्षेत्र को हाइलाइट करें। एक बार हाइलाइट किए जाने के बाद, चयनित क्षेत्र के माध्य और मानक विचलन को मापने के लिए एम दबाएं।
    4. पृष्ठभूमि को मापने के लिए, बी एंड सी फ़ंक्शन में सलाखों को समायोजित करें जब तक कि खाली क्षेत्र का संकेत नहीं देखा जा सकता है। अंडाकार चयन पर क्लिक करें और चरण 2.1.3 के समान आकार की पृष्ठभूमि के क्षेत्र को हाइलाइट करें। सुनिश्चित करें कि चयनित क्षेत्र में डीएमएसओ नहीं है। चयनित क्षेत्र के आँकड़े मापने के लिए M दबाएँ.
    5. चरण 1.6.10 के अनुसार एसएनआर की गणना करें।
  2. हाइपरस्पेक्ट्रल सीआरएस छवियों को संसाधित करना
    1. चरण 2.1.1 के अनुसार .txt फ़ाइल आयात करें। एक बार आयात होने के बाद, छवि | पर क्लिक करें स्टैक्स | उपकरण | स्टैक करने के लिए असेंबल... फ़ाइल को छवि स्टैक में परिवर्तित करने के लिए।
    2. असेंबल के माध्यम से स्क्रॉल करें जब तक कि पहला डीएमएसओ शिखर दिखाई न दे। डीएमएसओ पर एक क्षेत्र का चयन करें और छवि | पर क्लिक करें स्टैक | फ्रेम नंबर स्पेक्ट्रम बनाम तीव्रता को प्लॉट करने के लिए प्लॉट जेड-अक्ष प्रोफाइल। कच्चे वर्णक्रमीय डेटा को निकालने के लिए, सूची पर क्लिक करें और प्रोफ़ाइल डेटा की प्रतिलिपि बनाएँ।
    3. पुनर्प्राप्त स्पेक्ट्रम को तरंग संख्या इकाइयों में परिवर्तित करने के लिए, चरण 1.5.5 में उल्लिखित रैखिक प्रतिगमन करें।
  3. वर्णक्रमीय संकल्प को मापने के लिए फिटिंग
    नोट: लोरेंत्ज़ियन कार्यों का उपयोग एसआरएस और सीएआरएस स्पेक्ट्रा28 को फिट करने के लिए किया जाता है।
    1. फिटिंग सॉफ़्टवेयर खोलें, फिर प्रोग्राम में रैखिक प्रतिगमन डेटा को कॉपी और पेस्ट करें। एसआरएस डेटा को फिट करने के लिए, डेटा को हाइलाइट करें और फिर डेटा को स्कैटर प्लॉट के रूप में प्लॉट करें।
    2. स्कैटर प्लॉट को ऊपर खींचें। एनालिसिस | पर क्लिक करें चोटियों और बेसलाइन | एकाधिक पीक फ़िट | शिखर विश्लेषक को लाने के लिए संवाद खोलें। जब खींचा जाता है, तो जांचें कि इनपुट वर्तमान साजिश है और पीक फ़ंक्शन को लोरेंत्ज़ियन (लोरेंत्ज़) में बदल दें।
    3. फिट किए जाने वाले क्षेत्रों को उजागर करने के लिए ग्राफ पर दो डीएमएसओ चोटियों में से प्रत्येक पर डबल-क्लिक करें। इसके बाद, फिटिंग विंडो लाने के लिए ओपन एनएलफिट पर क्लिक करें। फिटिंग गुणांक का सारणीबद्ध सारांश देखने के लिए अभिसरण बटन तक फ़िट बटन पर क्लिक करें, और फिर ठीक है (Eq (3) देखें)।
      नोट: नीचे समीकरण सॉफ्टवेयर में लोरेंत्ज़ियन फ़ंक्शन प्रारूप दिखाता है। एक1/2 फिटिंग चोटियों के आयाम हैं, डब्ल्यू1/2 फिट चोटियों की चौड़ाई हैं, और एक्स01/02 मान फिट चोटियों के केंद्र हैं। स्वतंत्र चर एक्स है और आश्रित चर वाई है।
      Equation 1 (3)
    4. सीएआरएस वर्णक्रमीय फिटिंग के लिए, विश्लेषण | पर क्लिक करें फिटिंग | नॉनलाइनियर वक्र फिट | संवाद खोलें. श्रेणी का चयन करें : कारों के लिए एक नया फ़ंक्शन परिभाषित करने के लिए नया। नीचे परिभाषित दो-चोटी कारों फिटिंग फ़ंक्शन का उपयोग करें (देखें समीकरण (4)) कारों वर्णक्रमीय फिटिंग के लिए।
      Equation 1 (4)
  4. स्थानिक रिज़ॉल्यूशन का निर्धारण
    नोट: इस चरण से पहले, एक विशिष्ट आवर्धन, पिक्सेल संख्या और μm में चरण आकार पर पिक्सेल आकार के बीच रूपांतरण जानना महत्वपूर्ण है। यह एक ज्ञात व्यास के नमूने का उपयोग करके किया जा सकता है जो अपेक्षित इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन से बड़ा है, इसकी लाइन प्रोफ़ाइल को मापता है, और आधा अधिकतम (एफडब्ल्यूएचएम) मान पर पूर्ण चौड़ाई निर्धारित करने के लिए गाऊसी फ़ंक्शन फिट करता है। रिज़ॉल्यूशन लक्ष्य या समान नमूने जैसे बहुलक मोती का उपयोग किया जा सकता है।
    1. व्यास में 200 एनएम से कम कोशिकाओं या बहुलक कणों की एक छवि प्राप्त करें।
    2. छवि में सबसे छोटे कण के पार एक रेखा खींचने के लिए इमेजजे का उपयोग करें।
    3. तीव्रता प्रोफ़ाइल को प्लॉट करने के लिए के दबाएं।
    4. पॉप-अप विंडो से सूची पर क्लिक करें और सॉफ़्टवेयर को फिट करने के लिए जानकारी की प्रतिलिपि बनाएँ।
    5. फिटिंग सॉफ़्टवेयर में प्रोफ़ाइल प्लॉट करें और गाऊसी फिटिंग का उपयोग करें (विश्लेषण | पर क्लिक करें फिटिंग | नॉनलाइनियर वक्र फिट | संवाद | खोलें श्रेणी: बुनियादी कार्य; समारोह: गॉस)।
    6. फिटिंग के बाद चोटी की चौड़ाई पढ़ें। माइक्रोस्कोप के वास्तविक रिज़ॉल्यूशन को प्राप्त करने के लिए आकार रूपांतरण के लिए पिक्सेल का उपयोग करें।

3. हाइपरस्पेक्ट्रल सीआरएस इमेजिंग के लिए नमूनों की तैयारी

  1. इमेजिंग स्लाइड और रासायनिक नमूनों की तैयारी
    1. एक कवरस्लिप पर डबल-पक्षीय टेप का एक टुकड़ा रखें, और नमूना रखने के लिए एक खुला क्षेत्र बनाने के लिए रखे गए टेप के बीच से टेप के एक छोटे आयताकार आकार को काट लें।
    2. शुद्ध डीएमएसओ के पिपेट 1-2 μL और रिक्ति के केंद्र में छोटी बूंद वितरण।
    3. ध्यान से शीर्ष कवरस्लिप रखें और धीरे-धीरे कक्ष को सील करने के लिए कवरलिप्स के किनारों को दबाएं, जबकि यह सुनिश्चित करें कि डीएमएसओ नमूना टेप के किनारों से संपर्क नहीं करता है।
    4. संवेदनशीलता प्रयोगों के लिए, 50% -0% की एकाग्रता सीमा देने के लिए ड्यूटेरियम ऑक्साइड (डी2ओ) में डीएमएसओ के धारावाहिक कमजोर पड़ने को तैयार करें। प्रत्येक समाधान के 1-2 μL ले लो और ऊपर वर्णित के रूप में दबाए गए नमूने तैयार करते हैं।
  2. सेल की तैयारी
    1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ दुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) में 35 मिमी ग्लास-बॉटम डिश (या बड़ा) में कोशिकाओं को बीज दें।
    2. ~ 50% -80% संगम प्राप्त होने तक रात भर या उससे अधिक समय तक 5% सीओ2 वातावरण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेशन कक्ष में कोशिकाओं सेते हैं।
    3. लाइव कोशिकाओं को सीधे छवि दें या इमेजिंग के लिए 10% फॉर्मलिन समाधान के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।

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Representative Results

वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन की तुलना
चित्रा 2 डीएमएसओ नमूने का उपयोग करके हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस (चित्रा 2 ए) और सीएआरएस (चित्रा 2 बी) माइक्रोस्कोपी के वर्णक्रमीय संकल्प की तुलना करता है। एसआरएस स्पेक्ट्रम के लिए, स्पेक्ट्रम को फिट करने के लिए दो लोरेंत्ज़ियन फ़ंक्शंस (प्रोटोकॉल चरण 2.3 देखें) लागू किए गए थे, और 2,913 सेमी -1 चोटी का उपयोग करके 14.6 सेमी -1 का रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया गया था। सीएआरएस के लिए, गाऊसी पृष्ठभूमि के साथ एक दो-चोटी-फिटिंग फ़ंक्शन (प्रोटोकॉल चरण 2.3 देखें) का उपयोग फिटिंग के लिए किया गया था, जिसने 17.1 सेमी -1 का वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन दिया था। इन परिणामों से पता चलता है कि, एक ही माप की स्थिति में, एसआरएस में सीएआरएस की तुलना में बेहतर वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन है। सीएआरएस में कम वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन मुख्य रूप से गैर-अनुनादी पृष्ठभूमि की भागीदारी से योगदान देता है। इसके अलावा, यह पाया गया कि एसआरएस और सीएआरएस के लिए सममित (2,913 सेमी -1) और असममित (2,995 सेमी -1) शिखर अनुपात बहुत अलग थे। यह तीसरे क्रम के नॉनलाइनियर ऑप्टिकल संवेदनशीलता के साथ विभिन्न सिग्नल सहसंबंधों के कारण है, जैसा कि समीकरणों (1) और (2) में वर्णित है। सीएआरएस की द्विघात निर्भरता के साथ, दो चोटियों के बीच तीव्रता अंतर प्रवर्धित होता है। एसआरएस चोटियों की सममित रेखा आकृतियों और सीएआरएस चोटियों के असममित रेखा आकार स्पेक्ट्रम में देखे जा सकते हैं। सीएआरएस सिग्नल में विषमता मुख्य रूप से गैर-अनुनादी पृष्ठभूमि हस्तक्षेप की उपस्थिति के कारण है। सीएआरएस वर्णक्रमीय चोटियां एसआरएस चोटियों को थोड़ा लाल-स्थानांतरित (1-2 सेमी -1) दिखाई देती हैं। यह गुंजयमान चोटियों के साथ गैर-अनुनादी पृष्ठभूमि हस्तक्षेप से भी उत्पन्न होता है।

पता लगाने की संवेदनशीलता की तुलना
चित्रा 3 हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस और सीएआरएस माइक्रोस्कोपी की पहचान संवेदनशीलता की तुलना करता है। उच्च सांद्रता पर डी 2 ओ में डीएमएसओ एकाग्रता के कार्य के रूप में डीएमएसओ एसआरएस संकेतों (2,913 सेमी -1)के एसएनआर को पहले प्लॉट किया जाता है (1% -50%, चित्रा 3 ए)। परिणाम एक रैखिक संबंध दिखाते हैं, संतोषजनक समीकरण (2)। चित्रा 3 बी डीएमएसओ स्पेक्ट्रा को 0.1% और 0.01% सांद्रता पर प्लॉट करता है, जिसमें 2,913 सेमी -1 चोटी को पूर्व में हल किया जा सकता है लेकिन बाद में नहीं, यह दर्शाता है कि पता लगाने की सीमा 0.1% और 0.01% डीएमएसओ के बीच है। रिक्त मानदंडों की सीमा का उपयोग करते हुए, हमने अनुमान लगाया कि एसआरएस डिटेक्शन सीमा 0.021% डीएमएसओ है। चित्रा 3 सी डीएमएसओ एकाग्रता (1% -50%) के कार्य के रूप में सीएआरएस एसएनआर को प्लॉट करता है, जो समीकरण (1) के साथ समझौते में द्विघात निर्भरता दिखाता है। चरण-पुनर्प्राप्त सीएआरएस स्पेक्ट्रा 0.1% और 0.01% डीएमएसओ के लिए चित्रा 3 डी में दिखाया गया है। इन स्पेक्ट्रा को प्राप्त करने के लिए, क्रैमर्स-क्रोनिग संबंधों के आधार पर एक वर्णक्रमीय चरण-पुनर्प्राप्ति विधि का उपयोग किया गया था और अतिरिक्त पृष्ठभूमि हटाने का प्रदर्शन किया गया था। एसआरएस स्पेक्ट्रा के समान, डीएमएसओ 2,913 सेमी -1 चोटी को 0.1% डीएमएसओ के लिए स्पष्ट रूप से हल किया जा सकता है, लेकिन 0.01% नहीं, इन दो सांद्रता के बीच एक पहचान सीमा का संकेत देता है। रिक्त मानदंडों की सीमा का उपयोग करते हुए, हमने अनुमान लगाया कि एसआरएस डिटेक्शन सीमा 0.015% डीएमएसओ है। 0.02% डीएमएसओ 2.8 एमएम से मेल खाती है। इसलिए, यहां उपयोग किए जाने वाले हाइपरस्पेक्ट्रल सीआरएस माइक्रोस्कोप की पहचान सीमा ~ 2.1-2.8 एमएम डीएमएसओ है।

स्थानिक रिज़ॉल्यूशन की तुलना
चित्रा 4 एसआरएस (चित्रा 4 ए) और सीएआरएस (चित्रा 4 बी) छवियों में पता चला एक छोटी सेलुलर सुविधा के संकल्प की तुलना करता है। रिज़ॉल्यूशन तुलना के लिए एफडब्ल्यूएचएम मान निर्धारित करने के लिए एक ही लाइन से तीव्रता प्रोफाइल प्रदर्शित और गाऊसी फ़ंक्शन का उपयोग करके फिट होते हैं। एसआरएस सिग्नल ने 398.6 एनएम (चित्रा 4 सी) का रिज़ॉल्यूशन दिया, जबकि सीएआरएस सिग्नल ने 330.3 एनएम (चित्रा 4 डी) का रिज़ॉल्यूशन दिया। कार्स का रिज़ॉल्यूशन एसआरएस की तुलना में ~ 1.2x बेहतर था। रिज़ॉल्यूशन अंतर का कारण समीकरण (1) और (2) में भी निहित है। पंप और स्टोक्स बीम दोनों में फोकस पर एक गाऊसी बिंदु प्रसार समारोह है। सीएआरएस का संकेत तब तीन गाऊसी कार्यों के गुणन के लिए आनुपातिक होता है, जो मोटे तौर पर √3 के कारक द्वारा चौड़ाई को कम करता है। इसी तरह, एसआरएस के लिए, चौड़ाई √2 के कारक से कम हो जाती है। इसलिए, सीएआरएस का रिज़ॉल्यूशन एसआरएस की तुलना में √3/√2 = 1.2 गुना बेहतर था।

कोशिकाओं की छवियों की तुलना
चित्रा 5 विभिन्न ऑप्टिकल देरी पदों पर एमआईए पाका -2 कोशिकाओं से एसआरएस और सीएआरएस छवियों की तुलना करता है। चित्रा 5 ए ऑप्टिकल देरी पर एसआरएस छवियों को दिखाता है जो सबसे मजबूत संकेत देता है। इस छवि में, लिपिड बूंदों (एलडी), एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर), और नाभिक (एनयू) का पता लगाया जा सकता है, जिसमें एलडी में उज्ज्वल बिंदुओं के रूप में दिखाए गए सबसे मजबूत संकेत होते हैं। चित्रा 5 बी एक ही ऑप्टिकल देरी पर सीएआरएस चैनल छवि दिखाता है, जिसमें एलडी के लिए बहुत कम विरोधाभास होते हैं। इस विपरीत अंतर के प्रमुख कारण गैर-अनुनादी पृष्ठभूमि की उपस्थिति और सीएआरएस स्पेक्ट्रा में एक ही रमन चोटी की लाल-शिफ्ट हैं। इस ऑप्टिकल देरी पर, उत्पन्न सिग्नल का पानी की गैर-अनुनादी पृष्ठभूमि से एक बड़ा योगदान होता है। सीएआरएस में लिपिड कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए, ऑप्टिकल देरी को लाल-स्थानांतरित मूल्य पर ट्यून किया गया था। लाल शिफ्ट ने एसआरएस (चित्रा 5 सी) और सीएआरएस (चित्रा 5 डी) दोनों के लिए 2,850 सेमी -1 में अधिक ऊर्जा केंद्रित करके लिपिड विरोधाभासों में सुधार किया, हालांकि समग्र सिग्नल स्तर कम हो गया था। सीएआरएस के लिए, एसआरएस के रूप में एलडी का एक समान विपरीत वर्णक्रमीय फोकसिंग (चित्रा 5 डी) में ~ 98 सेमी -1 लाल-शिफ्ट द्वारा प्राप्त किया गया था, हालांकि एसआरएस छवि की तुलना में अधिक पृष्ठभूमि अभी भी देखी गई थी। इस ऑप्टिकल देरी पर, एसआरएस छवि बहुत कम प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड सामग्री दिखाती है लेकिन एलडी, ईआर और सेल झिल्ली (चित्रा 5 सी) में मजबूत लिपिड सामग्री दिखाती है।

सीएआरएस एक पैरामीट्रिक प्रक्रिया है जबकि एसआरएस नॉनपैरामेट्रिक है। इस तरह का अंतर दो तौर-तरीकों में विपरीत मतभेदों में भी योगदान देता है। पैरामीट्रिक कार्स सिग्नल लेजर फोकस के करीब विभिन्न परतों से सीएआरएस संकेतों के हस्तक्षेप से निर्धारित होते हैं, जो चित्रा 5 बी और चित्रा 5 डी (चित्रा 4 बी में भी) में तीर द्वारा इंगित नकारात्मक विरोधाभास दिखा सकते हैं। एसआरएस छवियों में इस तरह के सिग्नल-हस्तक्षेप-प्रेरित नकारात्मक विरोधाभास अनुपस्थित हैं। सीएआरएस में नकारात्मक विपरीत ब्याज के लक्ष्य की अक्षीय स्थिति के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है।

एसआरएस संकेतों का आणविक एकाग्रता के साथ एक रैखिक संबंध है, जबकि सीएआरएस सिग्नल निकट-द्विघात एकाग्रता-निर्भरता को संतुष्ट करते हैं। इसलिए, सीएच2-समृद्ध एलडी एसआरएस छवि (चित्रा 5 ई, एफ) की तुलना में सीएआरएस छवि में ईआर और कोशिका झिल्ली की तुलना में बहुत मजबूत संकेत दिखाते हैं। एसआरएस स्पेक्ट्रा को हाइपरस्पेक्ट्रल छवियों से निकाला जा सकता है। चित्रा 5 जी एलडी, ईआर, साइटोसोल (सीवाई), और एनयू से विशिष्ट एसआरएस स्पेक्ट्रा दिखाता है। तीव्रता और वर्णक्रमीय आकार दोनों विभिन्न सेलुलर डिब्बों के लिए अलग-अलग हैं। एलडी अन्य ऑर्गेनेल की तुलना में 2,850 सेमी -1 पर बहुत मजबूत संकेत दिखाता है। सीएआरएस के लिए, समान स्पेक्ट्रा, हालांकि आकार में अलग-अलग, प्राप्त किया जा सकता है। कच्चे कार्स स्पेक्ट्रा संबंधित एसआरएस स्पेक्ट्रा की तुलना में एक छोटा लाल-शिफ्ट दिखाते हैं। वर्णक्रमीय चरण-पुनर्प्राप्ति का उपयोग सीएआरएस स्पेक्ट्रा का उपयोग करके रमन प्रतिक्रियाओं को निकालने के लिए आगे इस्तेमाल किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: हाइपरस्पेक्ट्रल सीएआरएस /एसआरएस माइक्रोस्कोप का एक योजनाबद्ध। संक्षिप्त नाम: सीएआरएस = सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन बिखरने; एसआरएस = उत्तेजित रमन बिखरने; पीबीएस = ध्रुवीकरण बीम फाड़नेवाला; पीडी = फोटोडायोड; पीएमटी = फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब; एओएम = ध्वनिक-ऑप्टिक मॉड्यूलेटर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: डीएमएसओ स्पेक्ट्रा ( ए ) एसआरएस और (बी) डीएमएसओ के सीएआरएस स्पेक्ट्रा। डॉट्स प्रयोगात्मक डेटा हैं; घटता वर्णक्रमीय फिटिंग परिणाम हैं। संक्षिप्त नाम: सीएआरएस = सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन बिखरने; एसआरएस = उत्तेजित रमन बिखरने; डीएमएसओ = डाइमिथाइल सल्फोक्साइड; डब्ल्यू = वर्णक्रमीय संकल्प। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सिग्नल-टू-शोर अनुपात और डीएमएसओ का स्पेक्ट्रा (ए) एसआरएस द्वारामापा गया डी2 ओ में एकाग्रता के एक समारोह के रूप में 2,913 सेमी -1 पर डीएमएसओ सममित शिखर का सिग्नल-टू-शोर अनुपात। डॉट्स प्रयोगात्मक डेटा हैं; लाइन रैखिक फिटिंग परिणाम है। (बी) डी 2 ओ में 0.1% और 0.01% डीएमएसओ का एसआरएस स्पेक्ट्रा (सी)2,913 सेमी -1 पर डीएमएसओ सममित शिखर का सिग्नल-टू-शोर अनुपात कारों द्वारा मापा गया डी2ओ में एकाग्रता के एक समारोह के रूप में। डॉट्स प्रयोगात्मक डेटा हैं; वक्र दूसरी डिग्री बहुपद फिटिंग परिणाम है। (डी) डी 2ओ संक्षिप्त नामों में 0.1% और 0.01% डीएमएसओ का सीएआरएस स्पेक्ट्रा: सीएआरएस = सुसंगत एंटी-स्टोक्स रमन बिखरने; एसआरएस = उत्तेजित रमन बिखरने; डीएमएसओ = डाइमिथाइल सल्फोक्साइड; एसएनआर = सिग्नल-टू-शोर अनुपात; डी2हे = ड्यूटेरियम ऑक्साइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एसआरएस और सीएआरएस छवियों और एक एमआईए पाका -2 सेल की तीव्रता प्रोफाइल ( ए) एक एमआईए पाका -2 सेल की एक एसआरएस छवि। (बी) पैनल ए के रूप में एक ही क्षेत्र के दृश्य पर एक एमआईए पाका -2 सेल की एक सीएआरएस छवि। (सी) पैनल ए में पीली रेखा के साथ एसआरएस की तीव्रता प्रोफ़ाइल। (डी) पैनल बी में पीली रेखा के साथ कारों की तीव्रता प्रोफ़ाइल। डॉट्स प्रयोगात्मक डेटा हैं; घटता गाऊसी फ़ंक्शन फिटिंग परिणाम हैं। स्केल सलाखों = 5 μm. संक्षिप्त नाम: सीएआरएस = सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन बिखरने; एसआरएस = उत्तेजित रमन बिखरने; डब्ल्यू = रिज़ॉल्यूशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एमआईए पाका -2 कोशिकाओं की छवियां और तीव्रता प्रोफ़ाइल ( ए ) एसआरएस तीव्रता के लिए अनुकूलित समय देरी पर एमआईए पाका -2 कोशिकाओं की एक एसआरएस छवि। (बी) पैनल ए के रूप में एक ही देरी पर एक सीएआरएस छवि। (सी) पैनल ए के रूप में 98 सेमी -1 लाल-स्थानांतरित देरी पर एक एसआरएस छवि। (डी) पैनल सी के रूप में एक ही ऑप्टिकल देरी पर एक CARS छवि। (ई, एफ) एसआरएस और सीएआरएस तीव्रता प्रोफाइल पैनल ए और डी में बिंदीदार लाइनों के साथ प्लॉट किए गए हैं। (जी) लिपिड बूंदों, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम, साइटोसोल और नाभिक से विशिष्ट एसआरएस स्पेक्ट्रा। (एच) चार सेलुलर रचनाओं के विशिष्ट सीएआरएस स्पेक्ट्रा। हरे और लाल बिंदीदार लाइनें क्रमशः पैनल ए / बी और सी / डी के लिए देरी की स्थिति हैं। स्केल सलाखों = 10 μm. संक्षिप्त नाम: सीएआरएस = सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन बिखरने; एसआरएस = उत्तेजित रमन बिखरने; एलडी = लिपिड बूंदें; ईआर = एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम; सीवाई = साइटोसोल; एनयू = नाभिक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल: लैबव्यू पर आधारित लैब-लिखित सॉफ़्टवेयर जिसमें वास्तविक समय देखने और छवियों को सहेजने के लिए एक साथ मल्टीचैनल डिस्प्ले होता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक मल्टीमॉडल सीआरएस माइक्रोस्कोप के निर्माण और सीएआरएस और एसआरएस इमेजिंग के बीच सीधी तुलना का वर्णन करता है। माइक्रोस्कोप निर्माण के लिए, महत्वपूर्ण कदम स्थानिक और लौकिक बीम अतिव्यापी और बीम आकार अनुकूलन हैं। एसएनआर को अनुकूलित करने और रमन शिफ्ट को कैलिब्रेट करने के लिए जैविक इमेजिंग से पहले डीएमएसओ जैसे मानक नमूने का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। सीएआरएस और एसआरएस छवियों के बीच सीधी तुलना से पता चलता है कि सीएआरएस में बेहतर स्थानिक रिज़ॉल्यूशन है, जबकि एसआरएस बेहतर वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन और कम जटिल रासायनिक विरोधाभास देता है। सीएआरएस और एसआरएस दोनों में समान पहचान सीमाएं हैं।

सीएआरएस और एसआरएस इमेजिंग उत्तेजना के लिए उच्च ऊर्जा पल्स लेजर का उपयोग करते हैं। यह प्लेटफ़ॉर्म को अन्य नॉनलाइनियर ऑप्टिकल इमेजिंग तौर-तरीकों जैसे मल्टीफोटॉन उत्तेजना प्रतिदीप्ति, हार्मोनिक पीढ़ी और अतिरिक्त रासायनिक विरोधाभासों28,39 के लिए क्षणिक अवशोषण को एकीकृत करने की अनुमति देता है।

उच्च रासायनिक चयनात्मकता के साथ लिपिड संरचना का अध्ययन करने के लिए सीएआरएस और एसआरएस का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। हालांकि, प्रौद्योगिकियां लिपिड की मात्रा निर्धारित करने तक सीमित नहीं हैं। एसआरएस को दवा वितरण42, प्रोटीन संश्लेषण43 और डीएनए 44 को मैप करने के लिए लागू किया गयाहै। सीएआरएस और एसआरएस को45,46,47,48 टैबलेट में इमेज फार्मास्युटिकल सामग्री और एक्सिपिएंट्स पर भी लागू किया गया है। हाइपरस्पेक्ट्रल सीएआरएस और एसआरएस ने कैंसर निदान49, हृदय रोग मूल्यांकन50 और तंत्रिका इमेजिंग51 में अनुप्रयोग पाए हैं। उन्हें कोविड-19 अध्ययन52 के लिए भी आवेदन किया जा सकता है। ब्रॉडबैंड सीएआरएस, जो वर्णक्रमीय खिड़कियों को 3,000 सेमी -1 के रूप में व्यापक रूप से कवर कर सकता है, जैविक नमूनों में समृद्ध रासायनिक संरचनाओं को स्पष्ट कर सकताहै 53. हालांकि, सीसीडी की धीमी रीडआउट दर के कारण, पिक्सेल निवास समय मिलीसेकंड के स्तर पर है, एसआरएस माइक्रोस्कोपी34 के लिए माइक्रोसेकंड पिक्सेल निवास समय की तुलना में बहुत धीमा है। हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस माइक्रोस्कोपी में वर्तमान में 200-300 सेमी -1 की एक विशिष्ट बैंडविड्थ है, जो लेजर बैंडविड्थ और लॉक-इन-इंटीग्रेटेड सरणी डिटेक्टरों34 की कमी से सीमित है। फूरियर ट्रांसफॉर्म एसआरएस माइक्रोस्कोपी संभावित रूप से एसआरएस वर्णक्रमीय कवरेज35 को व्यापक बनाने का एक वैकल्पिक तरीका है।

यद्यपि सीएआरएस और एसआरएस लेबलिंग की आवश्यकता के बिना समृद्ध रासायनिक जानकारी प्रदान करते हैं, रासायनिक चयनात्मकता रासायनिक बांड में निहित है, जिससे विशिष्ट प्रोटीन को अलग करना मुश्किल हो जाता है। रमन टैग ने सीएआरएस और एसआरएस54,55 की रासायनिक चयनात्मकता को बढ़ाने की क्षमता दिखाई है। हालांकि, सुसंगत रमन इमेजिंग में अभी भी प्रतिदीप्ति का पता लगाने की तुलना में बहुत कम संवेदनशीलता है। सिग्नल स्तर56 में सुधार करने के लिए सहज रमन बिखरने स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए सतह वृद्धि का उपयोग किया गया था। यह सिग्नल प्रवर्धन57,58,59 के लिए सीएआरएस और एसआरएस पर भी लागू किया गया था। यद्यपि वृद्धि कारक सहज रमन बिखरने के रूप में उच्च नहीं है, सतह-संवर्धित सीएआरएस और एसआरएस माइक्रोस्कोपी अभी भी एकल अणुओं 59,60 का पता लगाने की क्षमता दिखाते हैं। फिर भी, धातु के कणों या सतहों का उपयोग लेबल मुक्त दृष्टिकोण के लाभ से वंचित करता है। धातु की सतहों का उपयोग किए बिना सुसंगत रमन माइक्रोस्कोपी की संवेदनशीलता में सुधार जैविक विज्ञान में प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग का बहुत विस्तार करेगा।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस शोध को पर्ड्यू यूनिवर्सिटी डिपार्टमेंट ऑफ केमिस्ट्री स्टार्टअप फंड द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D galvo scanner set Thorlabs GVS002
Acousto-optic modulator Isomet M1205-P80L-0.5
AOM driver Isomet 532B-2
Data acquisition card National Instruments PCle 6363 Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage Zaber X-LSM050A
Deuterium oxide Millipore Sigma 151882-100G
Dichroic mirror for beam combination Thorlabs DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation Semrock FF776-Di01-25x36
DMSO MiliporeSigma 200-664-3
MIA PaCa 2 Cells ATCC CRL-1420
Femtosecond laser system Spectral Physics InSightX3+
Filter for CARS Chroma AT655/30m
Filter for SRS Chroma ET980sp
Function generator Rigol DG1022Z
Glass rods Lattice Electro Optics SF-57
Half-wave plate Newport 10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020 National Instruments This is the image acquisition software
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI
Microscope housing Olympus BX51W1
Objective lens Olympus UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b OriginLab Corporation This is the spectral fitting software
Oscilloscope Tektronix TBS2204B
Photodiode Hamamatsu S3994-01
PMT detector Hamamatsu H7422P-40
PMT voltage amplifier Advanced Research Instrument Corp. PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube Thorlabs PBS255
Terminal block National Instruments BNC-2110

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References

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रसायन विज्ञान अंक 182
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Clark, M. G., Brasseale III, K. A.,… More

Clark, M. G., Brasseale III, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging. J. Vis. Exp. (182), e63677, doi:10.3791/63677 (2022).

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