Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Direkt jämförelse av hyperspektral stimulerad Raman-spridning och koherent Anti-Stokes Raman Scattering-mikroskopi för kemisk avbildning

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63677
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Purdue University

Summary

Detta papper jämför direkt upplösningen, känsligheten och bildkontrasterna för stimulerad Raman-spridning (SRS) och koherent anti-Stokes Raman-spridning (CARS) integrerad i samma mikroskopplattform. Resultaten visar att CARS har en bättre rumslig upplösning, SRS ger bättre kontraster och spektral upplösning, och båda metoderna har liknande känslighet.

Abstract

Stimulerad Raman-spridning (SRS) och koherent anti-Stokes Raman-spridning (CARS) mikroskopi är de mest använda sammanhängande Raman-spridningsavbildningsteknikerna. Hyperspektral SRS- och CARS-avbildning erbjuder Raman-spektral information vid varje pixel, vilket möjliggör bättre separation av olika kemiska sammansättningar. Även om båda teknikerna kräver två excitationslasrar, är deras signaldetekteringsscheman och spektrala egenskaper ganska olika. Målet med detta protokoll är att utföra både hyperspektral SRS- och CARS-avbildning på en enda plattform och jämföra de två mikroskopiteknikerna för avbildning av olika biologiska prover. Spektralfokuseringsmetoden används för att förvärva spektral information med hjälp av femtosekundlasrar. Genom att använda kemiska standardprover jämförs känsligheten, den rumsliga upplösningen och spektralupplösningen hos SRS och CARS under samma excitationsförhållanden (dvs. effekt vid provet, pixel uppehållstid, objektivlins, pulsenergi). Bildkontrasterna mellan CARS och SRS för biologiska prover ställs mot varandra och jämförs. Den direkta jämförelsen av CARS- och SRS-prestanda skulle möjliggöra optimalt val av modalitet för kemisk avbildning.

Introduction

Raman-spridningsfenomenet observerades först 1928 av C. V. Raman1. När en infallande foton interagerar med ett prov kan en oelastisk spridningshändelse spontant inträffa, där fotonens energiförändring matchar en vibrationsövergång av de analyserade kemiska arterna. Denna process kräver inte användning av en kemisk tagg, vilket gör den till ett mångsidigt, etikettfritt verktyg för kemisk analys samtidigt som provstörningar minimeras. Trots dess fördelar lider spontan Raman-spridning av ett lågt spridningstvärsnitt (vanligtvis 1011 lägre än det infraröda [IR] absorptionstvärsnittet), vilket kräver långa förvärvstider för analys2. Således är strävan efter att öka känsligheten hos Raman-spridningsprocessen avgörande för att driva Raman-teknik för realtidsavbildning.

Ett effektivt sätt att kraftigt förbättra känsligheten för Raman-spridning är genom koherenta Raman-spridningsprocesser (CRS), för vilka två laserpulser vanligtvis används för att excitera molekylära vibrationsövergångar 3,4. När fotonenergiskillnaden mellan de två lasrarna matchar vibrationslägena för provmolekyler genereras starka Raman-signaler. De två vanligaste CRS-processerna för avbildning är koherent anti-Stokes Raman-spridning (CARS) och stimulerad Raman-spridning (SRS)5. Under de senaste två decennierna har den tekniska utvecklingen avancerat CARS- och SRS-mikroskopitekniker för att bli kraftfulla verktyg för etikettfri kvantifiering och belysning av kemiska förändringar i biologiska prover.

Kemisk avbildning med CARS-mikroskopi kan dateras till 1982 då laserskanning först tillämpades för att få CARS-bilder, demonstrerad av Duncan et al6. Moderniseringen av CARS-mikroskopi påskyndades kraftigt efter de breda tillämpningarna av laserscanning av multifotonfluorescensmikroskopi7. Tidigt arbete från Xie-gruppen med laser med hög repetitionshastighet har övergått cars till att vara en höghastighets, etikettfri, kemisk bildplattform för karakterisering av molekyler i biologiska prover 8,9,10. Ett av de största problemen för CARS-avbildning är närvaron av en icke-resonant bakgrund, vilket minskar bildkontrasten och snedvrider Raman-spektrumet. Många ansträngningar har gjorts för att antingen minska den icke-resonanta bakgrunden 11,12,13,14,15 eller för att extrahera resonanta Raman-signaler från CARS-spektra 16,17. Ett annat framsteg som har avancerat fältet kraftigt är hyperspektral CARS-avbildning, vilket möjliggör spektral kartläggning vid varje bildpixel med förbättrad kemisk selektivitet 18,19,20,21.

Stimulerad Ramanspridning (SRS) är en yngre bildteknik än CARS, även om den upptäcktes tidigare22. År 2007 rapporterades SRS-mikroskopi med hjälp av en laserkälla med låg repetitionshastighet23. Snart demonstrerade flera grupper höghastighets SRS-avbildning med hjälp av laser med hög repetitionshastighet 24,25,26. En av de stora fördelarna med SRS-mikroskopi jämfört med CARS är frånvaron av den icke-resonanta bakgrunden27, även om andra bakgrunder som korsfasmodulering (XPM), övergående absorption (TA), tvåfotonabsorption (TPA) och fototermisk (PT) effekt kan förekomma med SRS28. Dessutom har SRS-signalen och provkoncentrationen linjära relationer, till skillnad från CARS, som har ett kvadratiskt signalkoncentrationsberoende29. Detta förenklar kemisk kvantifiering och spektral oblandning. Mångfärgad och hyperspektral SRS har utvecklats i olika former 30,31,32,33,34,35,36, med spektralfokusering som en av de mest populära metoderna för kemisk avbildning 37,38.

Både CARS och SRS kräver att pumpen fokuseras och Stokes laserstrålar på provet för att matcha molekylernas vibrationsövergång för signalexcitation. CARS och SRS mikroskop har också mycket gemensamt. Fysiken som ligger till grund för dessa två processer och signaldetekteringar som är involverade i dessa mikroskopitekniker har dock skillnader 3,39. CARS är en parametrisk process som inte har nettofoton-molekylenergikoppling3. SRS är dock en icke-parametrisk process och bidrar till energiöverföring mellan fotoner och molekylära system27. I CARS genereras en ny signal vid anti-Stokes-frekvens, medan SRS manifesteras som energiöverföringen mellan pumpen och Stokes laserstrålar.

CARS-signal uppfyller Eq (1)28.

Equation 1 (1)

Under tiden kan SRS-signal skrivas som Eq (2)28.

Equation 1(2)

Här är Ip, Is, ICARS och ΔISRS intensiteterna för pumpstrålen, Stokes-strålen, CARS-signalen respektive SRS-signalen. χ(3) är provets tredje ordningens olinjära optiska känslighet och är ett komplext värde som består av reella och imaginära delar.

Dessa ekvationer uttrycker spektralprofilerna och signalkoncentrationsberoendet hos CARS och SRS. Skillnader i fysik resulterar i olika detektionsscheman för dessa två mikroskopitekniker. Signaldetektering i CARS involverar vanligtvis spektral separation av nygenererade fotoner och detektion med hjälp av ett fotomultiplikatorrör (PMT) eller laddningskopplad enhet (CCD); för SRS mäts energiutbytet mellan pumpen och Stokes-strålar vanligtvis genom höghastighetsintensitetsmodulering med hjälp av en optisk modulator och demodulering med hjälp av en fotodiod (PD) ihopkopplad med en inlåsningsförstärkare.

Även om många tekniska utvecklingar och tillämpningar har publicerats under de senaste åren inom både CARS- och SRS-områden, har inga systematiska jämförelser av de två CRS-teknikerna utförts på samma plattform, särskilt för hyperspektral CARS- och SRS-mikroskopi. Direkta jämförelser i känslighet, rumslig upplösning, spektral upplösning och kemisk separationskapacitet skulle göra det möjligt för biologer att välja den bästa modaliteten för kemisk kvantifiering. I detta protokoll tillhandahålls detaljerade steg för att konstruera en multimodal bildplattform med både hyperspektrala CARS- och SRS-modaliteter baserade på ett femtosekundlasersystem och spektralfokusering. De två teknikerna har jämförts i framåtriktningen för spektral upplösning, detektionskänslighet, rumslig upplösning och avbildningskontraster av celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Instrumentell inställning för hyperspektral CRS-avbildning

OBS: Genereringen av CRS-signal kräver användning av högeffektslasrar (dvs. klass 3B eller klass 4). Säkerhetsprotokoll måste åtgärdas och korrekt personlig skyddsutrustning (PPE) måste alltid bäras när du arbetar med så höga toppkrafter. Konsultera korrekt dokumentation innan du experimenterar. Detta protokoll fokuserar på att designa strålvägen, kvittra femtosekundpulserna och optimera bildförhållandena. En allmän optisk layout av detta hyperspektrala CRS-mikroskop visas i figur 1. Konfigurationen som visas här är en av många befintliga konfigurationer för CRS-mikroskopi. CRS-mikroskopisystemet som används i detta protokoll är byggt på en femtosekundlaserkälla med dubbla utgångar och ett laserscanningsmikroskop.

  1. Se till att laserkällan tillhandahåller två femtosekundpulståg (120 fs bredd) med en repetitionshastighet på 80 MHz, inklusive en fast våglängd vid 1 045 nm som används som Stokes-strålen och en avstämbar våglängd från 680 till 1 300 nm som används som pumpstråle. Synkronisera utgångspulserna med en optisk fördröjningsskillnad. Använd en mikroskopram för att konstruera bildplattformen.
  2. Utforma strålbanan
    1. För att styra lasereffekten vid provet, använd en kombination av halvvågsplatta och polarisationsstråledelare (PBS) för varje laserstråle.
    2. Installera en akusto-optisk modulator (AOM) i Stokes laserstråleväg. Fokusera strålen med en 150 mm brännviddslins i AOM och kom ihåg 0: e ordningens utgång med en 400 mm brännviddslins.
    3. Använd samma linspar (brännvidderna 150 mm och 400 mm) för att expandera pumpstrålen så att den matchar laserstrålens storlek med Stokes.
    4. Placera 400 mm brännviddslinser i både pumpens och Stokes strålbanor på separata endimensionella översättningssteg för att finjustera stråldivergensen och optimera strålstorleken innan du går in i mikroskopet.
    5. Rikta pumpstrålen med en rätvinklig reflekterande spegel monterad på ett motoriserat översättningssteg för optisk fördröjningsinställning. Om Stokes-strålen behöver optisk fördröjning, placera dessa komponenter istället i sin strålväg.
    6. Låt båda strålarna kombineras vid en dikroisk spegel med en cutoff-våglängd vid ~ 1 000 nm (mellan pumpen och Stokes våglängder), så att Stokes-strålen sänder genom den dikroiska spegeln medan pumpstrålen reflekteras av den dikroiska spegeln. Skicka de koliljärt kombinerade laserstrålarna till mikroskopet.
    7. För att kvittra pumpen och Stokes-balkar, placera glasstavar i sina strålvägar. Se steg 1.5 för mer information.
    8. För att bekräfta korrekt inriktning och strålstorlek, använd irismembran efter den dikroiska spegeln och före mikroskopet. Specifikt installera en i en position nära och den andra på avstånd från den dikroiska spegeln för att bekräfta god inriktning och strålöverlappning. Använd ett IR-visningskort eller IR-visare för att visualisera strålen under justeringen.
    9. Använd en snabb PD och ett oscilloskop för att ungefär mäta den optiska fördröjningen mellan pumpen och Stokes pulser. Trigga oscilloskopet genom att ta prov på laserpulståget.
    10. Blockera pumpstrålen och prova Stokes-strålen. Zooma in på en av pulserna och placera en vertikal markör på den för att markera dess tidsmässiga plats på oscilloskopet.
    11. Avblockera pumpbalken och blockera Stokes-balken. Översätt fördröjningssteget tills provpumpens pulser är tidsmässigt i linje med det markerade läget.
  3. Laserscanningsmikroskopet
    1. För en upprätt mikroskopkonfiguration, skicka de kombinerade laserstrålarna genom ett periskop för att klättra till en lämplig nivå innan du når 2D galvo-skanningsspeglarna.
    2. Mät laserstrålens storlek före mikroskopet och ställ in rätt linspar efter galvospeglarna för att expandera laserstrålen så att den bäst matchar storleken på mållinsens ingångspupill.
    3. Konstruera ett 4-f-system med de två linserna, med mållinsens bakre bländare och mitten av de två galvospeglarna som konjugatplan. Alternativt kan du använda två separata 1D galvo-speglar med två 4-f-linssystem för laserskanning.
    4. Efter kondensorn, designa en 2-tums vändspegel för att reflektera laserstrålarna för signaluppsamling. Placera en lins med en diameter på 2 i den överförda strålbanan för att helt samla in och fokusera överföringssignaler till detektorerna.
    5. Rikta CARS-signalerna till PMT med en dikroisk spegel med en cutoff vid 776 nm och låt de överförda SRS-signalerna detekteras av PD. Använd ett bandpassfilter (655/30 nm) före PMT för att avvisa kvarvarande excitationslaserpulser. Använd ett kortpassfilter (980 nm kortpass) före PD för att blockera Stokes-strålen från att komma in i detektorn.
    6. För CARS-signaldetektering, anslut en förförstärkare och en strömspänningsomvandlare efter PMT och innan du skickar signalen till datainsamlingssystemet. Justera PMT-spänningen för att optimera signal- och bildkontrasten.
    7. Använd en funktionsgenerator för att modulera AOM vid 1–10 MHz och använd samma frekvens som referensen för inlåsningsdemodulering. Använd en inlåsningsförstärkare för att extrahera SRS-signaler före datainsamling.
  4. Datainsamling och visning
    1. Utför datainsamling med hjälp av ett digitalt datainsamlingskort (DAQ) i kombination med ett terminalblock.
    2. Använd de analoga utgångarna från DAQ för att styra galvospeglarna och de analoga ingångarna för signalförvärv.
    3. Använd Lab-skriven programvara baserad på LabVIEW som har en samtidig flerkanalig visning för visning och sparande av bilder i realtid (se Tilläggsfil).
  5. Kvittra femtosekundkällan och mäta spektralupplösningen
    OBS: För att uppnå en bra spektral upplösning med spektralfokusering används glasstavar för att införa dispersioner och kvittra laserpulser från femtosekund till picosekund. För att uppnå den bästa spektralupplösningen måste pumpstrålens kvitterhastighet vara lika med Stokes-strålens. För detta lasersystem kan den bästa spektralupplösningen uppnås genom att kvittra de ~ 120 fs utgående laserpulserna till 3.4 ps för pumpen och 1.8 ps för Stokes. Denna kvittering uppnås genom att använda en 4+1-kombination (fyra i den kombinerade strålen, en endast i Stokes-strålen) av 150 mm glasstav (SF-57) kombination, som beskrivs nedan, och bör uppnå en spektral upplösning på 15 cm-1 . Pulsvaraktigheten kan mätas med hjälp av en autokorrelator.
    1. Sätt in en 150 mm glasstav i endast Stokes balkbana.
    2. Sätt in två 150 mm glasstavar i den kombinerade pump-/Stokes-strålbanan efter den dikroiska stråldelaren. För att öka kvittret, låt de kombinerade laserstrålarna dubbelpassa de två glasstavarna genom att placera en dielektrisk spegel i ena änden av stavarna.
    3. För att mäta spektralupplösningen, förbered ett standardkemiskt (t.ex. dimetylsulfoxid [DMSO]) prov pressat mellan två glasöverdrag och skanna fördröjningssteget tills maximal signal uppnås.
    4. Flytta den optiska fördröjningen 1 000 μm i rödförskjutningsriktningen. Kör sedan 200 bilder vid 10 μm / steg mot blåförskjutningsriktningen för att samla in den hyperspektrala bildstacken.
    5. För att konvertera bildnumren till vågnummer, utför en linjär regression med hjälp av symmetriska (2 913 cm-1) och asymmetriska (2 994 cm-1) C-H som sträcker sig från DMSO och deras motsvarande bildnummer40.
    6. Använd XPM-signalen för att mäta den spektrala fokuseringsintensitetsprofilen. Halvstäng membranet på kondensorn och flytta fokus till ett tomt täckglas. Samla in samma antal steg som för hyperspektral SRS. För att mäta CARS icke-resonanta bakgrund, fokusera på glasöverdragsglaset och samla in samma antal steg för de hyperspektrala CARS-mätningarna.
  6. Optimera signal-brusförhållandet (SNR) för bilder
    1. Förbered ett kemiskt prov för systemjustering. Följ proceduren som beskrivs i steg 3.1 för provberedning.
      OBS: DMSO är ett bra val eftersom det är en vanlig laboratoriekemikalie med starka Raman-signaler och väl separerade C-H symmetriska och asymmetriska toppar.
    2. Placera provet på mikroskopsteget och tillsätt vatten eller nedsänkningsolja om det behövs för objektivlinsen eller kondensorn. Flytta kanten på DMSO-droppen korrekt i synfältet och justera objektivlinsen för bästa fokus. Centrera kondensorn med Köhler-belysningsmetoden41. Öppna membranet helt på kondensorn.
    3. Ställ in pumpstrålens våglängd till 800 nm (1 045 nm Stokes) för att rikta in sig på 2 913 cm-1 CH 3-toppen. Ställ in effekten för både pumpen och Stokes-strålen till ~ 30 mW före mikroskopet genom att justera halvvågplattan (~ 10 mW effekt vid provplanet).
    4. För SRS ställer du in låsningsförstärkarens förstärkning på ~10 med en tidskonstant på 7 μs (när du använder en uppehållstid på 10 μs pixlar). Se till att tidskonstanten är mindre än pixelns uppehållstid. Använd Demod R för AUX-utgången för SRS-signaler.
    5. För CARS, skicka PMT-utgången till förförstärkaren och strömspänningsomvandlaren. Använd DAQ för att hämta utdata från omvandlaren.
    6. Ställ in bildförvärvsparametrarna i förvärvsprogramvaran. Använd ett pixelnummer på 200 x 200 med en skanningsstorlek på ~ 100 x 100 μm2. Kontrollera att bilden innehåller både DMSO-droplet-filen och ett tomt område.
    7. Skanna provet och kontrollera bilden på datorskärmen. Skanna det motoriserade fördröjningssteget i Stokes/pumpstrålen medan du övervakar realtidsbilderna. Skanna över fördröjningen tills signalen är maximerad.
    8. Flytta DMSO-droppen för att täcka hela synfältet och kontrollera om DC-signalmaximum är centrerat i bilden (signalen är pumpstråleberoende). Justera antingen pumpstrålens position via en spegel eller spänningsförskjutningen i bildprogramvaran.
    9. Efter DC-optimering, justera Stokes strålspeglar tills AC-signalen maximeras genom att justera tröskelvärdet för att visa ~ 50% mättnad. Kontrollera om mättnaden är centrerad i bilden. Om inte, finjustera speglarna endast i Stokes-strålen. Övervaka signalen under justeringen som feedback i realtid om justeringens kvalitet.
    10. För att bestämma SNR, välj en liten region i DMSO-bilden och mät medelvärdet. För bruset väljer du ett litet område i bildens tomma område och bestämmer både medelvärdet och standardavvikelsen. Subtrahera brusmedelvärdet från signalmedelvärdet och dividera resultaten med standardavvikelsen för det tomma området.
    11. Om den beräknade SNR inte är tillräckligt hög (vanligtvis 800-1 000 för SRS och >10 000 för CARS vid en PMT-spänning på 0,4 V med denna effektkombination), kontrollera och optimera strålöverlappningen, strålstorlekarna och fördröjningsstegspositionen, finjustera AOM och ändra funktionsgeneratormoduleringsfrekvensen tills den förväntade SNR erhålls.

2. Bildanalys och databehandling

  1. SNR-analys
    1. Öppna ImageJ-programvaran. Om du vill importera det sparade DMSO-exemplet .txt fil klickar du på | Importera | | Öppet.
    2. När bilden har importerats trycker du på CTRL + skift + C för att få fram ljusstyrkan och kontrastfunktionen (B&C). För att hitta den maximala provsignalen, tryck på autoknappen i B&C tills ett område i DMSO-provet verkar mättat.
    3. Klicka på det ovala markeringsverktyget i ImageJ-gränssnittet och markera ett litet område i det mättade DMSO-området. När du är markerad trycker du på M för att mäta medelvärdet och standardavvikelsen för det valda området.
    4. För att mäta bakgrunden, justera staplarna i B &C-funktionen tills signalen från det tomma området kan observeras. Klicka på den ovala markeringen och markera ett område i bakgrunden med samma storlek som för steg 2.1.3. Kontrollera att den valda regionen inte innehåller DMSO. Tryck på M för att mäta statistiken för det valda området.
    5. Beräkna SNR enligt steg 1.6.10.
  2. Bearbeta hyperspektrala CRS-bilder
    1. Importera .txt-filen enligt steg 2.1.1. När du har importerat klickar du på | Staplar | Verktyg | Montage att stapla... för att konvertera filen till en bildstapel.
    2. Bläddra igenom montaget tills den första DMSO-toppen är synlig. Välj en region på DMSO och klicka på Bild | Stapla | Rita upp Z-axelprofil för att rita intensitets- och bildrutenummerspektrumet. För att extrahera råa spektraldata, klicka på listan och kopiera profildata.
    3. För att konvertera det återställda spektrumet till vågnummerenheter, utför en linjär regression enligt beskrivningen i steg 1.5.5.
  3. Montering för mätning av spektral upplösning
    OBS: Lorentzian-funktioner används för att passa SRS- och CARS-spektra28.
    1. Öppna anpassningsprogrammet och kopiera och klistra in linjära regressionsdata i programmet. För att anpassa SRS-data markerar du data och ritar sedan data som ett spridningsdiagram.
    2. Dra upp spridningsdiagrammet. Klicka på Analys | Toppar och | Flera Peak Fit-| Öppna Dialog för att ta fram toppanalysatorn. När du drar upp, kontrollera att ingången är den aktuella tomten och ändra toppfunktionen till Lorentzian (Lorentz).
    3. Dubbelklicka på var och en av de två DMSO-topparna i diagrammet för att markera de regioner som ska monteras. Klicka sedan på Öppna NLfit för att öppna monteringsfönstret . Klicka på knappen Anpassa tills konvergerad och sedan på OK för att se en tabellsammanfattning av anpassningskoefficienterna (se Eq (3)).
      OBS: Nedanstående ekvation visar Lorentzian-funktionsformatet i programvaran. A1/2 är amplituderna för monteringstopparna, w1/2 är bredden på de monterade topparna och x01/02-värdena är centrum för de monterade topparna. Den oberoende variabeln är x och den beroende variabeln är y.
      Equation 1 (3)
    4. För CARS spektralpassning, klicka på Analys | Passande | Olinjär kurva passar | Öppna dialog. Välj kategori: ny för att definiera en ny funktion för CARS. Använd en CARS-monteringsfunktion med två toppar som definieras nedan (se Eq (4)) för CARS-spektralmontering.
      Equation 1 (4)
  4. Bestämning av den rumsliga upplösningen
    Innan detta steg är det viktigt att känna till konverteringen mellan pixelstorleken vid en viss förstoring, pixelnummer och stegstorleken i μm. Detta kan utföras genom att använda ett prov med en känd diameter som är större än den förväntade bildupplösningen, mäta dess linjeprofil och montera en Gaussisk funktion för att bestämma hela bredden vid ett halvt maximalt (FWHM) värde. Upplösningsmål eller enhetliga prover som polymerpärlor kan användas.
    1. Skaffa en bild av celler eller polymerpartiklar mindre än 200 nm i diameter.
    2. Använd ImageJ för att rita en linje över den minsta partikeln i bilden.
    3. Tryck på K för att rita intensitetsprofilen.
    4. Klicka på listan i popup-fönstret och kopiera informationen till passande programvara.
    5. Rita profilen i anpassningsprogramvara och använd Gaussisk montering (klicka på Analys | Passande | Olinjär kurva passar | Öppna | Kategori: Grundläggande funktioner; Funktion: Gauss).
    6. Läs toppbredden efter montering. Använd konverteringen av pixel till storlek för att få mikroskopets faktiska upplösning.

3. Beredning av prover för hyperspektral CRS-avbildning

  1. Beredning av bildglas och kemiska prover
    1. Placera en bit dubbelhäftande tejp på ett täckglas och klipp ut en liten rektangulär form av tejpen från mitten av den placerade tejpen för att skapa ett öppet område för provet som ska placeras.
    2. Pipettera 1-2 μl ren DMSO och dosera droppen i mitten av vakansen.
    3. Placera försiktigt det övre täckglaset och tryck försiktigt på kanterna på täckglasen för att täta kammaren samtidigt som du ser till att DMSO-provet inte kommer i kontakt med tejpens kanter.
    4. För känslighetsexperiment, förbered seriella utspädningar av DMSO i deuteriumoxid (D2O) för att ge ett koncentrationsintervall på 50% -0%. Ta 1-2 μl av varje lösning och bered pressade prover enligt beskrivningen ovan.
  2. Cell förberedelse
    1. Frö cellerna i en 35 mm glasskål (eller större) i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin.
    2. Inkubera cellerna i en inkubationskammare vid 37 °C med en 5% CO2-atmosfär över natten eller längre tills ~ 50% -80% sammanflöde uppnås.
    3. Avbilda de levande cellerna direkt eller fixa cellerna med en 10% formalinlösning för avbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Jämförelser av spektralupplösningen
Figur 2 jämför spektralupplösningen för hyperspektral SRS (figur 2A) och CARS (figur 2B) mikroskopi med hjälp av ett DMSO-prov. För SRS-spektrumet tillämpades två Lorentziska funktioner (se protokollsteg 2.3) för att passa spektrumet, och en upplösning på 14,6 cm-1 erhölls med hjälp av toppen 2 913 cm-1 . För CARS användes en två-topppassningsfunktion med gaussisk bakgrund (se protokollsteg 2.3) för montering, vilket gav spektralupplösningen 17,1 cm-1. Dessa resultat visar att SRS i samma mättillstånd har en bättre spektral upplösning än CARS. Den minskade spektralupplösningen i CARS bidrar främst till att den icke-resonanta bakgrunden är inblandad. Dessutom visade det sig att de symmetriska (2 913 cm-1) och asymmetriska (2 995 cm-1) toppförhållandena var mycket olika för SRS och CARS. Detta beror på de olika signalkorrelationerna med tredje ordningens olinjära optiska känslighet, som beskrivs i ekvationerna (1) och (2). Med CARS kvadratiska beroende förstärks intensitetsskillnaden mellan de två topparna. De symmetriska linjeformerna för SRS-topparna och de asymmetriska linjeformerna för CARS-topparna kan observeras i spektrumet. Asymmetrin i CARS-signalen beror främst på närvaron av den icke-resonanta bakgrundsstörningen. CARS spektraltoppar verkar något rödförskjutna (1-2 cm-1) till SRS-topparna. Detta beror också på den icke-resonanta bakgrundsinterferensen med resonanstoppar.

Jämförelser av detektionskänsligheten
Figur 3 jämför detektionskänsligheten för hyperspektral SRS- och CARS-mikroskopi. SNR för DMSO SRS-signalerna (2 913 cm-1) som funktion av DMSO-koncentrationen iD2Ovid höga koncentrationer plottas först (1%-50%, figur 3A). Resultaten visar ett linjärt förhållande, tillfredsställande ekvation (2). Figur 3B visar DMSO-spektra vid 0,1% och 0,01% koncentrationer, där toppen på 2 913 cm-1 kan lösas i den förra men inte i den senare, vilket indikerar att detektionsgränsen är mellan 0,1% och 0,01% DMSO. Med hjälp av gränsen för tomma kriterier uppskattade vi att SRS-identifieringsgränsen är 0,021 % DMSO. Figur 3C visar CARS SNR som funktionen av DMSO-koncentrationen (1% -50%), vilket visar ett kvadratiskt beroende i överensstämmelse med ekvation (1). De fasåtertagna CARS-spektra visas i figur 3D för 0,1% och 0,01% DMSO. För att uppnå dessa spektra användes en spektral fashämtningsmetod baserad på Kramers-Kronig-relationer och ytterligare bakgrundsborttagning utfördes16. I likhet med SRS-spektra kan DMSO 2,913 cm-1-toppen tydligt lösas för 0,1% DMSO men inte 0,01%, vilket indikerar en detektionsgräns mellan dessa två koncentrationer. Med hjälp av gränsen för tomma kriterier uppskattade vi att SRS-identifieringsgränsen är 0,015 % DMSO. 0,02% DMSO motsvarar 2,8 mM. Därför är detektionsgränsen för det hyperspektrala CRS-mikroskopet som används här ~ 2,1-2,8 mM DMSO.

Jämförelser av den rumsliga upplösningen
I figur 4 jämförs upplösningen för en liten mobilfunktion som detekterats i SRS-bilder (figur 4A) och CARS-bilder (figur 4B). Intensitetsprofilerna från samma linje visas och passar med hjälp av en Gaussisk funktion för att bestämma FWHM-värden för upplösningsjämförelse. SRS-signalen gav en upplösning på 398,6 nm (figur 4C), medan CARS-signalen gav en upplösning på 330,3 nm (figur 4D). Upplösningen för CARS var ~ 1,2x bättre än SRS. Orsaken till upplösningsskillnaden ligger också i ekvationerna (1) och (2). Både pump- och Stokes-balkar har en Gaussisk punktspridningsfunktion i fokus. Signalen från CARS är då proportionell mot multiplikationen av tre gaussiska funktioner, vilket ungefär minskar bredden med en faktor på √3. På samma sätt reduceras bredden för SRS med en faktor √2. Därför var upplösningen för CARS √3/√2 = 1,2 gånger bättre än SRS.

Jämförelser av bilderna av celler
Figur 5 jämför SRS- och CARS-bilder från MIA PaCa-2-celler vid olika optiska fördröjningspositioner. Figur 5A visar SRS-bilderna vid den optiska fördröjning som gav den starkaste signalen. I den här bilden kan lipiddroppar (LD), endoplasmatisk retikulum (ER) och kärna (NU) detekteras, med LD: er som har de starkaste signalerna som visas som ljusa prickar. Figur 5B visar CARS-kanalbilden med samma optiska fördröjning, med mycket reducerade kontraster för LD-skivor. De främsta orsakerna till denna kontrastskillnad är närvaron av den icke-resonanta bakgrunden och den röda förskjutningen av samma Raman-topp i CARS-spektra. Vid denna optiska fördröjning har den genererade signalen ett stort bidrag från den icke-resonanta bakgrunden av vatten. För att förbättra lipidkontrasten i CARS stämdes den optiska fördröjningen till ett rödförskjutet värde. Rödskiftet förbättrade lipidkontrasterna genom att koncentrera mer energi till 2 850 cm-1 för både SRS (figur 5C) och CARS (figur 5D), även om den totala signalnivån sänktes. För CARS uppnåddes en liknande kontrast av LDs som SRS genom en ~ 98 cm-1 rödförskjutning i spektralfokusering (figur 5D), även om en bakgrund högre än den i SRS-bilden fortfarande observerades. Vid denna optiska fördröjning visar SRS-bilden mycket mindre protein- och nukleinsyrainnehåll men starkt lipidinnehåll i LD, ER och cellmembran (figur 5C).

CARS är en parametrisk process medan SRS är icke-parametrisk. En sådan skillnad bidrar också till kontrastskillnader i de två metoderna. De parametriska CARS-signalerna bestäms av interferensen av CARS-signaler från olika lager nära laserfokus, vilket kan visa negativa kontraster som indikeras av pilarna i figur 5B och figur 5D (även i figur 4B). Sådana signalinterferensinducerade negativa kontraster saknas i SRS-bilderna. Den negativa kontrasten i CARS kan ge information om den axiella positionen för det mål som är av intresse.

SRS-signalerna har ett linjärt förhållande till molekylkoncentrationen, medan CARS-signalerna uppfyller ett nästan kvadratiskt koncentrationsberoende. Därför visar de CH2-rika LD: erna en mycket starkare signal än ER och cellmembranen i CARS-bilden än i SRS-bilden (figur 5E, F). SRS-spektra kan extraheras från hyperspektrala bilder. Figur 5G visar de typiska SRS-spektra från LDs, ER, cytosol (CY) och NU. Både intensiteten och spektralformen är olika för olika cellulära fack. LD visar en mycket starkare signal vid 2 850 cm-1 än andra organeller. När det gäller CARS kan liknande spektra, men olika i former, erhållas. De råa CARS-spektra visar en liten rödförskjutning jämfört med motsvarande SRS-spektra. Spektral fashämtning kan användas vidare för att extrahera Raman-svaren med hjälp av CARS-spektra.

Figure 1
Figur 1: Ett schema över det hyperspektrala CARS/SRS-mikroskopet. Förkortningar: CARS = koherent anti-Stokes Raman spridning; SRS = stimulerad Ramanspridning; PBS = polarisationsstråledelare; PD = fotodiod; PMT = fotomultiplikatorrör; AOM = akusto-optisk modulator. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: DMSO-spektra (A) SRS och (B) CARS-spektra för DMSO. Prickar är experimentella data; kurvor är spektrala anpassningsresultat. Förkortningar: CARS = koherent anti-Stokes Raman spridning; SRS = stimulerad Ramanspridning; DMSO = dimetylsulfoxid; w = spektral upplösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Signal-brusförhållanden och spektra för DMSO.(A) Signal-brusförhållandet för DMSO-symmetrisk topp vid 2,913 cm-1 som en funktion av koncentrationen i D2Omätt med SRS. Prickarna är experimentella data; linjen är det linjära anpassningsresultatet. B) SRS-spektra på 0,1 % och 0,01 % DMSO i D2O. (C) Signal-brusförhållande för DMSO symmetrisk topp vid 2,913 cm-1 som en funktion av koncentrationen iD2Omätt av CARS. Prickarna är experimentella data; kurvan är andra gradens polynompassningsresultatet. D) CARS-spektra på 0,1 % och 0,01 % DMSO i D2O. Förkortningar: CARS = koherent anti-Stokes Raman-spridning; SRS = stimulerad Ramanspridning; DMSO = dimetylsulfoxid; SNR = signal-brusförhållande; D2O= deuteriumoxid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: SRS- och CARS-bilder och intensitetsprofiler för en MIA PaCa-2-cell. (B) En CARS-bild av en MIA PaCa-2-cell i samma synfält som panel A. C) Intensitetsprofil för SRS längs den gula linjen i panel A. D) Cars intensitetsprofil längs den gula linjen i panel B. Prickar är experimentella data; kurvor är Gaussiska funktionsanpassningsresultat. Skalstänger = 5 μm. Förkortningar: CARS = koherent anti-Stokes Raman spridning; SRS = stimulerad Ramanspridning; w = upplösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Bilder och intensitetsprofil för MIA PaCa-2-celler. (B) En CARS-bild med samma fördröjning som i panel A. (C) En SRS-bild vid 98 cm-1 rödförskjutna fördröjningar som i panel A. D) En CARS-bild med samma optiska fördröjning som i panel C. (E,F) Intensitetsprofilerna SRS och CARS ritade längs de streckade linjerna i panelerna A och D. (G) Typiska SRS-spektra från lipiddropparna, endoplasmatisk retikulum, cytosol och kärna. (H) Typiska CARS-spektra för de fyra cellulära kompositionerna. De gröna och röda prickade linjerna är fördröjningspositioner för panelerna A/B respektive C/D. Skalstänger = 10 μm. Förkortningar: CARS = koherent anti-Stokes Raman spridning; SRS = stimulerad Ramanspridning; LD = lipiddroppar; ER = endoplasmatisk retikulum; CY = cytosol; NU = kärna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil: Lab-skriven programvara baserad på LabVIEW med en samtidig flerkanalsvisning för visning och sparande av bilder i realtid. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet som presenteras här beskriver konstruktionen av ett multimodalt CRS-mikroskop och den direkta jämförelsen mellan CARS och SRS-avbildning. För mikroskopkonstruktionen är de kritiska stegen rumslig och tidsmässig strålöverlappning och optimering av strålstorlek. Det rekommenderas att använda ett standardprov som DMSO före den biologiska avbildning för att optimera SNR och kalibrera Raman-skift. Direkt jämförelse mellan CARS- och SRS-bilder avslöjar att CARS har en bättre rumslig upplösning, medan SRS ger bättre spektralupplösning och mindre invecklade kemiska kontraster. Både CARS och SRS har liknande detektionsgränser.

CARS och SRS-avbildning använder högenergipulslasrar för excitation. Detta gör det möjligt för plattformen att integrera andra olinjära optiska avbildningsmetoder såsom multifoton excitation fluorescens, harmonisk generering och övergående absorption för ytterligare kemiska kontraster28,39.

CARS och SRS har använts i stor utsträckning för att studera lipidsammansättning med hög kemisk selektivitet. Tekniken är dock inte begränsad till att kvantifiera lipider. SRS har använts för att kartlägga läkemedelsdistribution42, proteinsyntes43 och DNA44. CARS och SRS har också tillämpats på bildläkemedel och hjälpämnen i tabletter 45,46,47,48. Hyperspektrala CARS och SRS har hittat tillämpningar inom cancerdiagnos49, utvärdering av hjärt-kärlsjukdom50 och neural avbildning51. De kan också sökas för covid-19-studier52. Bredbandsbilar, som kan täcka spektrala fönster så breda som 3 000 cm-1, kan belysa rika kemiska strukturer i biologiska prover53. På grund av den långsamma avläsningshastigheten för CCD är pixelns uppehållstid på nivån av millisekunder, mycket långsammare än mikrosekundpixelns uppehållstid för SRS-mikroskopi34. Hyperspektral SRS-mikroskopi har för närvarande en typisk bandbredd på 200-300 cm-1, begränsad av laserbandbredden och bristen på inlåsningsintegrerade arraydetektorer34. Fouriertransform SRS-mikroskopi är ett alternativt sätt att potentiellt bredda SRS-spektraltäckningen35.

Även om CARS och SRS ger rik kemisk information utan behov av märkning, ligger den kemiska selektiviteten i kemiska bindningar, vilket gör det svårt att skilja specifika proteiner. Raman-taggar har visat potential att förbättra den kemiska selektiviteten hos CARS och SRS 54,55. Koherent Raman-avbildning har dock fortfarande mycket lägre känslighet jämfört med fluorescensdetektering. Ytförbättring användes för spontan Raman-spridningsspektroskopi för att förbättra signalnivåerna56. Det tillämpades också på CARS och SRS för signalförstärkning 57,58,59. Även om förbättringsfaktorn inte är lika hög som spontan Raman-spridning, visar ytförstärkt CARS- och SRS-mikroskopi fortfarande potentialen att detektera enstaka molekyler59,60. Ändå berövar användningen av metallpartiklar eller ytor fördelen med det etikettfria tillvägagångssättet. Att förbättra känsligheten hos koherent Raman-mikroskopi utan att använda metallytor skulle kraftigt utöka tillämpningen av tekniken inom biologisk vetenskap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av Purdue University Department of Chemistry startfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D galvo scanner set Thorlabs GVS002
Acousto-optic modulator Isomet M1205-P80L-0.5
AOM driver Isomet 532B-2
Data acquisition card National Instruments PCle 6363 Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage Zaber X-LSM050A
Deuterium oxide Millipore Sigma 151882-100G
Dichroic mirror for beam combination Thorlabs DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation Semrock FF776-Di01-25x36
DMSO MiliporeSigma 200-664-3
MIA PaCa 2 Cells ATCC CRL-1420
Femtosecond laser system Spectral Physics InSightX3+
Filter for CARS Chroma AT655/30m
Filter for SRS Chroma ET980sp
Function generator Rigol DG1022Z
Glass rods Lattice Electro Optics SF-57
Half-wave plate Newport 10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020 National Instruments This is the image acquisition software
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI
Microscope housing Olympus BX51W1
Objective lens Olympus UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b OriginLab Corporation This is the spectral fitting software
Oscilloscope Tektronix TBS2204B
Photodiode Hamamatsu S3994-01
PMT detector Hamamatsu H7422P-40
PMT voltage amplifier Advanced Research Instrument Corp. PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube Thorlabs PBS255
Terminal block National Instruments BNC-2110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raman, C. V. A change of wave-length in light scattering. Nature. 121 (3051), 619 (1928).
  2. Li, S., Li, Y., Yi, R., Liu, L., Qu, J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and its applications. Frontiers in Physics. 8, 515 (2020).
  3. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 883-909 (2008).
  4. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 507-530 (2011).
  5. Suhalim, J. L., Boik, J. C., Tromberg, B. J., Potma, E. O. The need for speed. Journal of Biophotonics. 5 (5-6), 387-395 (2012).
  6. Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Optics Letters. 7 (8), 350-352 (1982).
  7. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  8. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
  9. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: instrumentation, theory, and applications. The Journal of Physical Chemistry B. 108 (3), 827-840 (2004).
  10. Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807 (2005).
  11. Cheng, J. -X., Volkmer, A., Book, L. D., Xie, X. S. An epi-detected coherent anti-Stokes Raman scattering (E-CARS) microscope with high spectral resolution and high sensitivity. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (7), 1277-1280 (2001).
  12. Volkmer, A., Book, L. D., Xie, X. S. Time-resolved coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Imaging based on Raman free induction decay. Applied Physics Letters. 80 (9), 1505-1507 (2002).
  13. Marks, D. L., Boppart, S. A. Nonlinear interferometric vibrational imaging. Physical Review Letters. 92 (12), 123905 (2004).
  14. Ganikhanov, F., Evans, C. L., Saar, B. G., Xie, X. S. High-sensitivity vibrational imaging with frequency modulation coherent anti-Stokes Raman scattering (FM CARS) microscopy. Optics Letters. 31 (12), 1872-1874 (2006).
  15. Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241-243 (2006).
  16. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363-1365 (2009).
  17. Masia, F., Karuna, A., Borri, P., Langbein, W. Hyperspectral image analysis for CARS, SRS, and Raman data. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (8), 727-734 (2015).
  18. Knutsen, K. P., Johnson, J. C., Miller, A. E., Petersen, P. B., Saykally, R. J. High spectral resolution multiplex CARS spectroscopy using chirped pulses. Chemical Physics Letters. 387 (4-6), 436-441 (2004).
  19. Okuno, M., Kano, H., Leproux, P., Couderc, V., Hamaguchi, H. -o Ultrabroadband multiplex CARS microspectroscopy and imaging using a subnanosecond supercontinuum light source in the deep near infrared. Optics Letters. 33 (9), 923-925 (2008).
  20. Masia, F., Glen, A., Stephens, P., Borri, P., Langbein, W. Quantitative chemical imaging and unsupervised analysis using hyperspectral coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 85 (22), 10820-10828 (2013).
  21. Pegoraro, A. F., Slepkov, A. D., Ridsdale, A., Moffatt, D. J., Stolow, A. Hyperspectral multimodal CARS microscopy in the fingerprint region. Journal of Biophotonics. 7 (1-2), 49-58 (2014).
  22. Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
  23. Ploetz, E., Laimgruber, S., Berner, S., Zinth, W., Gilch, P. Femtosecond stimulated Raman microscopy. Applied Physics B. 87 (3), 389-393 (2007).
  24. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  25. Nandakumar, P., Kovalev, A., Volkmer, A. Vibrational imaging based on stimulated Raman scattering microscopy. New Journal of Physics. 11 (3), 033026 (2009).
  26. Slipchenko, M. N., Le, T. T., Chen, H., Cheng, J. -X. High-speed vibrational imaging and spectral analysis of lipid bodies by compound Raman microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 113 (21), 7681-7686 (2009).
  27. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62 (1), 507-530 (2011).
  28. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 415-445 (2015).
  29. Prince, R. C., Frontiera, R. R., Potma, E. O. Stimulated Raman scattering: from bulk to nano. Chemical Reviews. 117 (7), 5070-5094 (2017).
  30. Lu, F. -K., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Physics. 110 (15-16), 1927-1932 (2012).
  31. Ozeki, Y., et al. High-speed molecular spectral imaging of tissue with stimulated Raman scattering. Nature Photonics. 6 (12), 845-851 (2012).
  32. Wang, P., et al. Label-free quantitative imaging of cholesterol in intact tissues by hyperspectral stimulated raman scattering microscopy. Angewandte Chemie International Edition. 125 (49), 13280-13284 (2013).
  33. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  34. Liao, C. -S., et al. Microsecond scale vibrational spectroscopic imaging by multiplex stimulated Raman scattering microscopy. Light: Science & Applications. 4 (3), 265 (2015).
  35. Liao, C. -S., et al. Spectrometer-free vibrational imaging by retrieving stimulated Raman signal from highly scattered photons. Science Advances. 1 (9), 1500738 (2015).
  36. He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
  37. Andresen, E. R., Berto, P., Rigneault, H. Stimulated Raman scattering microscopy by spectral focusing and fiber-generated soliton as Stokes pulse. Optics Letters. 36 (13), 2387-2389 (2011).
  38. Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
  39. Zhang, C., Aldana-Mendoza, J. A. Coherent Raman scattering microscopy for chemical imaging of biological systems. Journal of Physics: Photonics. , (2021).
  40. Martens, W. N., Frost, R. L., Kristof, J., Theo Kloprogge, J. Raman spectroscopy of dimethyl sulphoxide and deuterated dimethyl sulphoxide at 298 and 77 k. Journal of Raman Spectroscopy. 33 (2), 84-91 (2002).
  41. Gill, G. W. Cytopreparation: Principles & Practice. Gill, G. W. , Springer. New York. 309-323 (2013).
  42. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  43. Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11226-11231 (2013).
  44. Lu, F. -K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Slipchenko, M. N., et al. Vibrational imaging of tablets by epi-detected stimulated Raman scattering microscopy. Analyst. 135 (10), 2613-2619 (2010).
  46. Slipchenko, M. N., Zhou, B., Pinal, R., Teresa Carvajal, M., Cheng, J. -X. RAMAN-chemical imaging of solid dosage forms based on stimulated Raman scattering. American Pharmaceutical Review. 15 (3), 66 (2012).
  47. Sarri, B., et al. Discriminating polymorph distributions in pharmaceutical tablets using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 50 (12), 1896-1904 (2019).
  48. Fussell, A. L., Kleinebudde, P., Herek, J., Strachan, C. J., Offerhaus, H. L. Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy visualizes pharmaceutical tablets during dissolution. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (89), e51847 (2014).
  49. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging). Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  50. Lim, R. S., et al. Multimodal CARS microscopy determination of the impact of diet on macrophage infiltration and lipid accumulation on plaque formation in ApoE-deficient mice [S]. Journal of Lipid Research. 51 (7), 1729-1737 (2010).
  51. Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  52. Tabish, T. A., Narayan, R. J., Edirisinghe, M. Rapid and label-free detection of COVID-19 using coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Mrs Communications. 10 (4), 566-572 (2020).
  53. Camp, C. H., et al. High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nature Photonics. 8 (8), 627-634 (2014).
  54. Wei, L., et al. Live-cell bioorthogonal chemical imaging: stimulated Raman scattering microscopy of vibrational probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
  55. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  56. Nie, S., Emory, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).
  57. Steuwe, C., Kaminski, C. F., Baumberg, J. J., Mahajan, S. Surface enhanced coherent anti-Stokes Raman scattering on nanostructured gold surfaces. Nano Letters. 11 (12), 5339-5343 (2011).
  58. Fast, A., Kenison, J. P., Syme, C. D., Potma, E. O. Surface-enhanced coherent anti-Stokes Raman imaging of lipids. Applied Optics. 55 (22), 5994-6000 (2016).
  59. Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  60. Yampolsky, S., et al. Seeing a single molecule vibrate through time-resolved coherent anti-Stokes Raman scattering. Nature Photonics. 8 (8), 650-656 (2014).

Tags

Kemi utgåva 182
Direkt jämförelse av hyperspektral stimulerad Raman-spridning och koherent Anti-Stokes Raman Scattering-mikroskopi för kemisk avbildning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Clark, M. G., Brasseale III, K. A.,… More

Clark, M. G., Brasseale III, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging. J. Vis. Exp. (182), e63677, doi:10.3791/63677 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter