Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Direkte sammenligning af hyperspektral stimuleret Raman-spredning og sammenhængende anti-stokes Raman-spredningsmikroskopi til kemisk billeddannelse

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63677
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Purdue University

Summary

Dette papir sammenligner direkte opløsning, følsomhed og billedkontraster af stimuleret Raman-spredning (SRS) og sammenhængende anti-Stokes Raman-spredning (CARS) integreret i den samme mikroskopplatform. Resultaterne viser, at CARS har en bedre rumlig opløsning, SRS giver bedre kontraster og spektral opløsning, og begge metoder har samme følsomhed.

Abstract

Stimuleret Raman-spredning (SRS) og sammenhængende anti-Stokes Raman-spredning (CARS) mikroskopi er de mest anvendte sammenhængende Raman-spredningsteknologier. Hyperspektral SRS- og CARS-billeddannelse tilbyder Raman-spektral information ved hver pixel, hvilket muliggør bedre adskillelse af forskellige kemiske sammensætninger. Selvom begge teknikker kræver to excitationslasere, er deres signaldetekteringsordninger og spektrale egenskaber helt forskellige. Målet med denne protokol er at udføre både hyperspektral SRS- og CARS-billeddannelse på en enkelt platform og sammenligne de to mikroskopiteknikker til billeddannelse af forskellige biologiske prøver. Den spektrale fokuseringsmetode anvendes til at erhverve spektral information ved hjælp af femtosekundlasere. Ved at bruge standard kemiske prøver sammenlignes følsomheden, rumlig opløsning og spektralopløsning af SRS og CARS under de samme exciteringsforhold (dvs. effekt ved prøven, pixelopholdstid, objektiv linse, pulsenergi). Billedkontrastene for CARS og SRS for biologiske prøver sidestilles og sammenlignes. Den direkte sammenligning af CARS- og SRS-præstationer ville give mulighed for optimal udvælgelse af modaliteten til kemisk billeddannelse.

Introduction

Raman-spredningsfænomenet blev først observeret i 1928 af C. V. Raman1. Når en hændelsesfoton interagerer med en prøve, kan der spontant forekomme en uelastisk spredningshændelse, hvor fotonens energiændring matcher en vibrationsovergang af den analyserede kemiske art. Denne proces kræver ikke brug af et kemisk mærke, hvilket gør det til et alsidigt, etiketfrit værktøj til kemisk analyse, samtidig med at prøveforstyrrelser minimeres. På trods af sine fordele lider spontan Raman-spredning af et lavt spredningstværsnit (typisk 1011 lavere end det infrarøde [IR] absorptionstværsnit), hvilket nødvendiggør lange anskaffelsestider for analyse2. Således er søgen efter at øge følsomheden af Raman-spredningsprocessen afgørende for at skubbe Raman-teknologier til billeddannelse i realtid.

En effektiv måde at forbedre følsomheden af Raman-spredning i høj grad er gennem sammenhængende Raman-spredningsprocesser (CRS), for hvilke to laserimpulser typisk bruges til at excitere molekylære vibrationsovergange 3,4. Når fotonenergiforskellen mellem de to lasere matcher prøvemolekylernes vibrationstilstande, genereres stærke Raman-signaler. De to mest almindeligt anvendte CRS-processer til billeddannelse er sammenhængende anti-Stokes Raman-spredning (CARS) og stimuleret Raman-spredning (SRS)5. I løbet af de sidste to årtier har den teknologiske udvikling avanceret CARS- og SRS-mikroskopiteknikker til at blive kraftfulde værktøjer til mærkningsfri kvantificering og belysning af kemiske ændringer i biologiske prøver.

Kemisk billeddannelse ved CARS mikroskopi kan dateres til 1982, da laserscanning først blev anvendt til at erhverve CARS-billeder, demonstreret af Duncan et al6. Moderniseringen af CARS-mikroskopi blev kraftigt fremskyndet efter de brede anvendelser af laserscanning multiphoton fluorescensmikroskopi7. Tidligt arbejde fra Xie-gruppen ved hjælp af lasere med høj gentagelseshastighed har overført CARS til at være en højhastigheds, etiketfri, kemisk billeddannelsesplatform til karakterisering af molekyler i biologiske prøver 8,9,10. Et af de største problemer for CARS-billeddannelse er tilstedeværelsen af en ikke-resonant baggrund, hvilket reducerer billedkontrasten og forvrænger Raman-spektret. Der er gjort mange bestræbelser på enten at reducere den ikke-resonante baggrund 11,12,13,14,15 eller at udtrække resonans Raman-signaler fra CARS-spektrene 16,17. Et andet fremskridt, der i høj grad har avanceret feltet, er hyperspektral CARS-billeddannelse, som giver mulighed for spektral kortlægning ved hver billedpixel med forbedret kemisk selektivitet 18,19,20,21.

Stimuleret Raman spredning (SRS) er en yngre billeddannelsesteknologi end CARS, selvom den blev opdaget tidligere22. I 2007 blev SRS-mikroskopi rapporteret ved hjælp af en laserkilde med lav gentagelseshastighed23. Snart demonstrerede flere grupper højhastigheds SRS-billeddannelse ved hjælp af lasere med høj gentagelseshastighed 24,25,26. En af de største fordele ved SRS-mikroskopi i forhold til CARS er fraværet af den ikke-resonante baggrund27, selvom andre baggrunde såsom tværfasemodulation (XPM), forbigående absorption (TA), to-fotonabsorption (TPA) og fototermisk (PT) effekt kan forekomme med SRS28. Derudover har SRS-signalet og prøvekoncentrationen lineære forhold, i modsætning til CARS, som har en kvadratisk signalkoncentrationsafhængighed29. Dette forenkler kemisk kvantificering og spektral ublanding. Flerfarvet og hyperspektral SRS har udviklet sig i forskellige former 30,31,32,33,34,35,36, hvor spektralfokusering er en af de mest populære tilgange til kemisk billeddannelse 37,38.

Både CARS og SRS kræver fokusering af pumpen og Stokes laserstråler på prøven for at matche molekylernes vibrationsovergang til signal excitation. CARS og SRS mikroskoper deler også meget til fælles. Imidlertid har fysikken bag disse to processer og signaldetektioner involveret i disse mikroskopiteknologier forskelle 3,39. CARS er en parametrisk proces, der ikke har netto fotonmolekyle energikobling3. SRS er imidlertid en ikke-parametrisk proces og bidrager til energioverførsel mellem fotoner og molekylære systemer27. I CARS genereres et nyt signal ved anti-Stokes-frekvens, mens SRS manifesterer sig som energioverførslen mellem pumpen og Stokes laserstråler.

CARS signal opfylder Eq (1)28.

Equation 1 (1)

I mellemtiden kan SRS-signal skrives som Eq (2)28.

Equation 1(2)

Her er Ip, Is, ICARS og ΔISRS intensiteten af henholdsvis pumpebjælken, Stokes-strålen, CARS-signalet og SRS-signalerne. χ(3) er prøvens tredjeordens ikke-lineære optiske modtagelighed og er en kompleks værdi sammensat af reelle og imaginære dele.

Disse ligninger udtrykker spektralprofilerne og signalkoncentrationsafhængigheden af CARS og SRS. Forskelle i fysik resulterer i forskellige detektionsordninger for disse to mikroskopiteknologier. Signaldetektion i CARS involverer normalt spektral adskillelse af nyligt genererede fotoner og detektion ved hjælp af et fotomultiplierrør (PMT) eller ladningskoblet enhed (CCD); for SRS måles energiudvekslingen mellem pumpen og Stokes-strålerne normalt ved højhastighedsintensitetsmodulation ved hjælp af en optisk modulator og demodulation ved hjælp af en fotodiode (PD) parret med en låseforstærker.

Selv om der i de senere år er blevet offentliggjort mange teknologiske udviklinger og anvendelser inden for både CARS- og SRS-områder, er der ikke foretaget systematiske sammenligninger af de to CRS-teknikker på samme platform, især for hyperspektral CARS- og SRS-mikroskopi. Direkte sammenligninger i følsomhed, rumlig opløsning, spektral opløsning og kemiske separationsfunktioner ville give biologer mulighed for at vælge den bedste modalitet til kemisk kvantificering. I denne protokol gives detaljerede trin til konstruktion af en multimodal billeddannelsesplatform med både hyperspektrale CARS- og SRS-modaliteter baseret på et femtosekundlasersystem og spektralfokusering. De to teknikker er blevet sammenlignet i fremadgående retning for spektral opløsning, detektionsfølsomhed, rumlig opløsning og billedkontraster af celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Instrumentel opsætning til hyperspektral CRS-billeddannelse

BEMÆRK: Genereringen af CRS-signal kræver brug af højeffektlasere (dvs. klasse 3B eller klasse 4). Sikkerhedsprotokoller skal behandles, og der skal altid bæres korrekt personligt beskyttelsesudstyr (PPE), når der arbejdes med så høje spidsbelastninger. Se korrekt dokumentation inden eksperimentering. Denne protokol fokuserer på at designe strålebanen, kvidre femtosekundimpulserne og optimere billeddannelsesforholdene. Et generelt optisk layout af dette hyperspektrale CRS-mikroskop er vist i figur 1. Den konfiguration, der vises her, er en af mange eksisterende konfigurationer for CRS-mikroskopi. CRS-mikroskopisystemet, der anvendes i denne protokol, er bygget på en dual-output femtosekund laserkilde og et laserscanningsmikroskop.

  1. Sørg for, at laserkilden giver to femtosekundpulstog (120 fs bredde) med en gentagelseshastighed på 80 MHz, inklusive en fast bølgelængde ved 1.045 nm, der bruges som Stokes-strålen, og en justerbar bølgelængde fra 680 til 1.300 nm, der bruges som pumpestråle. Synkroniser outputimpulserne med en optisk forsinkelsesforskel. Brug en mikroskopramme til at konstruere billeddannelsesplatformen.
  2. Design af strålebanen
    1. For at styre lasereffekten ved prøven skal du bruge en halvbølgeplade og polarisationsstrålesplitter (PBS) kombination for hver laserstråle.
    2. Installer en akustooptisk modulator (AOM) i Stokes laserstrålesti. Fokuser strålen med et 150 mm brændviddeobjektiv i AOM'en, og gentillollis 0. ordens output med et 400 mm brændviddeobjektiv.
    3. Brug det samme objektivpar (150 mm og 400 mm brændvidder) til at udvide pumpestrålen, så den matcher laserstrålestørrelsen med Stokes.
    4. Placer 400 mm brændviddeobjektiver i både pumpens og Stokes strålebaner på separate endimensionelle oversættelsestrin for at finjustere stråledivergensen og optimere strålestørrelsen, før du går ind i mikroskopet.
    5. Ret pumpestrålen med et retvinklet reflekterende spejl monteret på et motoriseret oversættelsestrin til optisk forsinkelsesindstilling. Hvis Stokes-strålen har brug for optisk forsinkelse, skal du i stedet placere disse komponenter i dens strålebane.
    6. Tillad, at begge stråler kombineres ved et dikroisk spejl med en afskæringsbølgelængde på ~ 1.000 nm (mellem pumpen og Stokes bølgelængder), så Stokes-strålen sender gennem det dikroiske spejl, mens pumpestrålen reflekteres af det dikroiske spejl. Send de kollierede kombinerede laserstråler til mikroskopet.
    7. For at kvidre pumpen og Stokes-bjælkerne skal du placere glasstænger i deres bjælkestier. Se trin 1.5 for detaljer.
    8. For at bekræfte korrekt justering og strålestørrelse skal du bruge irismembraner efter det dikroiske spejl og før mikroskopet. Installer specifikt den ene i en position tæt på og den anden i en afstand fra det dikroiske spejl for at bekræfte god justering og stråleoverlapning. Brug et IR-visningskort eller IR-fremviser til at visualisere strålen under justering.
    9. Brug en hurtig PD og et oscilloskop til omtrent at måle den optiske forsinkelse mellem pumpen og Stokes impulser. Udløs oscilloskopet ved at prøve laserpulstoget.
    10. Bloker pumpebjælken, og prøv Stokes-strålen. Zoom ind på en af pulserne, og placer en lodret markør på den for at markere dens tidsmæssige placering på oscilloskopet.
    11. Fjern blokeringen af pumpebjælken, og bloker Stokes-strålen. Oversæt forsinkelsestrinnet, indtil prøvepumpens impulser midlertidigt justeres med den markerede position.
  3. Laserscanningsmikroskopet
    1. For en opretstående mikroskopkonfiguration skal du sende de kombinerede laserstråler gennem et periskop for at klatre til et passende niveau, før de når 2D galvo-scanningsspejlene.
    2. Mål laserstrålestørrelsen før mikroskopet, og indstil det rigtige linsepar efter galvo-spejlene for at udvide laserstrålen, så den passer bedst til størrelsen på indgangseleven i objektivlinsen.
    3. Konstruer et 4-f-system ved hjælp af de to linser, hvor den bageste blænde af objektivlinsen og midten af de to galvo-spejle er konjugerede planer. Alternativt kan du bruge to separate 1D galvo spejle med to 4-f linsesystemer til laserscanning.
    4. Efter kondensatoren skal du designe et 2 i flip spejl til at reflektere laserstrålerne til signalindsamling. Placer en linse med en diameter på 2 i den transmitterede strålebane for fuldt ud at indsamle og fokusere transmissionssignaler til detektorerne.
    5. Ret CARS-signalerne til PMT'en med et dikroisk spejl med en afskæring ved 776 nm, og lad de transmitterede SRS-signaler detekteres af PD. Brug et båndpasfilter (655/30 nm) før PMT til at afvise resterende excitationslaserimpulser. Brug et kortpasfilter (980 nm kortpas) før PD til at blokere Stokes-strålen fra at komme ind i detektoren.
    6. Til CARS-signaldetektering skal du tilslutte en forforstærker og en strømspændingsomformer efter PMT'en og inden signalet sendes til dataindsamlingssystemet. Juster PMT-spændingen for at optimere signalet og billedkontrasten.
    7. Brug en funktionsgenerator til at modulere AOM'en ved 1-10 MHz, og brug den samme frekvens som referencen for indlåsningsdemodulationen. Brug en låseforstærker til at udtrække SRS-signaler før dataindsamling.
  4. Dataindsamling og -visning
    1. Udfør dataindsamling ved hjælp af et DAQ-kort (Digital Data Acquisition) i forbindelse med en terminalblok.
    2. Brug de analoge udgange fra DAQ til at styre galvo-spejlene og de analoge indgange til signaloptagelse.
    3. Brug Lab-skrevet software baseret på LabVIEW, der har en samtidig multikanalsvisning til visning og lagring af billeder i realtid (se Supplerende fil).
  5. Kvidre femtosekundkilden og måle spektralopløsningen
    BEMÆRK: For at opnå en god spektralopløsning ved hjælp af spektralfokusering bruges glasstænger til at introducere dispersioner og kvidrende laserimpulser fra femtosekund til picosekund. For at opnå den bedste spektralopløsning skal pumpebjælkens kvidringshastighed svare til Stokes-strålens. For dette lasersystem kan den bedste spektralopløsning opnås ved at kvidre de ~ 120 fs udgangslaserimpulser til 3,4 ps for pumpen og 1,8 ps for Stokes. Denne kvidren opnås ved at anvende en 4+1 kombination (fire i den kombinerede stråle, en kun i Stokes-bjælken) af 150 mm glasstang (SF-57) kombination, som beskrevet nedenfor, og bør opnå en 15 cm-1 spektral opløsning. Pulsvarigheden kan måles ved hjælp af en autokorrelator.
    1. Indsæt kun en 150 mm glasstang i Stokes-strålebanen.
    2. Indsæt to 150 mm glasstænger i den kombinerede pumpe/Stokes-strålebane efter den dikroiske strålesplitter. For at øge kvidren skal du lade de kombinerede laserstråler dobbelt passere de to glasstænger ved at placere et dielektrisk spejl i den ene ende af stængerne.
    3. For at måle spektralopløsningen skal du forberede en standard kemisk (f.eks. Dimethylsulfoxid [DMSO]) prøve presset mellem to glasdæksler og scanne forsinkelsestrinnet, indtil det maksimale signal er opnået.
    4. Den optiske forsinkelse flyttes 1.000 μm i rødforskydningsretningen. Kør derefter 200 billeder ved 10 μm / trin mod blåforskydningsretningen for at indsamle den hyperspektrale billedstak.
    5. For at konvertere rammenumrene til bølgetal skal du udføre en lineær regression ved hjælp af den symmetriske (2.913 cm-1) og asymmetriske (2.994 cm-1) C-H, der strækker sig fra DMSO og deres tilsvarende rammenumre40.
    6. Brug XPM-signalet til måling af den spektrale fokuseringsintensitetsprofil. Luk membranen på kondensatoren halvt, og flyt fokus til en tom dækslip. Saml det samme antal trin som for hyperspektral SRS. For at måle CARS nonresonant baggrund skal du fokusere på glasdækslerne og indsamle det samme antal trin til de hyperspektrale CARS-målinger.
  6. Optimering af signal/støj-forholdet (SNR) for billeder
    1. Forbered en kemisk prøve til systemjustering. Følg proceduren beskrevet i trin 3.1 for prøveforberedelse.
      BEMÆRK: DMSO er et godt valg, fordi det er et almindeligt laboratoriekemikalie med stærke Raman-signaler og godt adskilte C-H symmetriske og asymmetriske toppe.
    2. Anbring prøven på mikroskopstadiet, og tilsæt vand eller nedsænkningsolie, hvis det er nødvendigt for objektivlinsen eller kondensatoren. Flyt kanten af DMSO-dråben korrekt i synsfeltet, og juster objektivobjektivet for at få det bedste fokus. Centrer kondensatoren ved hjælp af Köhler-belysningsmetoden41. Åbn membranen helt på kondensatoren.
    3. Indstil pumpestrålebølgelængden til 800 nm (1.045 nm Stokes) for at målrette 2.913 cm-1 CH3-toppen . Effekten af både pumpen og Stokes-strålen indstilles til ~ 30 mW før mikroskopet ved at justere halvbølgepladen (~ 10 mW effekt ved prøveplanet).
    4. For SRS skal du indstille låseforstærkerens forstærkning til ~ 10 med en tidskonstant på 7 μs (når du bruger en 10 μs pixel opholdstid). Sørg for, at tidskonstanten er mindre end pixelens opholdstid. Brug Demod R til AUX-udgangen til SRS-signaler.
    5. For CARS skal du sende PMT-udgangen til forforstærkeren og strømspændingsomformeren. Brug DAQ til at hente output fra konverteren.
    6. Indstil parametrene for billedoptagelse i anskaffelsessoftwaren. Brug et pixelnummer på 200 x 200 med en scanningsstørrelse på ~100 x 100 μm2. Sørg for, at billedet indeholder både DMSO-dråben og et tomt område.
    7. Scan prøven, og kontroller billedet på computerskærmen. Scan det motoriserede forsinkelsestrin i Stokes/pumpestrålen, mens du overvåger billederne i realtid. Scan over forsinkelsen, indtil signalet er maksimeret.
    8. Flyt DMSO-dråben for at dække hele synsfeltet, og kontroller, om DC-signalmaksimum er centreret i billedet (signalet er pumpestråleafhængigt). Juster enten pumpestrålens position via et spejl eller spændingsforskydningen i billedbehandlingssoftwaren.
    9. Efter DC-optimering skal du justere Stokes-strålespejlene, indtil AC-signalet er maksimeret ved at justere tærskelværdien for at vise ~ 50% mætning. Kontroller, om mætningen er centreret i billedet. Hvis ikke, skal du kun finjustere spejlene i Stokes-bjælken. Overvåg signalet under justeringen som feedback i realtid om justeringens kvalitet.
    10. For at bestemme SNR skal du vælge et lille område af DMSO-billedet og måle middelværdien. For støjen skal du vælge et lille område i billedets tomme område og bestemme både den gennemsnitlige middelværdi og standardafvigelsen. Træk støjmiddelværdien fra signalmiddelværdien, og divider resultaterne med standardafvigelsen for det tomme område.
    11. Hvis den beregnede SNR ikke er høj nok (typisk 800-1.000 for SRS og >10.000 for CARS ved en PMT-spænding på 0,4 V med denne effektkombination), skal du kontrollere og optimere stråleoverlapningen, strålestørrelserne og forsinkelsestrinpositionen, finjustere AOM'en og ændre funktionsgeneratormodulationsfrekvensen, indtil den forventede SNR er opnået.

2. Billedanalyse og databehandling

  1. SNR-analyse
    1. Åbn ImageJ-softwaren. Hvis du vil importere det gemte DMSO-eksempel .txt fil, skal du klikke på Filer | Import | Tekst billede | Åben.
    2. Når billedet er importeret, skal du trykke på CTRL+shift+C for at få vist lysstyrke- og kontrastfunktionen (B&C). For at finde det maksimale prøvesignal skal du trykke på autoknappen i B&C, indtil et område af DMSO-prøven ser mættet ud.
    3. Klik på det ovale markeringsværktøj på ImageJ-grænsefladen, og fremhæv et lille område af det mættede DMSO-område. Når det er fremhævet, skal du trykke på M for at måle middel- og standardafvigelsen for det valgte område.
    4. For at måle baggrunden skal du justere søjlerne i B&C-funktionen, indtil signalet fra det tomme område kan observeres. Klik på den ovale markering, og fremhæv et område af baggrunden af samme størrelse som for trin 2.1.3. Sørg for, at det valgte område ikke indeholder DMSO. Tryk på M for at måle statistikken for det valgte område.
    5. SNR beregnes i henhold til trin 1.6.10.
  2. Behandling af hyperspektrale CRS-billeder
    1. Importer .txt filen i henhold til trin 2.1.1. Når den er importeret, skal du klikke på Billed- | Stakke | Værktøjer | Montage til stak ... for at konvertere filen til en billedstak.
    2. Rul gennem montagen, indtil den første DMSO-top er synlig. Vælg en region på DMSO og klik på Image | Stak | Afbild Z-akseprofilen for at plotte intensiteten versus rammetalspektret. For at udtrække de rå spektrale data skal du klikke på listen og kopiere profildataene.
    3. For at konvertere det genvundne spektrum til bølgetalsenheder skal du udføre en lineær regression som beskrevet i trin 1.5.5.
  3. Passer til måling af spektral opløsning
    BEMÆRK: Lorentziske funktioner bruges til at passe til SRS- og CARS-spektre28.
    1. Åbn tilpasningssoftwaren, og kopier og indsæt derefter de lineære regressionsdata i programmet. For at tilpasse SRS-dataene skal du fremhæve dataene og derefter plotte dataene som et spredningsdiagram.
    2. Træk spredningsplottet op. Klik på Analyse | Toppe og baseline | Flere Peak Fit | Åbn Dialog for at få vist topanalysatoren. Når du trækkes op, skal du kontrollere, at indgangen er det aktuelle plot og ændre topfunktionen til Lorentzian (Lorentz).
    3. Dobbeltklik på hver af de to DMSO-toppe på grafen for at fremhæve de regioner, der skal monteres. Klik derefter på Åbn NLfit for at åbne monteringsvinduet . Klik på knappen Tilpas indtil konvergeret og derefter OK for at se en tabeloversigt over tilpasningskoefficienterne (se Eq (3)).
      BEMÆRK: Nedenstående ligning viser det lorentziske funktionsformat i softwaren. En1/2 er amplituderne af monteringstoppene, w1/2 er bredden af de monterede toppe, og x01/02-værdierne er centrene for de monterede toppe. Den uafhængige variabel er x, og den afhængige variabel er y.
      Equation 1 (3)
    4. For CARS spektral montering skal du klikke på Analyse | Montering af | Ikke-lineær kurve passer | Åbn Dialog. Vælg kategori: ny for at definere en ny funktion for CARS. Brug en CARS-tilpasningsfunktion med to toppe, der er defineret nedenfor (se Eq (4)) til CARS-spektralmontering.
      Equation 1 (4)
  4. Bestemmelse af den rumlige opløsning
    BEMÆRK: Før dette trin er det vigtigt at kende konverteringen mellem pixelstørrelsen ved en bestemt forstørrelse, pixelnummer og trinstørrelsen i μm. Dette kan udføres ved at bruge en prøve med en kendt diameter, der er større end den forventede billeddannelsesopløsning, måle dens linjeprofil og montere en gaussisk funktion til at bestemme den fulde bredde ved halv maksimal (FWHM) værdi. Opløsningsmål eller ensartede prøver såsom polymere perler kan anvendes.
    1. Få et billede af celler eller polymerpartikler mindre end 200 nm i diameter.
    2. Brug ImageJ til at tegne en streg hen over den mindste partikel i billedet.
    3. Tryk på K for at plotte intensitetsprofilen.
    4. Klik på listen i pop op-vinduet, og kopier oplysningerne til tilpasningssoftware.
    5. Plot profilen i tilpasningssoftware, og brug Gaussian fitting (klik på Analyse | Montering af | Ikke-lineær kurve passer | Åbn dialog | Kategori: Grundlæggende funktioner; Funktion: Gauss).
    6. Læs topbredden efter montering. Brug pixel til størrelseskonvertering for at opnå mikroskopets faktiske opløsning.

3. Forberedelse af prøver til hyperspektral CRS-billeddannelse

  1. Forberedelse af billeddias og kemiske prøver
    1. Placer et stykke dobbeltsidet tape på en dækslip, og skær en lille rektangulær form af båndet ud fra midten af det placerede bånd for at skabe et åbent område, hvor prøven skal placeres.
    2. Pipetter 1-2 μL ren DMSO og dispenser dråben i midten af den ledige stilling.
    3. Placer forsigtigt topdækslet, og tryk forsigtigt på kanterne på dækslerne for at forsegle kammeret, mens du sørger for, at DMSO-prøven ikke kommer i kontakt med båndets kanter.
    4. Til følsomhedsforsøg fremstilles serielle fortyndinger af DMSO i deuteriumoxid (D2O) for at give et koncentrationsområde på 50% -0%. Tag 1-2 μL af hver opløsning og forbered pressede prøver som beskrevet ovenfor.
  2. Celle forberedelse
    1. Frø cellerne i en 35 mm glasbundet skål (eller større) i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin.
    2. Cellerne inkuberes i et inkubationskammer ved 37 °C med en 5% CO2 atmosfære natten over eller længere, indtil ~50%-80% sammenløb er opnået.
    3. Afbild de levende celler direkte, eller fastgør cellerne med en 10% formalinopløsning til billeddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sammenligninger af spektralopløsningen
Figur 2 sammenligner spektralopløsningen af hyperspektral SRS (figur 2A) og CARS (figur 2B) mikroskopi ved hjælp af en DMSO-prøve. For SRS-spektret blev to lorentziske funktioner (se protokoltrin 2.3) anvendt til at passe til spektret, og en opløsning på 14,6 cm-1 blev opnået ved anvendelse af toppen på 2.913 cm-1 . For CARS blev en to-peak-fitting funktion med en gaussisk baggrund (se protokoltrin 2.3) brugt til montering, hvilket gav den spektrale opløsning på 17,1 cm-1. Disse resultater viser, at SRS i samme måletilstand har en bedre spektralopløsning end CARS. Den reducerede spektralopløsning i CARS skyldes hovedsageligt inddragelsen af den ikke-resonante baggrund. Derudover blev det konstateret, at de symmetriske (2.913 cm-1) og asymmetriske (2.995 cm-1) topforhold var meget forskellige for SRS og CARS. Dette skyldes de forskellige signalkorrelationer med den tredje ordens ikke-lineære optiske modtagelighed, som beskrevet i ligninger (1) og (2). Med CARS kvadratiske afhængighed forstærkes intensitetsforskellen mellem de to toppe. De symmetriske linjeformer på SRS-toppe og de asymmetriske linjeformer på CARS-toppe kan observeres i spektret. Asymmetrien i CARS-signalet skyldes hovedsageligt tilstedeværelsen af den ikke-resonante baggrundsinterferens. CARS spektraltoppene fremstår let rødforskudte (1-2 cm-1) til SRS-toppe. Dette skyldes også den ikke-resonante baggrundsinterferens med resonanttoppe.

Sammenligninger af detektionsfølsomheden
Figur 3 sammenligner detektionsfølsomheden for hyperspektral SRS og CARS-mikroskopi. SNR for DMSO SRS-signalerne (2.913 cm-1) som funktion af DMSO-koncentrationen iD2Oved høje koncentrationer afbildes først (1%-50%, figur 3A). Resultaterne viser et lineært forhold, tilfredsstillende ligning (2). Figur 3B viser DMSO-spektrene ved 0,1% og 0,01% koncentrationer, hvor toppen på 2.913 cm-1 kan løses i førstnævnte, men ikke i sidstnævnte, hvilket indikerer, at detektionsgrænsen er mellem 0,1% og 0,01% DMSO. Ved hjælp af grænsen for tomme kriterier anslog vi, at SRS-detektionsgrænsen er 0,021% DMSO. Figur 3C afbilder CARS SNR som funktion af DMSO-koncentration (1%-50%), der viser en kvadratisk afhængighed i overensstemmelse med ligning (1). De faseophentede CARS-spektre er vist i figur 3D for DMSO på 0,1 % og 0,01 %. For at opnå disse spektre blev der anvendt en spektral fasehentningsmetode baseret på Kramers-Kronig-relationer, og yderligere baggrundsfjernelse blev udført16. I lighed med SRS-spektrene kan DMSO 2.913 cm-1-toppen klart løses for 0,1% DMSO, men ikke 0,01%, hvilket indikerer en detektionsgrænse mellem disse to koncentrationer. Ved hjælp af grænsen for blanke kriterier anslog vi, at SRS-detektionsgrænsen er 0,015% DMSO. DMSO på 0,02% svarer til 2,8 mM. Derfor er detektionsgrænsen for det hyperspektrale CRS-mikroskop, der anvendes her, ~ 2,1-2,8 mM DMSO.

Sammenligninger af den rumlige opløsning
Figur 4 sammenligner opløsningen af en lille cellulær funktion, der er registreret i SRS-billeder (figur 4A) og CARS (figur 4B). Intensitetsprofilerne fra den samme linje vises og passer ved hjælp af en gaussisk funktion til at bestemme FWHM-værdier til sammenligning af opløsning. SRS-signalet gav en opløsning på 398,6 nm (figur 4C), mens CARS-signalet gav en opløsning på 330,3 nm (figur 4D). Opløsningen af CARS var ~ 1.2x bedre end SRS. Årsagen til opløsningsforskellen ligger også i ligningerne (1) og (2). Både pumpe- og Stokes-bjælker har en gaussisk punktspredningsfunktion i fokus. Signalet fra CARS er derefter proportionalt med multiplikationen af tre gaussiske funktioner, hvilket groft reducerer bredden med en faktor på √3. Tilsvarende for SRS reduceres bredden med en faktor på √2. Derfor var opløsningen af CARS √3/√2 = 1,2 gange bedre end SRS.

Sammenligninger af billeder af celler
Figur 5 sammenligner SRS- og CARS-billeder fra MIA PaCa-2-celler ved forskellige optiske forsinkelsespositioner. Figur 5A viser SRS-billederne ved den optiske forsinkelse, der gav det stærkeste signal. På dette billede kan lipiddråber (LD'er), endoplasmatisk retikulum (ER) og kerne (NU) detekteres, hvor LD'er har de stærkeste signaler vist som lyse prikker. Figur 5B viser CARS-kanalbilledet med samme optiske forsinkelse og har meget reducerede kontraster for LD'er. Hovedårsagerne til denne kontrastforskel er tilstedeværelsen af den ikke-resonante baggrund og det røde skift af den samme Raman-top i CARS-spektre. Ved denne optiske forsinkelse har det genererede signal et stort bidrag fra vandets ikke-resonante baggrund. For at forbedre lipidkontrasten i CARS blev den optiske forsinkelse indstillet til en rødforskudt værdi. Det røde skift forbedrede lipidkontrasterne ved at koncentrere mere energi til 2.850 cm-1 for både SRS (figur 5C) og CARS (figur 5D), selvom det samlede signalniveau blev reduceret. For CARS blev en lignende kontrast af LD'er som SRS opnået ved et ~ 98 cm-1 rødt skift i spektralfokusering (figur 5D), selvom en baggrund højere end den i SRS-billedet stadig blev observeret. Ved denne optiske forsinkelse viser SRS-billedet meget mindre protein- og nukleinsyreindhold, men stærkt lipidindhold i LD'er, ER og cellemembraner (figur 5C).

CARS er en parametrisk proces, mens SRS er ikke-parametrisk. En sådan forskel bidrager også til kontrastforskelle i de to modaliteter. De parametriske CARS-signaler bestemmes af interferensen af CARS-signaler fra forskellige lag tæt på laserfokus, som kan vise negative kontraster som angivet med pile i figur 5B og figur 5D (også i figur 4B). Sådanne signalinterferensinducerede negative kontraster er fraværende i SRS-billederne. Den negative kontrast i CARS kan give information om den aksiale position af målet af interesse.

SRS-signalerne har et lineært forhold til molekylkoncentrationen, mens CARS-signalerne opfylder en næsten kvadratisk koncentrationsafhængighed. Derfor viser de CH2-rige LD'er et meget stærkere signal end ER og cellemembranerne i CARS-billedet end i SRS-billedet (figur 5E, F). SRS-spektrene kan ekstraheres fra hyperspektrale billeder. Figur 5G viser de typiske SRS-spektre fra LD'er, ER, cytosol (CY) og NU. Både intensiteten og spektralformen er forskellige for forskellige cellulære rum. LD viser et meget stærkere signal ved 2.850 cm-1 end andre organeller. Hvad angår CARS, kan lignende spektre, selvom de er forskellige i former, opnås. De rå CARS-spektre viser et lille rødt skift i forhold til de tilsvarende SRS-spektre. Spektral fasehentning kan yderligere bruges til at udtrække Raman-svarene ved hjælp af CARS-spektrene.

Figure 1
Figur 1: Et skematisk skema over det hyperspektrale CARS/SRS mikroskop. Forkortelser: CARS = sammenhængende anti-Stokes Raman spredning; SRS = stimuleret Raman spredning; PBS = polarisationsstråle splitter; PD = fotodiode; PMT = fotomultiplierrør; AOM = acousto-optisk modulator. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: DMSO-spektre. (A) SRS og (B) CARS-spektre af DMSO. Prikker er eksperimentelle data; kurver er spektrale monteringsresultater. Forkortelser: CARS = sammenhængende anti-Stokes Raman spredning; SRS = stimuleret Raman spredning; DMSO = dimethylsulfoxid; w = spektral opløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Signal-støj-forhold og spektre for DMSO. (A) Signal/støj-forholdet mellem DMSO symmetrisk top ved 2.913 cm-1 som funktion af koncentrationen i D2O målt ved SRS. Prikkerne er eksperimentelle data; linjen er det lineære monteringsresultat. (B) SRS-spektrene på 0,1% og 0,01% DMSO i D2O. (C) Signal-støj-forholdet i DMSO symmetrisk top ved 2,913 cm-1 som funktion af koncentrationen i D2O målt af CARS. Prikkerne er eksperimentelle data; kurven er resultatet af andengradspolynomiet. (D) CARS-spektrene på 0,1% og 0,01% DMSO i D2O. Forkortelser: CARS = sammenhængende anti-Stokes Raman-spredning; SRS = stimuleret Raman spredning; DMSO = dimethylsulfoxid; SNR = signal-støj-forhold; D2O = deuteriumoxid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: SRS- og CARS-billeder og intensitetsprofiler af en MIA PaCa-2-celle. (A) Et SRS-billede af en MIA PaCa-2-celle. (B) Et CARS-billede af en MIA PaCa-2-celle i samme synsfelt som panel A. (C) Intensitetsprofil for SRS langs den gule linje i panel A. (D) Intensitetsprofil for CARS langs den gule linje i panel B. Prikker er eksperimentelle data; kurver er gaussiske funktionstilpasningsresultater. Skalastænger = 5 μm. Forkortelser: CARS = sammenhængende anti-Stokes Raman spredning; SRS = stimuleret Raman spredning; w = opløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Billeder og intensitetsprofil af MIA PaCa-2-celler. (A) Et SRS-billede af MIA PaCa-2-celler ved den optimerede tidsforsinkelse for SRS-intensitet. (B) Et CARS-billede med samme forsinkelse som i panel A. (C) Et SRS-billede ved de 98 cm-1 rødforskudte forsinkelser som i panel A. (D) Et CARS-billede med samme optiske forsinkelse som i panel C. (E,F) SRS- og CARS-intensitetsprofilerne afbildet langs de stiplede linjer i panel A og D. (G) Typiske SRS-spektre fra lipiddråberne, det endoplasmatiske retikulum, cytosol og kernen. (H) Typiske CARS-spektre af de fire cellulære sammensætninger. De grønne og røde stiplede linjer er forsinkelsespositioner for henholdsvis paneler A/ B og C / D. Skalastænger = 10 μm. Forkortelser: CARS = sammenhængende anti-Stokes Raman spredning; SRS = stimuleret Raman spredning; LD = lipiddråber; ER = endoplasmatisk retikulum; CY = cytosol; NU = kerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil: Lab-skrevet software baseret på LabVIEW, der har en samtidig multikanalsskærm til visning og lagring af billeder i realtid. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen, der præsenteres her, beskriver konstruktionen af et multimodalt CRS-mikroskop og den direkte sammenligning mellem CARS- og SRS-billeddannelse. For mikroskopkonstruktionen er de kritiske trin rumlig og tidsmæssig stråleoverlapning og optimering af strålestørrelse. Det anbefales at bruge en standardprøve som DMSO før den biologiske billeddannelse til optimering af SNR og kalibrering af Raman-skift. Direkte sammenligning mellem CARS- og SRS-billeder afslører, at CARS har en bedre rumlig opløsning, mens SRS giver bedre spektralopløsning og mindre indviklede kemiske kontraster. Både CARS og SRS har lignende detektionsgrænser.

CARS og SRS-billeddannelse bruger højenergipulslasere til excitation. Dette gør det muligt for platformen at integrere andre ikke-lineære optiske billeddannelsesmetoder såsom multiphoton excitationsfluorescens, harmonisk generering og forbigående absorption for yderligere kemiske kontraster28,39.

CARS og SRS er blevet brugt i vid udstrækning til at studere lipidsammensætning med høj kemisk selektivitet. Teknologierne er imidlertid ikke begrænset til kvantificering af lipider. SRS er blevet anvendt til at kortlægge lægemiddelfordeling42, proteinsyntese43 og DNA44. CARS og SRS er også blevet anvendt på billedfarmaceutiske ingredienser og hjælpestoffer i tabletter 45,46,47,48. Hyperspektrale CARS og SRS har fundet anvendelser i kræftdiagnose49, evaluering af hjerte-kar-sygdomme50 og neural billeddannelse51. De kan også anvendes til COVID-19-undersøgelser52. Bredbåndsbiler, der kan dække spektrale vinduer så brede som 3.000 cm-1, kan belyse rige kemiske strukturer i biologiske prøver53. På grund af CCD'ens langsomme udlæsningshastighed er pixeldybningstiden imidlertid på niveauet af millisekunder, meget langsommere end mikrosekundpixlens opholdstid for SRS-mikroskopi34. Hyperspektral SRS-mikroskopi har i øjeblikket en typisk båndbredde på 200-300 cm-1, begrænset af laserbåndbredden og manglen på lock-in-integrerede array-detektorer34. Fouriertransformation SRS mikroskopi er en alternativ måde at potentielt udvide SRS spektral dækning35.

Selvom CARS og SRS giver rig kemisk information uden behov for mærkning, ligger den kemiske selektivitet i kemiske bindinger, hvilket gør det vanskeligt at skelne mellem specifikke proteiner. Raman-tags har vist potentialet til at forbedre den kemiske selektivitet af CARS og SRS54,55. Imidlertid har sammenhængende Raman-billeddannelse stadig meget lavere følsomhed sammenlignet med fluorescensdetektion. Overfladeforbedring blev brugt til spontan Raman-spredningsspektroskopi for at forbedre signalniveauerne56. Det blev også anvendt på CARS og SRS til signalforstærkning 57,58,59. Selvom forbedringsfaktoren ikke er så høj som spontan Raman-spredning, viser overfladeforstærkede CARS og SRS-mikroskopi stadig potentialet til at detektere enkeltmolekyler59,60. Ikke desto mindre fratager brugen af metalpartikler eller overflader fordelen ved den etiketfrie tilgang. Forbedring af følsomheden af sammenhængende Raman-mikroskopi uden brug af metaloverflader ville i høj grad udvide anvendelsen af teknologien i biologisk videnskab.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af Purdue University Department of Chemistry opstartsfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D galvo scanner set Thorlabs GVS002
Acousto-optic modulator Isomet M1205-P80L-0.5
AOM driver Isomet 532B-2
Data acquisition card National Instruments PCle 6363 Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage Zaber X-LSM050A
Deuterium oxide Millipore Sigma 151882-100G
Dichroic mirror for beam combination Thorlabs DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation Semrock FF776-Di01-25x36
DMSO MiliporeSigma 200-664-3
MIA PaCa 2 Cells ATCC CRL-1420
Femtosecond laser system Spectral Physics InSightX3+
Filter for CARS Chroma AT655/30m
Filter for SRS Chroma ET980sp
Function generator Rigol DG1022Z
Glass rods Lattice Electro Optics SF-57
Half-wave plate Newport 10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020 National Instruments This is the image acquisition software
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI
Microscope housing Olympus BX51W1
Objective lens Olympus UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b OriginLab Corporation This is the spectral fitting software
Oscilloscope Tektronix TBS2204B
Photodiode Hamamatsu S3994-01
PMT detector Hamamatsu H7422P-40
PMT voltage amplifier Advanced Research Instrument Corp. PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube Thorlabs PBS255
Terminal block National Instruments BNC-2110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raman, C. V. A change of wave-length in light scattering. Nature. 121 (3051), 619 (1928).
  2. Li, S., Li, Y., Yi, R., Liu, L., Qu, J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and its applications. Frontiers in Physics. 8, 515 (2020).
  3. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 883-909 (2008).
  4. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 507-530 (2011).
  5. Suhalim, J. L., Boik, J. C., Tromberg, B. J., Potma, E. O. The need for speed. Journal of Biophotonics. 5 (5-6), 387-395 (2012).
  6. Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Optics Letters. 7 (8), 350-352 (1982).
  7. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  8. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
  9. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: instrumentation, theory, and applications. The Journal of Physical Chemistry B. 108 (3), 827-840 (2004).
  10. Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807 (2005).
  11. Cheng, J. -X., Volkmer, A., Book, L. D., Xie, X. S. An epi-detected coherent anti-Stokes Raman scattering (E-CARS) microscope with high spectral resolution and high sensitivity. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (7), 1277-1280 (2001).
  12. Volkmer, A., Book, L. D., Xie, X. S. Time-resolved coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Imaging based on Raman free induction decay. Applied Physics Letters. 80 (9), 1505-1507 (2002).
  13. Marks, D. L., Boppart, S. A. Nonlinear interferometric vibrational imaging. Physical Review Letters. 92 (12), 123905 (2004).
  14. Ganikhanov, F., Evans, C. L., Saar, B. G., Xie, X. S. High-sensitivity vibrational imaging with frequency modulation coherent anti-Stokes Raman scattering (FM CARS) microscopy. Optics Letters. 31 (12), 1872-1874 (2006).
  15. Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241-243 (2006).
  16. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363-1365 (2009).
  17. Masia, F., Karuna, A., Borri, P., Langbein, W. Hyperspectral image analysis for CARS, SRS, and Raman data. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (8), 727-734 (2015).
  18. Knutsen, K. P., Johnson, J. C., Miller, A. E., Petersen, P. B., Saykally, R. J. High spectral resolution multiplex CARS spectroscopy using chirped pulses. Chemical Physics Letters. 387 (4-6), 436-441 (2004).
  19. Okuno, M., Kano, H., Leproux, P., Couderc, V., Hamaguchi, H. -o Ultrabroadband multiplex CARS microspectroscopy and imaging using a subnanosecond supercontinuum light source in the deep near infrared. Optics Letters. 33 (9), 923-925 (2008).
  20. Masia, F., Glen, A., Stephens, P., Borri, P., Langbein, W. Quantitative chemical imaging and unsupervised analysis using hyperspectral coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 85 (22), 10820-10828 (2013).
  21. Pegoraro, A. F., Slepkov, A. D., Ridsdale, A., Moffatt, D. J., Stolow, A. Hyperspectral multimodal CARS microscopy in the fingerprint region. Journal of Biophotonics. 7 (1-2), 49-58 (2014).
  22. Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
  23. Ploetz, E., Laimgruber, S., Berner, S., Zinth, W., Gilch, P. Femtosecond stimulated Raman microscopy. Applied Physics B. 87 (3), 389-393 (2007).
  24. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  25. Nandakumar, P., Kovalev, A., Volkmer, A. Vibrational imaging based on stimulated Raman scattering microscopy. New Journal of Physics. 11 (3), 033026 (2009).
  26. Slipchenko, M. N., Le, T. T., Chen, H., Cheng, J. -X. High-speed vibrational imaging and spectral analysis of lipid bodies by compound Raman microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 113 (21), 7681-7686 (2009).
  27. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62 (1), 507-530 (2011).
  28. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 415-445 (2015).
  29. Prince, R. C., Frontiera, R. R., Potma, E. O. Stimulated Raman scattering: from bulk to nano. Chemical Reviews. 117 (7), 5070-5094 (2017).
  30. Lu, F. -K., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Physics. 110 (15-16), 1927-1932 (2012).
  31. Ozeki, Y., et al. High-speed molecular spectral imaging of tissue with stimulated Raman scattering. Nature Photonics. 6 (12), 845-851 (2012).
  32. Wang, P., et al. Label-free quantitative imaging of cholesterol in intact tissues by hyperspectral stimulated raman scattering microscopy. Angewandte Chemie International Edition. 125 (49), 13280-13284 (2013).
  33. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  34. Liao, C. -S., et al. Microsecond scale vibrational spectroscopic imaging by multiplex stimulated Raman scattering microscopy. Light: Science & Applications. 4 (3), 265 (2015).
  35. Liao, C. -S., et al. Spectrometer-free vibrational imaging by retrieving stimulated Raman signal from highly scattered photons. Science Advances. 1 (9), 1500738 (2015).
  36. He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
  37. Andresen, E. R., Berto, P., Rigneault, H. Stimulated Raman scattering microscopy by spectral focusing and fiber-generated soliton as Stokes pulse. Optics Letters. 36 (13), 2387-2389 (2011).
  38. Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
  39. Zhang, C., Aldana-Mendoza, J. A. Coherent Raman scattering microscopy for chemical imaging of biological systems. Journal of Physics: Photonics. , (2021).
  40. Martens, W. N., Frost, R. L., Kristof, J., Theo Kloprogge, J. Raman spectroscopy of dimethyl sulphoxide and deuterated dimethyl sulphoxide at 298 and 77 k. Journal of Raman Spectroscopy. 33 (2), 84-91 (2002).
  41. Gill, G. W. Cytopreparation: Principles & Practice. Gill, G. W. , Springer. New York. 309-323 (2013).
  42. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  43. Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11226-11231 (2013).
  44. Lu, F. -K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Slipchenko, M. N., et al. Vibrational imaging of tablets by epi-detected stimulated Raman scattering microscopy. Analyst. 135 (10), 2613-2619 (2010).
  46. Slipchenko, M. N., Zhou, B., Pinal, R., Teresa Carvajal, M., Cheng, J. -X. RAMAN-chemical imaging of solid dosage forms based on stimulated Raman scattering. American Pharmaceutical Review. 15 (3), 66 (2012).
  47. Sarri, B., et al. Discriminating polymorph distributions in pharmaceutical tablets using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 50 (12), 1896-1904 (2019).
  48. Fussell, A. L., Kleinebudde, P., Herek, J., Strachan, C. J., Offerhaus, H. L. Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy visualizes pharmaceutical tablets during dissolution. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (89), e51847 (2014).
  49. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging). Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  50. Lim, R. S., et al. Multimodal CARS microscopy determination of the impact of diet on macrophage infiltration and lipid accumulation on plaque formation in ApoE-deficient mice [S]. Journal of Lipid Research. 51 (7), 1729-1737 (2010).
  51. Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  52. Tabish, T. A., Narayan, R. J., Edirisinghe, M. Rapid and label-free detection of COVID-19 using coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Mrs Communications. 10 (4), 566-572 (2020).
  53. Camp, C. H., et al. High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nature Photonics. 8 (8), 627-634 (2014).
  54. Wei, L., et al. Live-cell bioorthogonal chemical imaging: stimulated Raman scattering microscopy of vibrational probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
  55. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  56. Nie, S., Emory, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).
  57. Steuwe, C., Kaminski, C. F., Baumberg, J. J., Mahajan, S. Surface enhanced coherent anti-Stokes Raman scattering on nanostructured gold surfaces. Nano Letters. 11 (12), 5339-5343 (2011).
  58. Fast, A., Kenison, J. P., Syme, C. D., Potma, E. O. Surface-enhanced coherent anti-Stokes Raman imaging of lipids. Applied Optics. 55 (22), 5994-6000 (2016).
  59. Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  60. Yampolsky, S., et al. Seeing a single molecule vibrate through time-resolved coherent anti-Stokes Raman scattering. Nature Photonics. 8 (8), 650-656 (2014).

Tags

Kemi udgave 182
Direkte sammenligning af hyperspektral stimuleret Raman-spredning og sammenhængende anti-stokes Raman-spredningsmikroskopi til kemisk billeddannelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Clark, M. G., Brasseale III, K. A.,… More

Clark, M. G., Brasseale III, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging. J. Vis. Exp. (182), e63677, doi:10.3791/63677 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter